需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

利用降低液滴-表面相互作用优化数字微流控中生物分析物的传输

7.5K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/52091

⸱

2014年11月10日

 ,  ,  , 
1Department of Mathematics, Physics and Statistics, University of the Sciences

本文内容

摘要

介绍了电场诱导去润湿装置（Field-DW）的制备与操作方案，以及电场对液滴内含物影响的初步研究。

摘要

数字微流控（DMF）是一种操控液滴的技术，为“芯片实验室”平台的开发提供了极具前景的替代方案。通常，液滴的运动依赖于表面的润湿性，而这与外加电场直接相关；然而，表面相互作用使得液滴运动受其内容物的影响，从而限制了该技术的应用范围。

已提出一些替代方案以尽量减少这种依赖性。然而，这些方案依赖于向液滴或其周围环境添加额外的化学物质，这可能会与液滴中的组分发生相互作用。针对这一挑战，我们课题组近期开发了场驱动-数字微流控（Field-DW）装置，可在无需额外添加剂的情况下实现细胞和蛋白质在数字微流控（DMF）系统中的运输。

本文提供了器件制备与操作的实验方案，包括用于运动控制的电子接口。我们还进一步利用这些器件开展研究，结果表明，多细胞、相对较大的模式生物也可被运输，且在器件运行所需电场作用下可能基本不受影响。

引言

液体操作设备的小型化对于“芯片实验室”平台的发展至关重要。在这方面，过去二十年间微流控领域取得了显著进展，并展现出多种应用前景1-5。与在封闭通道中输送液体的通道微流控技术不同，数字微流控（DMF）通过电极阵列对液滴进行操控。该技术最具吸引力的优点之一在于无需可移动部件来输送液体，且只需关闭电信号即可瞬间停止液滴运动。

然而，液滴的运动依赖于其内容物，这对于通用的“芯片实验室”平台而言无疑是一种不理想的特性。含有蛋白质及其他分析物的液滴会粘附在装置表面，导致无法移动。可以说，这一直是限制数字微流控（DMF）应用范围扩展的主要障碍；6-8 为减轻这种非期望的表面污染，现有替代策略通常需要向液滴或其周围环境添加额外的化学物质，而这可能会影响液滴的内容成分。

此前，我们的研究团队开发了一种装置，可在数字微流控（DMF）中实现细胞和蛋白质的传输，且无需额外添加剂（即Field-DW装置）9。该装置通过结合基于蜡烛烟灰的表面10与一种有利于液滴滚动的器件结构，使液滴受到向上的力，从而进一步降低液滴与表面之间的相互作用。在此方法中，液滴的运动与表面润湿性无关11。

以下详述方法的目标是制备一种数字微流控（DMF）装置，该装置能够在无需额外添加剂的情况下，运输含有蛋白质、细胞以及完整生物体的液滴。场致-去润湿（Field-DW）装置为实现几乎不受液滴化学性质影响的全可控平台铺平了道路。

本文还展示了模拟结果，表明尽管器件工作需要较高的电压，但液滴上的电压降仅占所加电压的一小部分，说明对液滴内生物分析物的影响可忽略不计。事实上，利用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）——一种广泛用于生物学多种研究的线虫——进行的初步测试显示，在施加电压时，线虫仍能不受干扰地游动。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

注意：在下述实验操作中，必须始终遵守实验室安全准则。尤其重要的是处理高电压（> 500 V）和化学品时的安全防护。

1. 用蜡烛烟灰涂覆导电基底

  1. 将铜金属切割成矩形（75 × 43 毫米，厚 0.5 毫米）。将每块铜基底浸入铜蚀刻剂中约 30 秒进行清洗，然后用自来水冲洗约 20 秒，并用纸巾擦干。
    注意：如果采用下文的方法 1，请将尺寸改为 75 × 25 毫米，以适配仪器。
  2. 将点燃的石蜡蜡烛在铜基底下方缓慢移动 30–45 秒，使其表面覆盖一层大致均匀的烟灰涂层（厚度约 40 µm）。保持基底位于火焰内部约 1 厘米处。切勿触碰脆弱的烟灰表面。

