从培养细胞和小鼠组织中分离线粒体及其功能分析

摘要

比较样品间线粒体膜电位可提供有关细胞状态的重要信息。本文详细描述了分离线粒体以及利用荧光法检测其对抑制剂和解偶联剂反应的实验步骤。通过细胞培养和细胞应激动物模型的应用，展示了该实验方案的方法学特点及其应用价值。

摘要

为了确定细胞状态，有必要对两个或多个不同组别（如健康与疾病）进行比较。线粒体因其在细胞代谢、能量生成以及凋亡调控中的关键作用，处于细胞健康的核心地位。因此，直接评估分离得到的线粒体及其功能扰动情况，有助于判断是否存在细胞器特异性的功能异常。本实验方案中所述方法包括从HEK培养细胞以及小鼠肝脏和脊髓中分离完整且具有功能的线粒体，这些方法也可轻松适用于其他培养细胞或动物组织。通过TMRE检测线粒体功能，并结合使用常见的线粒体解偶联剂和抑制剂，配合荧光酶标仪进行分析，不仅使本方案具有良好的通用性并易于大多数研究实验室开展，还可实现高通量检测。

引言

活细胞以脂肪和碳水化合物的形式储存代谢能量，并利用这些能量进行生物合成、膜转运和运动。部分能量通过糖酵解过程中将饮食中的糖类直接转化为ATP而在细胞质中获得。然而，细胞中ATP生成的主要来源是在线粒体内通过线粒体呼吸链实现的¹。线粒体的结构为其高效、有效地生成ATP提供了必要的空间取向。线粒体具有双层膜结构，两层膜之间为膜间隙，与最内层的线粒体基质共同容纳了参与ATP生成的各种组分，并协调相关化学反应。内膜上含有多个膜结合蛋白复合物，构成呼吸链，同时还包含ATP合酶——这一蛋白复合物可将ADP和Pi结合生成ATP。内膜向内折叠形成嵴，电子通过细胞色素c（一种可溶性电子载体）在膜间隙中于各复合物之间传递，沿呼吸链逐级转移。随着电子的传递，还原当量被氧化，同时氢离子从基质被泵入膜间隙。由于膜间隙中离子浓度升高，形成跨线粒体内膜的电化学梯度，从而产生膜电位（∆ψ）²。氧气是电子传递链的最终电子受体，氢离子通过ATP合酶从膜间隙回流至基质，此过程直接驱动ATP的生成。上述整个过程被称为氧化磷酸化。嵴的折叠结构增加了内膜的表面积，使每个线粒体内部的电子传递和ATP生成达到最大化。参与氧化磷酸化的蛋白质、酶及其他分子由核基因和线粒体基因共同编码。线粒体含有自身的环状DNA，编码13种蛋白质以及ATP生成所必需的tRNA和mRNA³。然而，还需要更多的蛋白质，因此这些蛋白质由细胞核基因编码。大多数核编码的蛋白质通过前体蛋白N端的前序列被靶向输送至线粒体基质，其导入过程部分依赖于∆ψ^4,5。

线粒体不仅参与细胞的生物能量代谢，还影响三羧酸循环（TCA）和β-氧化等重要代谢过程，通过调节钙离子参与细胞信号传导，并在细胞凋亡中发挥关键作用⁶。具体而言，在细胞应激状态下，定位于线粒体外膜或与之相互作用的BCL-2家族蛋白可导致线粒体外膜通透性增加（MOMP）^7,8。在MOMP过程中，细胞色素c及其他蛋白被释放到细胞质中，并与多种胞质蛋白共同形成一种称为凋亡体（apoptosome）的复合物^9,10。凋亡体可激活caspase，进而在细胞凋亡的执行阶段切割细胞内的蛋白质和DNA。一旦发生MOMP，线粒体膜电位（∆Ψ）即崩溃，ATP合成停止。因此，随着凋亡的启动，线粒体功能受损，∆Ψ的变化可作为评估线粒体及细胞健康状况的指标¹²。尽管凋亡是许多疾病模型的终末事件，但线粒体功能及其∆Ψ的变化同样可为疾病的发生和/或进展提供重要信息。例如，在神经退行性疾病发展过程中，已观察到线粒体结构和功能的改变^13,14。

