本演示的目的是展示 体内 和 体外 昆虫病原线虫的饲养技术 在体 方法考虑了利用昆虫宿主饲养这些线虫，而 体外 方法利用富含营养的琼脂培养基。
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本文内容
摘要
摘要
昆虫病原线虫（EPN）（Steinernematidae 和 Heterorhabditidae）与肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的革兰氏阴性γ-变形菌具有互惠共生关系。Xenorhabdus 细菌与斯氏线虫共生，而 Photorhabdus 则是异小杆线虫的共生菌。线虫与细菌共同形成一种高效的杀虫复合体，通过密切且特异的协作杀死多种昆虫。本文中，我们展示了在实验室条件下培养这些线虫常用的体内（in vivo）和体外（in vitro）技术。此外，这些技术是成功建立EPN培养体系的关键步骤，也为利用这些生物体开展研究的其他生物测定奠定了基础。产生无共生菌（即无共生体）的线虫对于深入且多角度地研究共生关系往往至关重要。本方案无需添加抗生素，使用常规实验室设备即可在较短时间内完成。以此方法产生的线虫相对健壮，但其在储存期间的存活率可能因所用物种不同而有所差异。本演示中详述的技术对应于多位作者所描述的方法，并经美国亚利桑那大学（图森，亚利桑那州，USA）P. Stock 实验室优化。这些技术不同于用于害虫防治目的的大规模生产这些生物体的技术体系。
引言
昆虫病原线虫（EPN） 斯氏线虫属 和 异小杆线虫属 spp.（斯氏科，异小杆科）及其细菌共生体， Xenorhabdus 和 Photorhabdus 肠杆菌科（Enterobacteriaceae）被认为是陆生动物与微生物共生关系的一个新兴模型2-4,6,10,19. Xenorhabdus 和 Photorhabdus spp. 作为共生体存在于线虫唯一自由生活的阶段（也称为感染性幼虫（IJ）或第三阶段）的肠道中rd 感染性幼虫阶段8,10,13该细菌-线虫组合对多种昆虫具有致病性，并已在全球范围内的生物防治和综合害虫管理项目中成功应用。6,8.
本文展示了一组精选的 体内 和 体外 在实验室条件下常用于饲养昆虫病原线虫的技术。 在体 方法考虑使用昆虫宿主来培育线虫。通常采用不同昆虫目中的未成熟阶段（即 鳞翅目, 鞘翅目, 双翅目, 等等被认为适合的宿主。 体内 在实验室中，通常采用这些方法来维持线虫培养。然而，在需要大规模生产线虫时，该方法可能并不适用。由于需要大量昆虫宿主，因而会耗费更多时间，并增加与昆虫饲养相关的额外成本。
昆虫病原线虫也可进行培养 体外 在多种培养基上。根据研究目的； 体外 方法可能或需考虑在培养基中加入共生细菌。在本演示中，我们描述了两种常用于繁殖昆虫病原线虫（EPN）的方法。培养基的成分可为共生细菌提供营养来源，并为线虫提供固醇来源。 体外 方法具有无需昆虫寄主即可培育EPN的优势。
最初，许多 体外 开发的培养基被用于在缺乏合适昆虫宿主时扩增EPN。然而，近年来 体外 饲养方法已广泛应用于研究昆虫病原线虫与其共生细菌之间互惠关系的研究中17,19.
