本文介绍了通过匀浆和蔗糖梯度离心结合超速离心法从猪或牛视网膜中纯化光感受器外节片段（POS）的实验方案。该方案可用于制备大量标记或未标记的POS分装样品，并可于-80 °C长期保存。
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本文内容
摘要
摘要
分析视网膜色素上皮（RPE）细胞的一项重要功能——吞噬光感受器外节段（POS）衰老脱落的远端片段——可被实施 体外. 含有堆叠的膜盘并承载光转导机制的感光细胞外节段在视网膜中持续更新。衰老的外节段（POS）每日由视网膜色素上皮（RPE）细胞清除。啮齿类、猪/牛及人类RPE细胞以相似的方式识别来自不同物种的POS。为便于开展大量重复性实验并减少变异，可从猪眼大量分离POS，并分装后冷冻保存。本方案利用了光敏色素在暗处呈现橙色的特性。在红光下，将剖开并切半的眼杯用缓冲液收集视网膜。将视网膜细胞悬液进行匀浆、过滤后加载至连续蔗糖梯度中。离心后，POS位于梯度上部具有特征性橙色的条带中。收集该条带，离心、依次用洗涤缓冲液重悬、计数并分装。由此获得的POS可用于POS刺激后不同时间点的吞噬作用检测，以及蛋白质活化、定位或相互作用的分析。此外，POS也可用荧光染料标记， e.g，FITC，分装后用于后续POS结合或吞噬的荧光定量分析。其他可能的应用包括使用修饰的POS或POS刺激联合应激条件，以研究氧化应激或衰老对RPE细胞的影响。
引言
在视网膜中，视觉的产生始于一类称为视蛋白（opsins）的光敏分子发生异构化，随后转化为可在神经元之间传递的信号，最终传至大脑的视觉区域。这些分子嵌在形似薄煎饼的膜盘层状结构中，构成光感受器细胞（PRs）外节部分。由于持续暴露于光线之下，光感受器细胞因而承受较高水平的氧化应激，必须不断更新其外节部分，以减少潜在的氧化损伤。光感受器外节与邻近的视网膜色素上皮（RPE）细胞的顶端微绒毛紧密接触。RPE细胞构成血-视网膜屏障的外层，承担多种对光感受器健康与功能至关重要的任务1，例如通过黑色素色素淬灭光线、将光敏视蛋白组分视黄醛重新异构化、提供营养物质和生长因子，以及参与光感受器代谢产物的清除。
此外，视网膜色素上皮（RPE）细胞可清除衰老的感光细胞外节段（POS）并回收其组分，这一日常活动受哺乳动物视网膜昼夜节律的调控2,3脱落的光感受器外节段（POS）的清除对于光感受器（PR）的存活至关重要。当清除过程被完全阻断时，POS碎片积聚，导致光感受器退化，进而引起视力迅速丧失4,5若节律性特征消失并被持续性活动取代，PR和RPE缺陷会随年龄增长而累积6因此，阐明RPE吞噬作用的分子调控机制非常重要 体外 为了理解与其功能障碍相关的表型。有趣的是，视网膜色素上皮（RPE）细胞中的分子机制与巨噬细胞清除凋亡细胞所用的机制非常相似，且两者均依赖于对吞噬碎片表面暴露的磷脂酰丝氨酸的识别。<....
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方案
此POS分离实验耗时较长，若在储存前对POS进行标记，则可能需要长达12小时才能完成。本实验方案改编自R.S. Molday及其同事于1987年发表的一篇论文31，并由S.C. Finnemann及其同事于1997年进行了修改10。
动物的处理遵循视力与眼科学研究协会（ARVO）关于动物在眼科和视觉研究中使用的声明。实验方案已通过巴黎第六大学皮埃尔与玛丽·居里分校查尔斯·达尔文伦理委员会以及福特汉姆大学机构动物护理和使用委员会的审查与批准。
1. 通用设置
- 获取80只新鲜的猪眼或牛眼，尽量在屠宰后尽快取得，并在避光条件下冷藏保存。向供应方提供明确指示，确保其采用相同的处理方式。本实验方案已针对80只眼进行优化。若需处理更多眼组织以获得更大批量的样本（例如，，来自160只眼睛），将溶液用量加倍，并进行两轮超速离心；在收集步骤时再合并样品（见 步骤 2.2.2).