在本实验方案的第一部分，描述了保持其膜电位（ΔΨ）完整的线粒体的分离方法。将HEK-293T细胞暴露于不同浓度和组合的重组TNF-α、IL1-β和IFN-γ中，以诱导细胞凋亡。选择这些细胞因子是因为它们在原代人脓毒症样本中常被报道水平升高¹⁵，且TNF-α与其受体结合可触发细胞凋亡的外源性通路⁶。由于从原代组织中分离功能性线粒体的操作与培养细胞存在细微差异，且许多研究使用动物模型，因此本方案还描述了如何从前侧索硬化症（ALS）小鼠模型的肝脏和脊髓组织中分离线粒体。

本方案的第二部分旨在利用对电位敏感的荧光染料，通过荧光酶标仪监测线粒体膜电位的变化。通过定量检测分离线粒体在解偶联剂、呼吸链抑制剂、复合物抑制剂和离子载体作用下的ΔΨ强度，可区分细胞状态（即，健康与非健康状态）。线粒体越健康，使用线粒体抑制剂处理后其∆Ψ的变化幅度越大，因此线粒体的反应可作为线粒体（功能障碍）的指标。

使用分离的线粒体而非对功能进行原位评估，能够提供明确证据，表明某种病理状态或治疗手段可直接调控细胞器的变化^16-18。尽管文献中已有从培养细胞中分离线粒体的方法，但这些方法往往描述模糊¹⁷，和/或依赖专用设备¹⁶。本方案详细描述了线粒体分离方法，并可轻松适用于其他细胞系，包括原代组织及培养细胞^13,14,19,20。许多使用分离线粒体的研究采用了与本方案相同的线粒体解偶联剂和抑制剂，但使用的是克拉克电极（²¹为文献中众多论文的代表性示例），而该设备同样属于高度专业化的仪器。此外，这种传统方法存在通量低、操作复杂等局限性^22,23，且需要大量线粒体（约500 µg/反应）。在本方案中，采用荧光膜电位探针TMRE结合荧光酶标仪进行检测，后者是许多实验室中的常规设备。TMRE被广泛认可，因其可快速进入细胞和分离的线粒体，并可在低浓度下使用²⁴。利用本方案可快速并行设置多个反应，并进行批量分析。此外，该方法所需分离线粒体的用量显著减少（约10 µg/反应）。由于所需材料更少，可使用更小的组织或细胞培养样本作为线粒体分离的起始材料，可设置更多重复或反应，且可能留有足够材料用于其他分离线粒体实验，如ATP生成、耗氧量或蛋白导入检测等。

方案

所有动物实验均符合美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）指南，并经维克森林大学动物护理与使用委员会批准。SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] 小鼠模型的繁殖对购自杰克逊实验室（The Jackson Laboratory，缅因州巴港）。将非转基因野生型（WT）雌鼠与 SOD1G93A 雄鼠 [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] 杂交，以产生 SOD1G93A 小鼠及其非转基因野生型同窝对照，用于后续实验。