2. 通过涂层保护烟灰层

注意：碳黑层非常脆弱，必须进行包埋以提供保护。此处提供了两种简单的替代方法（如下方法1和方法2），但目前更可靠的方案正在开发中。

  1. 方法1
    1. 将样品装入金属蒸发仪或溅射系统中。按照系统的操作规程，对腔室抽真空，并开始在烟灰层上进行可控的金沉积（150–200 nm）。让装置冷却至室温。
    2. 在通风橱内，将金属化基底浸入1-十二烷硫醇溶液（1% v/v，溶于95%乙醇，ACS/USP级）中，浸泡10分钟。然后将装置倾斜至接近60°的角度，仅用数滴乙醇轻轻冲洗表面。让装置在室温下过夜干燥。
  2. 方法2
    1. 在通风橱内，于基底涂覆烟灰后立即操作，此时基底仍残留蜡烛火焰的余热，将数滴氟化液体滴加到基底的一侧，并将基底倾斜至接近90°的角度。继续滴加更多液滴，使其滚过整个烟灰表面。
      注意：当液滴落在某处时，该区域的烟灰将被冲走。应尽量使氟化液体的液滴充分铺展。
    2. 在通风橱内，将基底置于加热板上烘烤（160 °C，15分钟）。
    3. 使用前让基底在室温下静置过夜。可长期保存。

3. 顶电极的制备（改编自 Abdelgawad 等人et al.12）

  1. 使用图形设计软件绘制电极。每个电极长 2 mm，宽 0.3 mm，电极之间的间隙为 0.3 mm。电极与连接点（用于插入连接器，见下文）之间的间距为 2.3 mm（图 1）。
  2. 将一块柔性铜箔（厚度 35 µm）裁剪成君主格式（3.87 x 7.5 英寸）。若打印机兼容，也可使用其他尺寸。将铜箔装入彩色打印机的手动进纸托盘。
  3. 在铜箔上打印时，务必使用“深黑色”或“套准黑色”（详见 Abdelgawad 等12），以在铜基底上形成更致密的黑色墨层，从而在蚀刻过程中保护所打印的图案。让打印后的基底完全干燥，过夜。
  4. 在化学通风橱内，将盛有 50 ml 铜蚀刻液的烧杯加热至 40 °C。将打印好的铜箔浸入烧杯中，轻轻摇晃约 10 分钟。蚀刻时间取决于所用铜蚀刻液的种类。每隔几分钟检查一次腐蚀情况，确认图案是否完整。
  5. 用清水小心冲洗铜箔，然后在化学通风橱内用丙酮和乙醇去除墨层。再次冲洗，并用纸巾轻轻擦干铜箔。
  6. 使用双面胶带将带有电极的铜箔小心地粘贴到载玻片（75 x 25 mm，厚度约 1 mm）上。避免产生气泡。
  7. 使用胶带将一层聚全氟烷氧基（PFA）薄膜固定在电极上。此举可防止液滴意外接触电极，避免因短路而损坏上层电极。

4. 电子接口（图2中的电路）

  1. 将继电器和电容器 C 焊接到通用电路板上。
  2. 在无焊面包板上组装其余的10个继电器驱动器，用于电子电路。
  3. 将每个继电器驱动器的输入端连接到控制板的一个通道。
  4. 小心地将顶部电极插入连接器中（图3将每个继电器驱动器的输出端连接至顶部电极，如图所示。注意，在来自继电器的一对导线之间有一个接地的连接器触点，以尽量减少电噪声。
    注意：连接器置于可调平台上，用于控制顶部与底部（涂有烟灰的）基底之间的距离（0.1–0.5 mm）。
  5. 使用程序控制向4个电极同时施加高压（HV）的时序（约0.8秒），并沿运动方向依次移动1个电极即， 持续0.8秒，启动1234；然后启动2345、3456 等等。，每组0.8秒，然后反向移动，使液滴也向相反方向运动。