本演示中详述的技术对应于多位作者所描述的方法，并由亚利桑那大学（美国亚利桑那州图森市）Stock实验室进一步优化。这些技术不同于用于害虫管理目的的大规模生产这些生物体所采用的技术体系。
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方案
1. 在体 昆虫病原线虫及其共生细菌的培养
- 将一个 100 x 15 mm 的塑料培养皿倒置，并在皿盖内放置两张滤纸（直径 90 mm）。
- 将 1 ml 的感染性幼虫（IJ）水悬浮液（浓度为 1,000–2,000 IJ/ml）均匀地分布在滤纸上。
注意：感染性幼虫无需进行表面灭菌。 - 向培养皿中加入 10 头大蜡螟 Galleria mellonella 的末龄幼虫。目标是每条幼虫提供约 100–200 条 IJ。
- 用培养皿底部盖住皿盖（图 1），并标记培养皿。标注以下信息：线虫物种名称（如已知）；分离株编号/代号；感染陷阱设置日期。
- 将培养皿放入松密封口的塑料袋中（以保持湿度），并在黑暗环境中于室温或 20–25 °C 的培养箱中培养。每天检查培养皿。
注意：黑暗环境有助于线虫感染，因其模拟了土壤中的自然感染条件。 - 3–5 天后，将出现线虫感染迹象的虫尸转移至改良的怀特氏捕获装置（White trap）7。
注意：若虫尸散发腐败气味，可能表明培养未成功和/或存在污染。此时应使用新的一批线虫和 昆虫重新设置感染装置。
2. 体外 昆虫病原线虫及其共生细菌的培养
- 肝脏-肾脏琼脂法9,19
- 将肝脏和肾脏切成小块（2 cm3 或更小），放入搅拌机中，加入 NaCl、琼脂和 300 ml 水，搅拌至组织成为液态浆状物、浓稠糊状物或匀浆。然后将混合物转移至 1 L 锥形瓶中。
- 向搅拌机容器中加入最后 200 ml 水，并将残留的培养基倾倒至锥形瓶中。在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟。灭菌后，待琼脂冷却至可触碰温度后再进行倾注。
注意：不建议使用移液器操作该培养基，因为该培养基中常含有肉质块状物。 - 在倾注过程中，边倒边手动搅拌或轻轻旋转锥形瓶，将约 20 ml 琼脂倒入 5（或 6）cm 的培养皿中，以获得更均匀的培养基。让琼脂凝固，并将培养皿储存于 4 °C，待用时取出。
注意：使用火焰灭菌的金属刮刀将倒入培养皿中的大块肉组织打碎。
- 脂质琼脂法9,19
- 通过混合营养肉汤、琼脂和酵母提取物制备脂质琼脂培养基，将混合物倒入 2 L 锥形瓶中。加入蒸馏 H2O 和 MgCl2•6H2O，在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟。
- 加入无菌的玉米油和玉米糖浆混合液，并充分搅拌或剧烈振荡，以使油滴均匀分散。
注意：通过将所需体积的玉米油和糖浆置于紫外交联仪中进行灭菌。油不会完全溶解于液体中，但应确保其形成微小油滴。 - 将约 20 ml 琼脂倒入 5（或 6）cm 培养皿中，待琼脂凝固后，将培养皿储存于 4 °C，待用时取出。
- 将目标共生菌划线接种至脂质琼脂平板上，在 28 °C 下培养 24–48 小时。
注意：可涂布 100–200 µl 过夜（12–16 小时）的 LB 亚培养液。 - 次日，加入约 0.4 ml 表面灭菌的线虫悬浮液（卵或感染性幼虫），并将平板置于室温避光环境或 22 ±3 °C 的培养箱中继续培养。
注意：线虫悬浮液添加量不应超过 0.4 ml，以免造成环境过湿，不利于线虫生长。 - 每日观察培养情况。通常约 12 天后可产生新一代感染性幼虫（IJs）（图 2）。
- 当观察到线虫在培养皿壁上爬行时（图 3A），将底部含琼脂的培养皿转移至改良 White 捕获装置（参见 Orozco et al.12）以收集感染性幼虫（IJs）（图 3B）。此操作应在超净工作台中进行，以减少培养基污染。
- 在线虫从改良 White 捕获装置中逸出后收集 IJs，并用无菌水冲洗 IJ 悬浮液以去除任何培养基残渣。将 IJs 储存于灭菌蒸馏水中，置于 10 °C（低温培养箱或冷藏室）中，或根据需要立即使用。
注意：根据研究目的，可使用携带共生菌或无共生菌的线虫接种平板。