1. 研究模型

1. 细胞培养
   1. 在37 °C、5% CO₂条件下，使用含10%热灭活胎牛血清、1%青霉素-链霉素和1% L-谷氨酰胺的DMEM培养基培养人胚胎肾细胞（HEK-T293）。
   2. 在T75培养瓶中培养细胞，使其达到90%融合度。 
   3. 通过胰蛋白酶消化法进行细胞传代：加入0.25%胰蛋白酶-EDTA，在37 °C、5% CO₂条件下消化3–5分钟，随后加入等体积的完全培养基终止消化反应，并在4 °C下以700 × g离心5分钟。
   4. 吸除培养基，将细胞沉淀用新鲜培养基重悬。
   5. 在细胞因子处理前48小时，以每T75培养瓶7 × 10⁴个细胞的密度接种细胞。处理时细胞密度应约为70%。
   6. 24小时后进行血清饥饿处理：吸除培养基，更换为等体积无血清的DMEM培养基（无菌）。
   7. 用超纯水将TNF-α、IL1-β和IFN-γ从冻干粉配制成工作浓度分别为5 pg/µl、10 ng/µl和10 ng/µl的溶液，并加入至相应的孔或培养瓶中。
   8. 将溶解后的细胞因子直接加入相应培养瓶的细胞培养基中，对血清饥饿处理的细胞进行刺激。处理方式包括单独使用每种细胞因子、三种细胞因子混合物（记为“*3”）或无菌水作为对照（记为“0”）。
   9. 处理后的细胞在24、48或72小时后进行评估和收集。
2. 细胞活力评估
   1. 用1× PBS配制5 mg/ml的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）溶液。
   2. 对于12孔板，每孔加入100 µl MTT溶液，并轻轻混匀以确保均匀分布。
   3. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育15分钟至1小时，在显微镜下观察紫色沉淀的形成。若未见紫色，再次轻摇后每隔5分钟继续孵育直至出现紫色。具体孵育时间由各研究者自行确定。
   4. 使用多通道移液器向每孔加入700 µl MTT溶剂（含4 mM HCl和0.1% NP40的异丙醇溶液），室温下轻摇板子5–10分钟，直至细胞中所有紫色完全溶解。若紫色未完全溶出，可额外加入200 µl溶剂并继续轻摇。
   5. 用于分析时，从每孔取100 µl溶液转移至96孔板，在酶标仪上以570 nm为检测波长、630 nm为参比波长读取吸光度；也可使用595 nm作为检测波长，但须保证所有读数在相同设置下进行。
3. 肌萎缩侧索硬化（ALS）动物模型
   1. 所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院（NIH）的指导原则，并经维克森林大学动物护理与使用委员会批准。SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] 小鼠模型的繁殖对购自杰克逊实验室（Bar Harbor, ME）。将非转基因野生型（WT）雌鼠与SOD1G93A雄鼠 [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] 杂交，以获得用于实验的SOD1G93A转基因小鼠及其非转基因野生型同窝小鼠。
   2. 使用针对突变型SOD1²⁵的标准引物进行基因分型。

