生理记录与黄热病蚊子Aedes aegypti味觉附器的RNA测序

摘要

通过两种方法估算埃及伊蚊（Aedes aegypti）主要味觉附器中的基因表达，我们鉴定出一组可能介导神经元对苦味和厌恶性化合物产生电生理反应的基因。

摘要

对蚊虫感觉神经元动作电位进行电生理记录，可使研究人员深入了解这些疾病传播媒介的化学感知机制。我们最近通过直接的电生理研究，在雌性埃及伊蚊（Aedes aegypti）的喙器下唇中鉴定出一种苦味感知神经元，该神经元可对避蚊胺（DEET）和其他驱避剂以及苦味物质奎宁产生反应。这些味觉受体神经元的响应促使我们对雄性和雌性下唇及跗节样本的总mRNA进行测序，以阐明在这些接触性化学感受组织中表达的潜在化学感受基因。跗节样本按前、中、后胸分为三种亚型，每种性别均进行区分。随后，我们通过对相同组织样本进行qRT-PCR验证了测序数据集，并采用统计学方法比较两种技术的结果。现在，针对分子功能的研究可靶向特定基因，以确定蚊虫感知驱避剂所涉及的基因。这些受体通路可用于筛选新型驱避剂，干扰蚊虫寻找宿主的行为，从而遏制有害病毒的传播。

引言

DEET、派卡瑞丁、香茅醛和IR3535等化合物已被证明能有效驱避蚊虫，包括重要的疾病传播媒介Aedes aegypti^1,2。我们记录与特定味觉感器相关的感觉神经元的动作电位，以确定参与蚊虫驱避反应的细胞。结合对这些组织中表达基因的下游测序，可鉴定最有可能介导这些细胞反应的基因，从而用于筛选具有更强驱避效果的新化合物。

RNA-seq 是一种强大的工具，正迅速成为追踪基因表达时空变化的标准方法。通过对昆虫化学感受附肢和器官进行 RNA-seq 分析，已在多个昆虫物种中鉴定出分子受体^3-5，显著优于传统的基于 PCR 的逐个基因筛选方法⁶。昆虫是动物界中多样性最高的类群，为研究基因与独特表型之间的关联提供了大量机会。RNA-seq 技术可应用于任何活体昆虫组织。同样，对单孔味觉感器内感觉细胞的电生理记录也可在多种不同昆虫物种中实现。结合这两种技术，研究人员能够缩小与观察到的化学感受表型相关的基因范围。不同物种会带来特定的技术挑战，但也可能揭示化学感受受体基因与化学感受适应之间的关联。化学感受感器的大小和形态各异，在记录动作电位时可能需要大量调试，以降低噪声并识别可重复的信号。化学感受器官的解剖操作可能简单易行，也可能精细且耗时，具体取决于昆虫的形态和大小。高质量 RNA 的提取同样可能需要一定的优化，例如在组织采集过程中避免某些色素的干扰。

尽管通过行为实验来验证驱避化合物的效果具有直接且信息丰富，但该方法耗时较长，且在作用机制方面较为宽泛。结合RNA测序的电生理学技术可更精确地分析驱动昆虫回避行为的内在机制。一旦在某种昆虫中鉴定出化学识别相关的“工具包”，就有可能更有针对性地改进已知的驱避剂。负责这些行为的感觉细胞中的受体及相关蛋白可进行异源表达，从而实现对化合物的直接筛选。此外，分子模拟可预测哪些化学物质能够引发这些受体的强烈反应⁷。

一组狭窄化学感受组织中所有活性基因的表达谱，也可能有助于识别其他物种中的类似基因。通过序列同源性及表达模式的相似性，研究人员可以筛选出最有可能介导昆虫对广谱驱避剂产生反应的分子受体集合。本文提出以下实验方案，以帮助研究人员解析昆虫化学感受通路，并鼓励更多学者深入探究非模式生物及具有重要经济意义昆虫的神经行为学机制。