5. 液滴的可视化与操作

  1. 为了记录液滴运动，使用可视化系统，该系统由24倍至96倍放大组件与CCD相机组合而成。通过S端子视频线将录像机连接至相机。
  2. 用移液器将含有在培养基中的 C. elegans 的4 µl液滴置于烟灰涂层基底的底部。
  3. 将顶部电极移至液滴上方约0.3 mm处。液滴应靠近中心位置，位于第五个电极正下方，以便于操作。
  4. 打开电子接口并施加高压（500 VRMS），调节顶部电极与液滴之间的距离，直至液滴开始移动。切勿使顶部电极接触液滴。
  5. 通过记录设备上对电脉冲响应的液滴成功转移次数来收集数据。一次成功的实验表现为至少完成700次液滴转移，即每次电脉冲后均发生一次转移。
  6. 持续收集数据，直至液滴在连续5到10次脉冲刺激下不再发生移动。
    注意：当表面开始退化时，可通过将顶部电极更靠近液滴来恢复液滴运动。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

此前，我们已使用场驱动数字微流控（Field-DW）装置实现蛋白质在数字微流控（DMF）中的运动。特别是，含有牛血清白蛋白（BSA）的液滴可在比其他研究者此前报道的浓度高出2000倍的条件下移动（无需添加任何助剂）。这得益于液滴与表面之间相互作用的减弱；图4展示了一个含有荧光标记BSA的液滴（有关实验的更多细节，请参见Freire 等9）。最左侧的图片显示液滴静置于烟灰涂层表面；中间的图片展示了电场的作用，该电场除了引起液滴滚动外，还会对液滴施加向上的力，进一步降低其与表面的相互作用。请注意右侧与DMF中常用的另一种替代方案的明显对比：该方案仅使用氟化液体涂层（不含蜡烛烟灰）；由于与表面存在较强的相互作用，接触角较低，常常阻碍液滴的运动。

此处，我们使用该实验装置（图3）继续对这些设备进行测试，现运输含有较大生物体的液滴，即线虫C. elegans，这是一种广泛用于多种生物学检测的线虫。

在涂有炭黑的基...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

该方案中最关键的步骤是保护烟灰层，这直接关系到液滴移动的成功率。对烟灰层进行金属化处理（如上文方法1）可实现接近100%的制备成功率。然而，其最长操作时间约为10分钟；可能的原因是液滴组分通过金属层中的孔隙润湿了烟灰层。使用氟化液体涂覆烟灰层是最简单、最快捷的替代方法，且所需资源最少，但仅有40–50%的制备基底有效（最长20分钟），且涂层不均匀。事实上，烟灰层非常脆弱，而黏稠的氟化液体极易对其造成损伤。目前我们正在探索更坚固的烟灰层保护方案，以延长器件的操作时间。然而，另一个重要方面是液滴内容物在表面的吸附问题。此前9，我们曾量化了器件运行过程中附着在表面的蛋白量，并发现持续运动与牛血清白蛋白（BSA）在表面吸附减少之间存在相关性。尽管如此，生物污染是一个复杂的问题，一些研究者甚至认为完全抑制该效应可能是不可能的；理论上，只要有一个蛋白分子附着在表面，就会吸引更多的蛋白分子聚集到该位点。事实上，其他研究者6报道的数字微流控器件最长运行时间约为40分钟。因此，表面的稳定性至关重要，目前仍是亟待解决的研究课题。

