本演示的目的是展示 体内 和 体外 昆虫病原线虫的饲养技术 在体 方法考虑了利用昆虫宿主饲养这些线虫，而 体外 方法利用富含营养的琼脂培养基。
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本文内容
摘要
摘要
昆虫病原线虫（EPN）（Steinernematidae 和 Heterorhabditidae）与肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的革兰氏阴性γ-变形菌具有互惠共生关系。Xenorhabdus 细菌与斯氏线虫共生，而 Photorhabdus 则是异小杆线虫的共生菌。线虫与细菌共同形成一种高效的杀虫复合体，通过密切且特异的协作杀死多种昆虫。本文中，我们展示了在实验室条件下培养这些线虫常用的体内（in vivo）和体外（in vitro）技术。此外，这些技术是成功建立EPN培养体系的关键步骤，也为利用这些生物体开展研究的其他生物测定奠定了基础。产生无共生菌（即无共生体）的线虫对于深入且多角度地研究共生关系往往至关重要。本方案无需添加抗生素，使用常规实验室设备即可在较短时间内完成。以此方法产生的线虫相对健壮，但其在储存期间的存活率可能因所用物种不同而有所差异。本演示中详述的技术对应于多位作者所描述的方法，并经美国亚利桑那大学（图森，亚利桑那州，USA）P. Stock 实验室优化。这些技术不同于用于害虫防治目的的大规模生产这些生物体的技术体系。
引言
昆虫病原线虫（EPN） 斯氏线虫属 和 异小杆线虫属 spp.（斯氏科，异小杆科）及其细菌共生体， Xenorhabdus 和 Photorhabdus 肠杆菌科（Enterobacteriaceae）被认为是陆生动物与微生物共生关系的一个新兴模型2-4,6,10,19. Xenorhabdus 和 Photorhabdus spp. 作为共生体存在于线虫唯一自由生活的阶段（也称为感染性幼虫（IJ）或第三阶段）的肠道中rd 感染性幼虫阶段8,10,13该细菌-线虫组合对多种昆虫具有致病性，并已在全球范围内的生物防治和综合害虫管理项目中成功应用。6,8.
本文展示了一组精选的 体内 和 体外 在实验室条件下常用于饲养昆虫病原线虫的技术。 在体 方法考虑使用昆虫宿主来培育线虫。通常采用不同昆虫目中的未成熟阶段（即 鳞翅目, 鞘翅目, 双翅目, 等等被认为适合的宿主。 体内 在实验室中，通常采用这些方法来维持线虫培养。然而，在需要大规模生产线虫时，该方法可能并不适用。由于需要大量昆虫宿主，因而会耗费更多时间，并增加与昆虫....
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方案
1. 在体 昆虫病原线虫及其共生细菌的培养
- 将一个 100 x 15 mm 的塑料培养皿倒置，并在皿盖内放置两张滤纸（直径 90 mm）。
- 将 1 ml 的感染性幼虫（IJ）水悬浮液（浓度为 1,000–2,000 IJ/ml）均匀地分布在滤纸上。
注意：感染性幼虫无需进行表面灭菌。 - 向培养皿中加入 10 头大蜡螟 Galleria mellonella 的末龄幼虫。目标是每条幼虫提供约 100–200 条 IJ。
- 用培养皿底部盖住皿盖（图 1），并标记培养皿。标注以下信息：线虫物种名称（如已知）；分离株编号/代号；感染陷阱设置日期。
- 将培养皿放入松密封口的塑料袋中（以保持湿度），并在黑暗环境中于室温或 20–25 °C 的培养箱中培养。每天检查培养皿。
注意：黑暗环境有助于线虫感染，因其模拟了土壤中的自然感染条件。 - 3–5 天后，将出现线虫感染迹象的虫尸转移至改良的怀特氏捕获装置（White trap）7。
注意：若虫尸散发腐败气味，可能表明培养未成功和/或存在污染。此时应使用新的一批线虫和 昆虫重新设置感染装置。
2. 体外 昆虫病原线虫及其共生细菌的培养
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结果
的 体内 饲养方法利用活体昆虫作为线虫生长和繁殖的宿主。感染室是一种使昆虫暴露于感染性幼虫（IJs）的高效方法。在线虫的生活史中，该阶段是唯一能够将细菌共生体从一个昆虫宿主传播到另一个昆虫宿主的阶段。 图1 展示了感染室的设置以及构建该室所需的材料。 体外 饲养方法可使EPN在无昆虫宿主的情况下生长，同时也可用于培养无共生体（无共生菌）的线虫。 图2 显示含有不同线虫发育阶段的脂质琼脂平板。在基于生物种概念验证线虫身份所需的杂交试验中，也可考虑使用脂质琼脂平板。肝脏肾脏琼脂法最初由 Poinar 描述。 & 托马斯（1966）14该方法可使线虫在无昆虫宿主的条件下发育并繁殖，也可用于培养不含共生细菌的线虫即 产生无共生体线虫）。该方法的一个缺点是由于培养基营养丰富，容易发生污染，可能导致不需要的细菌或真菌生长。 图3A 显示带有IJS在平板侧面爬行的肝肾琼脂平板。在此阶段，可将培养皿的底部部分转移至改良的怀特陷阱中。 图3B