3. 体外 无共生体（无共生菌）昆虫病原线虫的培育
- 用目标线虫物种的感染性幼虫（IJs）感染10-20只G. mellonella幼虫（参见第1节）。感染后3或4天（此时IJs应已发育为第一代成虫），收集死亡的幼虫尸体。
注意：不同物种的成熟时间以及获得足够数量卵所需的雌虫数量会有所不同。如有必要，可增加感染的G. mellonella幼虫数量，并可在感染后48小时即开始解剖，以评估其是否处于合适的发育阶段。 - 将每具尸体单独放入含有生理盐水（M9缓冲液18）的培养皿中。用精细尖头镊子拉扯幼虫头部进行解剖。
- 用细针（建议使用L形针）收集至少20只带有卵的 gravid 雌虫（体内含卵），并将其置于含有10 ml M9缓冲液的表玻璃皿中（图4A）。
- 配制无菌化溶液，成分如下：6.75 ml 蒸馏水、1.25 ml 5 N NaOH 和 2.25 ml 市售漂白剂溶液（稀释至含3%次氯酸盐）。
注意：NaOH为强碱性溶液，操作时应佩戴手套、护目镜及其他适当的防护装备。
注意：每次均需新鲜配制无菌化溶液，因漂白剂在光照下易降解。建议配制多批次溶液，并在多个表玻璃皿中同时进行卵的表面灭菌与收集。 - 用M9缓冲液冲洗雌虫至少三次：向表玻璃皿中加入缓冲液后，用移液器吸出。确保雌虫始终保留在表玻璃皿内。重复此步骤共三次。
- 立即加入无菌化溶液，使雌虫在此溶液中停留不超过10–15分钟。观察线虫组织开始溶解，而卵（对无菌化溶液具有抗性）则保持完整。
- 用针或解剖刀切割雌虫体以人工破坏其结构，加快组织溶解过程（图4B, C）。用移液器将卵转移至1.5 ml 微离心管中，避免带入未溶解的组织。
注意：根据需要使用多个微离心管，操作应迅速，因为卵在无菌化溶液中长时间暴露会降低其活力。 - 使用“高速档”涡旋振荡器振荡管子15秒，以进一步去除附着在卵表面的线虫组织。若无涡旋振荡器，可用移液器反复吹打溶液数次作为替代。
- 在约18,000 g下离心2分钟使卵沉淀。若卵未充分沉淀，可提高离心速度。弃去无菌化溶液，加入无菌蒸馏水清洗两次，每次加满微离心管后，在900 x g下再离心1分钟。
- 最后一次洗涤后，将卵重悬于300–500 µl无菌蒸馏水中，并转移至无菌的3 cm培养皿或已灭菌的表玻璃皿中。请注意，此时卵已实现表面灭菌，因此应使用无菌移液器、无菌吸头和无菌水以维持卵的洁净状态。
- 在解剖显微镜下（30–50倍放大）检查卵，确认其完整性（图4D），然后将其转移至含肝肾琼脂的5 cm培养皿中（参见第2.1节）。
注意：每块培养皿中加入的卵悬液不得超过400 µl，否则会使琼脂过度湿润。 - 标记培养皿并注明相关信息，将其直立存放于28 °C黑暗环境中。卵的孵化通常在过夜后即可观察到。
注意：培养皿盖上可能会有冷凝水，但1–2天后会自然蒸发。此时应将培养皿放入塑料袋中，以保持琼脂湿度，防止其干燥。 - 定期观察培养皿，一旦发现真菌或细菌污染迹象即丢弃。当观察到感染性幼虫（IJs）开始沿培养皿壁迁移时，取下皿盖，将含琼脂的底部培养皿转移至改良White陷阱装置12中。转移过程中应注意无菌操作，避免暴露的培养基受到污染。
- 持续监测White陷阱装置，并根据需要收集感染性幼虫（IJs）。
注意：无共生菌的线虫可在数天甚至数周内持续迁移到White陷阱的水中。
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结果
的 体内 饲养方法利用活体昆虫作为线虫生长和繁殖的宿主。感染室是一种使昆虫暴露于感染性幼虫（IJs）的高效方法。在线虫的生活史中，该阶段是唯一能够将细菌共生体从一个昆虫宿主传播到另一个昆虫宿主的阶段。 图1 展示了感染室的设置以及构建该室所需的材料。 体外 饲养方法可使EPN在无昆虫宿主的情况下生长，同时也可用于培养无共生体（无共生菌）的线虫。 图2 显示含有不同线虫发育阶段的脂质琼脂平板。在基于生物种概念验证线虫身份所需的杂交试验中，也可考虑使用脂质琼脂平板。肝脏肾脏琼脂法最初由 Poinar 描述。 & 托马斯（1966）14该方法可使线虫在无昆虫宿主的条件下发育并繁殖，也可用于培养不含共生细菌的线虫即 产生无共生体线虫）。该方法的一个缺点是由于培养基营养丰富，容易发生污染，可能导致不需要的细菌或真菌生长。 图3A 显示带有IJS在平板侧面爬行的肝肾琼脂平板。在此阶段，可将培养皿的底部部分转移至改良的怀特陷阱中。 图3B