2. 线粒体的分离

注意：操作过程中需迅速进行，并始终将所有物品置于冰上。

1. 线粒体分离缓冲液（MIB）、脊髓分离缓冲液（SC MIB）和实验缓冲液（EB）的制备
   1. 提前配制好用于MIB和EB的以下储备溶液。
   2. 通过将12.1 g Tris碱溶解于70 ml H₂O中制备1 M Tris/MOPS₂O. 加入干燥的MOPS，调节pH至7.4。定容至100 ml。过滤除菌，4 °C保存。
   3. 通过将 80.2 ml 的 K 与相应溶剂混合制备 1 M Kphos₂HPO₄ 和 19.8 ml 的 KH₂PO₄室温保存。
   4. 将3.8 g EGTA加入10 ml H₂O中，配制0.2 M EGTA/Tris₂O. 加入 1 M Tris/MOPS 至溶解，约 30–40 ml。定容至 50 ml，经无菌滤膜过滤后室温保存。注意 pH 值约为 6.7。
   5. 配制1 M谷氨酸溶液：取10 ml谷氨酸溶液配制成1 M溶液，过滤除菌后于4 °C保存。
   6. 配制1 M苹果酸溶液：将10 ml的1 M苹果酸溶液加入Tris/MOPS至终浓度50 mM。过滤除菌后，于4 °C保存。
   7. 配制MIB溶液，其成分为200 mM蔗糖、10 mM Tris/MOPS（pH 7.4）和1 mM EGTA/Tris。过滤除菌后，4 °C保存。
   8. 配制SC MIB溶液，浓度为250 mM蔗糖、20 mM HEPES-KOH（pH 7.5）、10 mM KCl、1.5 mM MgCl₂₂1 mM EDTA、1 mM EGTA、1 mM DTT 和蛋白酶抑制剂混合物。
   9. 配制EB缓冲液，组成为125 mM KCl、10 mM Tris/MOPS（pH 7.4）、5 mM谷氨酸、2.5 mM苹果酸、1 mM K磷酸盐缓冲液，pH 7.4，含10 mM EGTA/Tris。过滤除菌后于4 °C保存。
2. 收获细胞前的设备准备
   1. 用无菌水将小型玻璃容器和匀浆杵各冲洗三次，然后置于冰上。
   2. 准备必要的物品，例如标准钻孔机、细胞刮刀、1.5 ml、15 ml 和 50 ml 离心管以及溶液。
3. 线粒体分离
   1. 培养细胞
      1. 每种样本类型使用两瓶 T175 培养瓶的细胞。
      2. 确保细胞融合度约为90%，用于对照实验，或按照上述步骤1.2所述进行铺板和处理。
      3. 在实验台面上，吸除培养基，再用 15 ml 1x PBS 对贴壁细胞洗涤两次，每次 15 ml。
      4. 吸出缓冲液，刮取培养瓶以使贴壁细胞从瓶底脱落。
      5. 向每个烧瓶中加入 15 ml 的 1x PBS，轻轻摇晃混匀，转移至各 15 ml 圆锥形离心管中，置于冰上。
      6. 刮取完成后，使用带有摆动桶转子的台式离心机，在 4 °C 条件下以 700 x g 离心 5 分钟。
      7. 吸弃上清液，将每份沉淀物重悬于1 ml MIB中。
      8. 将两种悬液合并后转移至小型玻璃容器中进行匀浆。
      9. 将MIB加入容器中，直至缓冲液达到第一条刻度线。使用连接在钻机上的研杵，以中等速度匀浆三次。此步骤中需确保容器置于冰上，研杵不得移出液面之上，并保持稳定速度进行连续操作。
      10. 将匀浆后的溶液转移至50 ml锥形离心管中。 
      11. 使用18号1½英寸针头将溶液吸入3 ml注射器中，再用27号½英寸针头将溶液回注至冰上的锥形管中。 注意将溶液推出至管内壁，利用该作用力破坏细胞膜。
      12. 重复注射器操作步骤，共进行五次。 
      13. 将溶液转移至15 ml锥形管中，在台式离心机中使用水平转子，于4 °C、600 x g条件下离心5 min。
      14. 小心吸除上清液，并分装至三个1.5 ml离心管中。
          注意：经过首次低速离心后，线粒体位于上清液中，而细胞膜和未破碎的细胞则沉淀于沉淀物中。
      15. 在4 °C条件下，以10,000 × g离心5分钟，使用固定角转子。
      16. 吸弃上清液，将沉淀物收集于100 µl MIB中，立即置于冰上。
          注意：经过高速离心后，线粒体位于沉淀中。线粒体在分离后通常可维持其膜电位约2-3小时，以MIB中的浓缩储存液形式最为稳定。
   2. 从小鼠组织中分离线粒体
      1. 根据IACUC方案对小鼠进行麻醉。设置挥发器浓度为5.0%以诱导麻醉。通过轻捏足部无反应或当棉签接近或轻触眼睛时无眨眼反射，确认动物已处于麻醉状态。在整个手术过程中，将挥发器浓度维持在1.5%至2.0%之间，以保持小鼠处于麻醉状态。
      2. 从每只动物中切除肝脏和脊髓，分别置于预冷的1x PBS -/- 中，以冲洗去除血液。
      3. 将肝脏组织转移至冰上的称重皿中，使用新的剃刀片冰上切碎1分钟。
      4. 将组织和适当的缓冲液（肝脏用 MIB，脊髓用 SC MIB）加入容器中，直至缓冲液达到第一条刻度线。用手动研杵进行五次研磨均质化。此步骤中需确保容器置于冰上，研杵不得移出液面，并以稳定速度连续操作。
      5. 将匀浆液转移至洁净的15 ml离心管中。
      6. 在4 °C、750 × g条件下，使用固定角转子离心管离心10分钟。
      7. 将上清液转移至干净的离心管中，并置于冰上。
         注意：经过首次低速离心后，线粒体位于上清液中，而细胞膜和未破碎的细胞则沉淀于沉淀物中。
      8. 将脊髓沉淀物重悬于 500 µl SC MIB 中。
      9. 每次用SC MIB填充容器至一半，将每份样品重新匀浆三次。
      10. 将新的匀浆转移至新的离心管中。
      11. 在4 °C条件下，使用固定角转子以750 × g离心10分钟。
      12. 将这些含有更多线粒体的新上清液与各样本的第一次上清液合并。
      13. 在4 °C、10,000 × g条件下，使用固定角转子离心管离心5分钟。
      14. 吸弃上清液，将肝组织沉淀重悬于500 µl MIB中，脊髓组织沉淀重悬于50 µl SC MIB中，并立即置于冰上。
          注意：经过高速离心后，线粒体位于沉淀中。线粒体通常在分离后可维持其膜电位约 2–3 小时，且在 MIB 中作为浓缩储存液时最为稳定。
      15. 使用商用蛋白质检测试剂盒或类似方法检测蛋白质浓度，以估算溶液中线粒体的浓度²⁶线粒体的典型浓度为：2个T175培养瓶可获得约2 mg/ml，1只小鼠肝脏可获得约3-5 mg/ml，1只小鼠脊髓可获得约1-3 mg/ml。
4. 细胞色素 c 使用 R 的检测&D 大鼠/小鼠细胞色素c Quantikine ELISA试剂盒（根据制造商提供的方案改编）
   1. 反应体系设置前立即用EB缓冲液将线粒体稀释至0.5 mg/ml的工作浓度，并将稀释后的线粒体分装至1.5 ml离心管中用于反应（通常每管30–50 μl）。
   2. 向稀释后的线粒体中加入终体积1%的EB或DMSO，在室温下孵育反应7-10分钟。若需要更长时间，反应在室温下可稳定维持长达30分钟。
   3. 在固定角转子中，于4 °C、10,000 x g离心5 min，沉淀线粒体，小心分离上清液，并分别置于不同的1.5 ml离心管中。
      注意：试管可于 -20 °C 冻存以备后续分析，或立即使用。
   4. 测定细胞色素的释放 c 通过比较细胞色素的浓度 c 在沉淀和上清液中²⁷.
      1. 通过在原始反应体积的1×PBS中加入0.5% Tx-100溶解沉淀物来制备样品。
      2. 为每个样本在ELISA板上准备2个孔，分别用于加入100 μl细胞色素后溶解的沉淀物以及反应后的上清液 c 结合物（直接使用原瓶装）加100 μl含0.5% Tx-100的1x PBS，然后加入全部沉淀或上清液样品。
      3. 轻轻涡旋混匀，设置为低速（2-4档），持续20秒，盖好后于37 °C孵育1小时。
      4. 接下来，用按照制造商说明稀释的洗涤缓冲液洗涤平板4次。将孔板在纸巾上轻拍，去除多余的液体。
      5. 接着，向每孔加入150 μl 1:1的A+B显色液，在室温避光条件下孵育20-30分钟。
      6. 最后，向每孔加入50 μl终止液，并使用酶标仪在540 nm处测定吸光度。计算细胞色素的含量 c 通过比较细胞色素的释放量 c 在每个反应中，沉淀与上清液中的情况。