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讨论
选择合适的寄主是成功进行昆虫病原线虫（EPN）体内培养的关键因素。in vivo 培养中，斯氏线虫科（steinernematids）和异小杆线虫科（heterorhabditids）通常均可在大蜡螟幼虫 Galleria mellonella（鳞翅目：螟蛾科）体内繁殖并顺利完成其生活史。然而，也可考虑使用来自不同科或不同目昆虫的其他物种。目前已描述的少数线虫物种对特定昆虫寄主具有专一性。例如，S. kushidai 和 S. scarabaei 对鳞翅目幼虫的致病性较弱，需依赖鞘翅目幼虫（如金龟子幼虫，Scarabaeidae）才能在实验室中成功培养。另一个物种 S. scapterisci 则偏好直翅目昆虫，如蟋蟀或蝼蛄。
当没有合适的宿主或实验条件需要时，可采用体外（in vitro）方法培养昆虫病原线虫（EPN）。这些方法使用能够为线虫及其共生细菌提供丰富营养的培养基。在本演示中，我们介绍了两种可用于成功培养和繁殖EPN的琼脂培养基（肝脏-肾脏琼脂和脂质琼脂），无论是.......
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致谢
作者谨此感谢 Stock 实验室的前成员：Ming-Min Lee、Kathryn Plichta、Victoria Miranda-Thompson 和 Sam-Kyu Kim，他们为改进这些实验方案中的许多部分作出了贡献。本研究工作部分由美国国家科学基金会资助，资助编号为 IOS-0840932 和 IOS-0724978，授予 S. P. Stock。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 用于体内感染实验 | |||
| 100 × 15 培养皿 | VWR | 25384-088 | |
| 滤纸，9 cm，1号纤维素滤纸 | Whatman/VWR | 28450-081 | 推荐使用1号滤纸 |
| 昆虫宿主 | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | Galleria mellonella为推荐宿主 |
| 肝脏-肾脏琼脂培养基（配制500 ml） | |||
| 60 × 15 mm 培养皿 | VWR | 25384-092 | |
| 牛肝，50 g | 本地采购；屠宰场或超市 | 剩余部分可冷冻保存，后续使用时解冻 | |
| 牛肾，50 g | 本地采购；屠宰场或超市 | 剩余部分可冷冻保存，后续使用时解冻 | |
| 氯化钠 2.5 g（终浓度0.5%） | Acros/VWR | 200002-434 | 可使用任意研究级NaCl |
| 琼脂，7.5 g（终浓度1.5%琼脂） | HiMedia/VWR | 95026-642 | 可使用任意培养基级琼脂 |
| 500 ml 蒸馏 H2O | |||
| 脂质琼脂培养基（配制1 L） | |||
| 100 × 15 培养皿 | VWR | 25384-088 | |
| 营养肉汤，8 g | BD/VWR | 90002-660 | |
| 酵母提取物，5 g | EMD/VWR | EM1.03753.0500 | |
| 六水合氯化镁 10 ml（0.2 g/ml） | EMD/VWR | EM-MX0045-1 | |
| 玉米油，4 ml | 任意品牌 | 本地采购；超市 | 可使用任意品牌的玉米油 |
| 玉米糖浆，96 ml：将7 ml玉米糖浆加入89 ml加热的H2O中，混匀 | Karo | 本地采购；超市 | |
| 琼脂，15 g | HiMedia/VWR | 95026-642 | 可使用任意培养基级琼脂 |
| 蒸馏 H2O，890 ml |
参考文献
- Akhurst, R. J. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes, Neoaplectana and Heterorhabditis. J. Gen. Microbiol. 121, 303-309 (1980).
- Dunphy, G. B., Webster, J. M.
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重印与许可