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讨论
选择合适的寄主是成功进行昆虫病原线虫（EPN）体内培养的关键因素。in vivo 培养中，斯氏线虫科（steinernematids）和异小杆线虫科（heterorhabditids）通常均可在大蜡螟幼虫 Galleria mellonella（鳞翅目：螟蛾科）体内繁殖并顺利完成其生活史。然而，也可考虑使用来自不同科或不同目昆虫的其他物种。目前已描述的少数线虫物种对特定昆虫寄主具有专一性。例如，S. kushidai 和 S. scarabaei 对鳞翅目幼虫的致病性较弱，需依赖鞘翅目幼虫（如金龟子幼虫，Scarabaeidae）才能在实验室中成功培养。另一个物种 S. scapterisci 则偏好直翅目昆虫，如蟋蟀或蝼蛄。
当没有合适的宿主或实验条件需要时，可采用体外（in vitro）方法培养昆虫病原线虫（EPN）。这些方法使用能够为线虫及其共生细菌提供丰富营养的培养基。在本演示中，我们介绍了两种可用于成功培养和繁殖EPN的琼脂培养基（肝脏-肾脏琼脂和脂质琼脂），无论是...
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致谢
作者谨此感谢 Stock 实验室的前成员：Ming-Min Lee、Kathryn Plichta、Victoria Miranda-Thompson 和 Sam-Kyu Kim，他们为改进这些实验方案中的许多部分作出了贡献。本研究工作部分由美国国家科学基金会资助，资助编号为 IOS-0840932 和 IOS-0724978，授予 S. P. Stock。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 用于体内感染实验 | |||
| 100 × 15 培养皿 | VWR | 25384-088 | |
| 滤纸，9 cm，1号纤维素滤纸 | Whatman/VWR | 28450-081 | 推荐使用1号滤纸 |
| 昆虫宿主 | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | Galleria mellonella为推荐宿主 |
| 肝脏-肾脏琼脂培养基（配制500 ml） | |||
| 60 × 15 mm 培养皿 | VWR | 25384-092 | |
| 牛肝，50 g | 本地采购；屠宰场或超市 | 剩余部分可冷冻保存，后续使用时解冻 | |
| 牛肾，50 g | 本地采购；屠宰场或超市 | 剩余部分可冷冻保存，后续使用时解冻 | |
| 氯化钠 2.5 g（终浓度0.5%） | Acros/VWR | 200002-434 | 可使用任意研究级NaCl |
| 琼脂，7.5 g（终浓度1.5%琼脂） | HiMedia/VWR | 95026-642 | 可使用任意培养基级琼脂 |
| 500 ml 蒸馏 H2O | |||
| 脂质琼脂培养基（配制1 L） | |||
| 100 × 15 培养皿 | VWR | 25384-088 | |
| 营养肉汤，8 g | BD/VWR | 90002-660 | |
| 酵母提取物，5 g | EMD/VWR | EM1.03753.0500 | |
| 六水合氯化镁 10 ml（0.2 g/ml） | EMD/VWR | EM-MX0045-1 | |
| 玉米油，4 ml | 任意品牌 | 本地采购；超市 | 可使用任意品牌的玉米油 |
| 玉米糖浆，96 ml：将7 ml玉米糖浆加入89 ml加热的H2O中，混匀 | Karo | 本地采购；超市 | |
| 琼脂，15 g | HiMedia/VWR | 95026-642 | 可使用任意培养基级琼脂 |
| 蒸馏 H2O，890 ml |
参考文献
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