3. 线粒体（功能障碍）功能的评估

1. 反应体系设置前，立即将线粒体用EB缓冲液稀释至0.5 mg/ml的工作浓度，并分装至1.5 ml离心管中用于反应（每管通常使用30–50 μl线粒体）。
2. 线粒体治疗
   1. 加入相应的处理物（EB对照、1 μM FCCP与50 nM缬氨霉素混合液、10 μM鱼藤酮、5 μM寡霉素、2 mM KCN或200 μM ADP，终浓度），分别加入至不同的反应体系中，体积比为1/10^th 稀释后线粒体的总体积。将反应液在室温下孵育7分钟。
      注意：操作这些物质时应谨慎，因为意外摄入或经皮肤吸收可能有害。
   2. 将TMRE用无菌水稀释至工作浓度100 μM，于-20 °C保存，使用时稀释至2 μM，并加入与线粒体反应体系等体积的该溶液。
   3. 将反应在室温下孵育 7 分钟。
   4. 在4 °C条件下，使用固定角转子以10,000 × g离心5 min，沉淀线粒体。
   5. 将每个样本上清液的一半体积加入396孔板中，并检测荧光。
      注意：TMRE 的激发和发射波长应根据所用检测板的类型和体积，参照制造商说明书进行优化。使用标准的 384 孔黑色板，加入 25 µl 1 µM TMRE（终反应浓度）时，通过激发/发射波长组合获得最强信号 波长 485 nm/535 nm
   6. 通过将实验样本在酶标仪上测得的相对荧光值（RFU）除以对照样本的RFU，计算对照（EB）与各处理组之间的荧光倍数差异。