方案

1. 饲养 埃及伊蚊 成虫

1. 将卵置于浅盘中约¾英寸深的水中孵化。过度拥挤会降低成虫体型。
2. 在25 °C（12小时光照：12小时黑暗）条件下饲养幼虫，并投喂磨碎的鱼食。
   注意：过度投喂可能降低存活率。
3. 每天用巴斯德吸管单独取出蛹，转移至塑料培养皿（9 cm × 5.5 cm）中，放入带有细密网盖的小型 containment 桶内，从而建立24小时 龄期分组。
4. 在环境培养箱中，于27 °C、70%相对湿度及与幼虫相同的光周期条件下，通过放置在蚊子饲养笼网壁上的棉球提供10%蔗糖溶液喂养成蚊。
5. 进行电生理实验时，使用5–10日龄的个体。通常情况下，体型较大的个体可获得更佳实验结果。提取RNA时，应使用处于5–10日龄范围内、且属于同一24小时 龄期分组的个体。

2. 化学试剂的准备

1. 确定合适的电解质浓度（例如 1–10 mM）可引发所选感觉神经元的最低程度活性。实验开始时，可使用 10 mM NaCl 或 1 mM KCl 作为电解质来检测基础活性。
2. 将每种实验用化学物质溶解于适当的溶剂中（若非水溶剂，则使用乙醇或DMSO），该溶剂与仅含电解质的对照组相比，对尖峰放电活动应无显著影响。10%乙醇或1% DMSO的终浓度可作为合理的起始浓度。
3. 选择合适的（例如 奎宁（苦味）或蔗糖（甜味）等化学物质，是昆虫取食行为中已有充分描述的拒食剂或刺激剂对照物。

3. 电生理学（尖端记录⁸；图1）

1. 通过机械拉制玻璃毛细管制作玻璃电极。优化加热和拉制参数，使玻璃拉制成形状合适的记录电极。在解剖显微镜下使用镊子小心折断玻璃电极末端，形成足够大以包覆目标感器但又足够小以避免接触邻近结构的电极尖端开口。
2. 在显微镜下根据形态和位置视觉识别目标感器/感器，以确保尖端记录的可重复性。准备动物样本，使其感器可从电极进入角度自由接触。
3. 将成虫昆虫置于-20 °C冰箱中进行低温麻醉。避免因低温暴露时间过长而损伤外周神经元。用刀片在玻璃载片上切割窄条状透明胶带。使用窄条胶带将整只昆虫固定在玻璃载片上。
4. 将一根化学 sharpened 的钨丝插入昆虫背部胸部或眼部，作为无关（接地）电极。
5. 用感兴趣的刺激溶液填充第3.1步制备的玻璃电极。通过插入的注射器，从拉细的一端向钝端充满毛细管。将拉细端朝下轻弹以排除所有气泡。将一根银丝（氯化处理可选）插入第3.1步制备的玻璃电极中，作为记录和刺激电极。
6. 将电极连接至专为昆虫接触化学感受感器记录设计的前置放大器。该前置放大器（300 Hz–3 kHz带通滤波器）可缩短稳定时间，尽可能接近刺激施加时刻捕捉神经元活动。使用配备锋电位记录软件的微型计算机采集、存储和分析电信号。
   注意：正确接地记录装置可显著提高信噪比。
7. 用对照溶液（仅电解质）刺激感器，以确认其功能正常。对所有样本，从刺激伪迹后200毫秒开始计数锋电位。
8. 除剂量–反应研究外，所有实验中测试化学品的施加顺序应随机化，以消除偏差。对于剂量–反应研究，按递增浓度顺序施加实验化学品。每次刺激之间至少间隔3分钟 ，以确保充分恢复。
   注意：此间隔时间可能因昆虫种类和感器类型而异。阈值定义为该浓度下标准误不与最低测试浓度的标准误重叠。