需要注意的是，在电润湿过程中...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

感谢Lindback基金会提供的资金支持，感谢Alexander Sidorenko博士和Elza Chu的有益讨论与技术协助，以及Robert Smith教授在秀丽隐杆线虫（C. elegans）检测方面提供的帮助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
石蜡蜡烛任意石蜡蜡烛
溅射系统Denton Vacuum，美国新泽西州摩尔斯特敦配备金靶材的 Desk V HP 溅射镀膜仪。 
1-十二烷硫醇Sigma-Aldrich471364
聚四氟乙烯（Teflon）DupontAF-1600
氟化液 Fluorinert FC-40Sigma-AldrichF9755氟化液体：将 Teflon-AF 树脂以 1:100（w/w）的比例溶于 Fluorinert FC-40 中，制备疏水涂层。
图形设计软件 — Adobe IllustratorAdobe Systems也可使用其他软件。
铜箔层压板DupontLF9110
激光打印机XeroxPhaser 6360 或类似型号需确认是否兼容 "浓黑" 或 "套准黑"（见正文）。
铜蚀刻剂TranseneCE-100
全氟烷氧基乙烯（PFA）薄膜McMaster-Carr84955K22
面包板Allied Electronics70012450 或类似型号尺寸需足够大，以容纳 10 个驱动器的组装。
通用电路板Allied Electronics70219535 或类似型号
连接器Allied Electronics5145154-8 或类似型号
控制板及控制程序（LabView 软件）National InstrumentsNI-6229 或类似型号
高压放大器TrekPZD700
电容器 C 和 C1，100 nF，60 VAllied 8817183
晶体管 T，NPN 型Allied 9350289
二极管 D，1N4007Allied 2660007
继电器 Allied 8862527
可视化系统Edmund OpticsVZM 200i 或类似型号系统放大倍数为 24X – 96X，与 Hitachi KP-D20B 1/2 英寸 CCD 彩色相机配合使用。
录像机SonyGV-D1000 NTSC 或类似型号通过 S 视频线与相机连接。
模拟仿真COMSOL MultiphysicsV. 4.4

参考文献

  1. Fair, R. B. Digital microfluidics: is a true lab-on-a-chip possible. Microfluid Nanofluid. 3 (3), 245-281 (2007).
  2. Gupta, S., Alargova, R. G., Kilpatrick, P. K., Velev, O. D. On-Chip Dielectrophoretic Coassembly of Live Cells and Particles into Responsive Biomaterials. Langmuir. 26 (5), 3441-3452 (2009).
  3. Shih, S. C., et al. Dried blood spot analysis by digital microfluidics coupled to nanoelectrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem. 84 (8), 3731-3738 (2012).
  4. Gorbatsova, J., Borissova, M., Kaljurand, M. Electrowetting-on-dielectric actuation of droplets with capillary electrophoretic zones for off-line mass spectrometric analysis. J Chromatogr. 1234 (0), 9-15 (2012).
  5. Qin, J., Wheeler, A. R. Maze exploration and learning in C. elegans. Lab Chip. 7 (2), 186-192 (2007).
  6. Koc, Y., de Mello, A. J., McHale, G., Newton, M. I., Roach, P., Shirtcliffe, N. J. Nano-scale superhydrophobicity: suppression of protein adsorption and promotion of flow-induced detachment. Lab Chip. 8 (4), 582-586 (2008).
  7. Perry, G., Thomy, V., Das, M. R., Coffinier, Y., Boukherroub, R. Inhibiting protein biofouling using graphene oxide in droplet-based microfluidic microsystems. Lab Chip. 12 (9), 1601-1604 (2012).
  8. Kumari, N., Garimella, S. V. Electrowetting-Induced Dewetting Transitions on Superhydrophobic Surfaces. Langmuir. 27 (17), 10342-10346 (2011).
  9. Freire, S. L. S., Tanner, B. Additive-Free Digital Microfluidics. Langmuir. 29 (28), 9024-9030 (2013).
  10. Deng, X., Mammen, L., Butt, H. -J., Vollmer, D. Candle Soot as a Template for a Transparent Robust Superamphiphobic Coating. Science. 335, 67-70 (2011).
  11. Kang, K. H. How Electrostatic Fields Change Contact Angle in Electrowetting. Langmuir. 18 (26), 10318-10322 (2002).
  12. Abdelgawad, M., Watson, M. W. L., Young, E. W. K., Mudrik, J. M., Ungrin, M. D., Wheeler, A. R. Soft lithography: masters on demand. Lab Chip. 8 (8), 1379-1385 (2008).
  13. Barbulovic-Nad, I., Yang, H., Park, P. S., Wheeler, A. R. Digital microfluidics for cell-based assays. Lab Chip. 8 (4), 519-526 (2008).
  14. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

液滴传输电场去润湿电极制备炭黑涂层氟聚合物涂覆秀丽隐杆线虫传输牛血清白蛋白相互作用分析电子界面控制芯片实验室
利用降低液滴-表面相互作用优化数字微流控中生物分析物的传输
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。