结果

用 200 pg/ml TNF-α、40 ng/ml IL1-β 和 75 ng/ml IFN-γ（*3）处理 HEK-293T 细胞 24–48 小时，可导致细胞死亡程度逐渐增加（图 1A）。通过 MTT 法检测细胞活力，结果一致显示，处理 24 小时后细胞活力下降约 10%，处理 48 小时后下降约 20%。使用相似浓度（100 pg/ml TNF-α、40 ng/ml IL1-β 和 75 ng/ml IFN-γ）处理细胞 48 小时也得到类似的细胞死亡结果，而单独使用各细胞因子处理则表明活力下降是由多种细胞因子联合作用所致（图 1B）。图 1B 中的活力数据代表三次独立实验（每组实验设三个重复）的平均值 ± 标准差，误差线紧密程度表明数据具有良好的可重复性。在本处理方案中，可调整细胞因子的用量以进一步明确每种细胞因子对细胞死亡的贡献，也可加入其他细胞因子或因素，前提是设置适当的对照组。

自20世纪40年代以来，文献中已有从细胞和组织中分离线粒体的描述^28,29

讨论

使用重组细胞因子处理HEK-293T细胞，在48小时后可引起中等程度的细胞死亡（图1）。经TNF-α处理所诱导的细胞死亡程度与先前报道的研究结果相似³⁰，而联合给予多种细胞因子后细胞活力的下降程度大于单用任一细胞因子时的叠加效应，这也与文献报道一致^31,32。该细胞培养模型允许灵活调整细胞因子的种类和剂量，并可将细胞因子组合与单个因子进行比较，因而适用于研究细胞因子暴露对肾细胞产生的特异性影响。此外，实验结果具有高度可重复性且易于实现（图2）。需注意的因素包括细胞的融合度。例如，在100%融合度下处理的细胞，相较于在70–80%融合度下处理的细胞，对相同浓度细胞因子的反应较弱。此外，应记录细胞传代次数，因为细胞在培养中存留时间过长（自复苏后超过8–12周）可能会影响其反应性。尽管用细胞因子处理培养细胞会导致细胞活力下降及线粒体功能受损，但该模型本身并非脓毒症的完整模拟。然而，采用更具临床相关性的模型，例如使用从小鼠分离的原代肾细胞，或采用经刺激的THP1细胞自然分泌的细胞因子进行处理³³，是本研究工作的自...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
L-谷氨酸	Sigma	G1251	可使用钾盐替代。
苹果酸	Sigma	M8304	可使用钾盐替代。
KH2PO4	Sigma	P0662
K2HPO4	Sigma	P3786
EGTA	Sigma	E3889
Trisma 碱基	Sigma	T6066
MOPS	Sigma	M3183
CCCP	Sigma	C2920	用乙醇稀释至 100 μM 作为工作液，-20 °C 保存。
缬氨霉素	Sigma	V0627	用 DMSO 配制，使用浓度为 5 μM 的工作液，-20 °C 保存。
蔗糖	Fisher	S5-500
KCN	Mallinckrodt	6379	用乙醇配制高浓度储备液，然后用水稀释
鱼藤酮	Sigma	R8875	剧毒，用乙醇配制。
寡霉素	Sigma	O4876	剧毒，用乙醇配制。
ADP	Sigma	A2754
TMRE	Sigma	8717-25mg	使用前立即用 EB 稀释 100 μM 储备液。
DMEM	Gibco	11965-084	1× 常规（高葡萄糖）。
青霉素-链霉素	Invitrogen	15140-155
L-谷氨酰胺	Fisher	SH3002101	分装后于 -20 °C 保存
FBS	Lonza	14-501F	美国来源，优质。热灭活后分装，-20 °C 保存。
胰蛋白酶-EDTA	Sigma	T4049
DMSO	SIgma	D2650
蛋白检测试剂（5×）	Bio-Rad	500-0006	可使用任何蛋白检测试剂替代。
BSA	Fisher	BP1600-100	用纯水配制 2 mg/ml 储备液用于蛋白检测。
MTT 粉末	Sigma	M2128	用 PBS 配制 5 mg/ml 储备液，过滤除菌。分装后 -20 °C 保存；4 °C 可保存一周。
Tergitol 溶液（NP-40）	Sigma	NP40S
重组人 IL-1β	Gibco	PCH08014	开启后分装，-20 °C 保存
重组人 TNF-α	Gibco	PHC3015L
重组人 IFN-γ	Gibco	PHC4031
Dulbecco 磷酸盐缓冲液（-/-）	Sigma	D8537	确保不含 Mg2+ 和 Ca2+ 离子。
细胞色素 c ELISA 试剂盒	R&D systems	DTC0	适用于 HEK-293T 细胞的人源试剂。