4. RNA 提取与测序（图2）

1. 在组织破碎前，将紧密适配的无RNA酶研杵置于干冰上冷却。准备配套的、可紧密适配 snap cap 管的无RNA酶研杵。除非正在进行解剖操作，否则保持收集管关闭，以避免过度冷凝。
2. 使用过滤的吸液器，将30至40只经冷麻醉的蚊子（15秒 在 -20 °C 冰箱中冷冻后，于低温载物台上按性别分选。将动物背侧朝下放置，捏住翅膀以避免损伤味觉附器。
3. 使用两把精细镊子，在解剖显微镜下分离雄性或雌性的成对唇瓣或跗节，并尽量减少邻近组织的混入。
   注意：500对唇瓣可获得约800-1,000纳克总mRNA。400个单独的跗节（每个5个节段）可获得1,200-1,800纳克总mRNA。
4. 用一对持针钳轻轻夹住蚊子喙部近唇瓣处，暴露内部的口针。用另一对采集钳移除唇瓣，并将组织置于冰冷采集管的侧壁。
5. 用一对镊子轻轻夹住蚊子腿部胫节与第一跗节的连接处，用另一对镊子去除跗节，并将组织置于冰冷收集管的侧壁。
   注意：需考虑目标组织与非目标组织交界处的细胞类型。在尽量减少邻近组织混入的同时，也必须避免遗漏目标组织部分。最终样本应准确代表整个目标器官。使用持针钳精确划定边界，以便采集钳能够通过刮取或抓取方式精准分离出仅所需的目标组织。
6. 定期在0 °C下以9,000 x g离心收集管片刻 将组织保持在管底。若在解剖过程中收集管内出现水分积聚，加入50 μL冷的Trizol试剂以完全覆盖收集的组织。
7. 使用防污实验室记号笔，在一个无RNase的1.5 ml离心管上清晰标记 为每种组织类型准备一个带盖离心管用于收集。使用 1.5 ml 将组织置于试管架和液氮中，冷冻后研磨成细粉（若使用Trizol，则研磨成细小碎片）。重复一次。用Trizol定容至1 ml 通过涡旋振荡重悬研磨后的组织。
8. 加入 200 ul 加入氯仿并充分混匀。5分钟后 室温下，在4 °C、11,000 × g条件下离心 15分钟。小心地将水相层直接加入基因组DNA过滤柱中，在11,000 × g离心。 孵育5分钟。向流出液中加入等体积无RNase的70%乙醇，用移液器混匀。将液体转移至RNA收集柱中，并按照所提供的说明书继续进行RNA提取。
9. 使用精密分光光度计定量并评估总RNA的纯度，随后采用任何标准RNA测序方法进行后续分析。

5. RNA测序的定量RT-PCR验证（图3）

1. 选择尽可能多的基因，以在预测的序列丰度和假定的化学感受基因功能方面，比较其在动态范围内的相对基因表达水平。
2. 为每个目标基因设计引物对，以扩增出特定的100–180碱基对的PCR产物。通过确保每对引物中至少有一个跨越内含子边界，以排除非特异性的基因组DNA扩增。或者，可采用DNase处理以减少基因组污染。
3. 按照前文所述方法收集昆虫组织。计算完成所有qRT-PCR反应所需的RNA量，以确定所需组织量。
   注意：生物学重复和实验技术重复均设置三个重复，可使结果具有最高可信度。
4. 对每个目标基因，按公式 X_target^{-(Ct[target]–Ct[reference])} 计算相对基因定量，并对生物学和实验技术重复样本分别取平均值。使用看家基因（housekeeping gene）对不同生物学重复间的Ct值进行标准化，并作为Y轴相对表达量比较的基准。
5. 采用基于回归的自举等效性检验方法⁹，对每种组织的数据进行迭代分析，以评估RNA-seq与qRT-PCR数据集之间的相似性。
   注意：该方法可确定围绕观测到的RNA-seq和qRT-PCR数据所能构建的最小“相似性区域”，从而在统计学上判断qRT-PCR测定的相对基因表达水平与RNA-seq测定结果具有等效性。

结果

Ae. aegypti 味觉感受器的动作电位轨迹记录（图1）展示了使用多种化学物质直接刺激的有效性。该技术可通过在合理的时间范围内（通常小于500 ms）统计特定幅度和持续时间的动作电位峰数量，来量化对任何刺激性化学物质的反应。在特定实验条件下，轨迹记录必须能够稳定重复。否则，所观察到的生理反应可能仅代表测试物种个体中不常见的表型。

原始RNA测序数据在呈现为取整的RPKM值（每千碱基转录本每百万比对读段数）或FPKM值（每千碱基转录本每百万比对读段片段数）之前，需要进行过滤和精确比对（图2）。这两种RNA测序标准化方法之间的区别已在两篇开创性研究中有所描述^10,11。总mRNA测序的一个优势在于能够同时检测大型基因家族的表达。同时可视化多个基因的表达情况，有助于深入理解特定组织所具备的分子工具集。不同性别、发育阶段或组织类型之间的比较可快速完成。

RNA-seq 数据集的生物学重复可能受限于成本或组织采集的难度。qRT...

讨论

从味觉感受器记录动作电位最具挑战性的方面在于判断哪些反应属于“正常”反应。当首次对某种特定昆虫物种采用单个味觉感受器尖端记录技术时，其味觉受体神经元（GRN）的总数和敏感性通常未知。需要先进行大量初步记录，以确定待测化学物质的种类范围和浓度。在此实例中，我们首先观察到单个GRN对低浓度的避蚊胺（DEET）产生反应（图1）。随后，我们检测了同一感受器对已知对其他昆虫具有苦味或厌恶效应的一系列浓度化学物质的反应，并观察到相似的动作电位波形和振幅（图1）。这些观察结果提示，某一特定GRN亚型对这些令人厌恶的化合物产生反应。作为对照，我们测试了已知可刺激蚊虫摄食行为的糖类化合物，以观察是否出现类似的动作电位。结果发现，此时产生的动作电位形态不同且幅度更大。类似地，在盐刺激下我们观察到第三种幅度介于前两者之间的动作电位，由此将GRN亚型总数确定为三种。

昆虫的电生理记录制备 inherently 具有变异性。目标味觉感受器通常非常微小，必须将其调整至适当角度，以便用记录电极进行接触，同时避免玻璃电极触碰到角质层。为了与味觉神...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
玻璃毛细管	A-M Systems	628000	标准型，1.5 mm × 0.86 mm，4"
银丝	A-M Systems	7875	.015" 裸线
钨丝	Alfa Products	369	直径 0.127 mm
精细镊子	Fine Science Tools	11252	#5SF Inox
制冷载物台	BioQuip Products	1429	Chill Table
前置放大器	Syntech	Taste Probe	电生理前置放大器
电生理学软件	Syntech	Autospike	电生理学分析软件
TetraMin 鱼饲料	Tetra	Tropical fish food granules	将鱼饲料研磨成细粉
TRIzol	Life Technologies	15596-026	RNA 提取试剂
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74136	包含 gDNA 消除剂和 RNeasy 离心柱
Nanodrop 分光光度计	Nano Drop Products	ND-1000	台式分光光度计
R 统计软件	免费软件（由 Robert Gentleman 和 Ross Ihaka 开发）	www.r-project.org	在 R 计算环境中使用 stats 软件包的 lm 函数和 equivalence 软件包的 equiv.boot 函数。
1.5 ml 离心管架	Evergreen	240-6388-030	将液氮倒入几个空孔中，用于冷冻和研磨组织。
带研杵的 1.5 ml 收集管	Grainger	6HAX6	无 RNase
离心机	Thermo Scientific	11178160	离心冷冻组织，使其保持在 1.5 ml 管底部。
Primer-BLAST 引物设计工具	NCBI	n/a