- 在实验台上设置红色安全灯、吸水垫和擦拭纸（材料表）。准备15 cm培养皿和生物危害废物袋用于废弃物收集（未使用的的眼部组织、玻璃体…穿戴合身的实验服、手套、袖套和护目镜。
- 注意事项：
- 预冷所有溶液，并在所有步骤中保持低温。尽可能将眼睛和梯....
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结果
线性蔗糖梯度与超速离心的结合，可依据密度差异分离视网膜悬液中的不同组分。较重且较大的视网膜碎片和视网膜色素上皮（RPE）细胞会沉降至梯度底部或接近底部的位置（图 2A）。较轻的感光细胞外节段（POS）以及来自视网膜的较轻单个细胞或细胞碎片则迁移形成独立条带，在离心结束时位于梯度的上半部分。通过在离心步骤完成前始终保持眼球和样品处于避光环境中，含有POS的条带可立即通过其明亮的橙色被识别。该条带的宽度和强度取决于梯度的质量和离心管高度（推荐使用89 mm高度的离心管）。通常情况下，正确分离的POS在显微镜载玻片上观察时应呈细长状，笔直或略弯曲（图 2B）。根据显微镜焦平面的不同，它们可能呈现为暗色或有光泽。若未充分重悬，POS会以团块状存在；若发生损伤（见下文段落），则会表现为更小的碎片，类似“粉尘状”背景。
可能出现的问题主要与以下三个方面有关。第一个可能的问题是视网膜匀浆物的振荡步骤不够剧烈，导致外节小盘（POS）仍附着在感光细胞（PRs）上，从而降低产量。第二个可能的问题与梯度层析柱制备不良或梯度质量受损有关，.......
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讨论
优化纯化的三个步骤或条件至关重要：梯度离心管的制备质量及精细操作、在收集步骤前始终保持组织处于低温避光环境，以及视网膜匀浆时振荡强度的控制，以实现外节段（POS）与感光细胞其余部分的有效分离。如果无法清晰观察到橙色条带，最可能的原因即为上述三种情况之一（另见结果部分第二段）。某些条件可进行适当调整，例如使用27–50%的蔗糖梯度浓度32，或采用Optiprep不连续梯度33,21。
由于POS不应经历两次冻融，因此在制备实验用分装样品时需加以注意。建议根据不同的应用体积准备多种规格的分装样品。
应谨慎使用POS预标记。共价标记会产生荧光极强的POS，使共定位研究变得困难。此外，预标记后的冻融过程可能无法维持POS的表面特性，并改变其免疫原性。因此，对于共定位实验，建议储存未标记的POS，并在解冻后立即进行标记，然后用于实验10,13-15,32。
制备大规模的外节段（POS.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由法国国家研究局（Agence Nationale de la Recherche，授予 EFN 的青年研究者项目）、视觉与听觉基金会（Fondation Voir et Entendre）和贝当古·舒勒基金会（Fondation Bettencourt Schueller，授予 EFN 的青年研究者资助）、法国国家科学研究中心（Centre National de la Recherche Scientifique，CNRS，为 EFN 提供常任职位）以及美国国立卫生研究院国家眼科研究所（National Eye Institute of the National Institutes of Health，项目编号 R01-EY13295，授予 SCF）提供资助。此外，巴黎视觉研究所（Institut de la Vision）由法国国家健康与医学研究院（Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale）、巴黎第六大学（Université Pierre et Marie Curie-Paris 6）、法国国家科学研究中心（Centre National de la Recherche Scientifique）和巴黎市政府（Départment de Paris）共同资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 特定材料/设备 | |||
| 2 室梯度混合器 | 带有 30 ml 腔室的梯度混合器 | ||
| 3 mm 直径硅胶管 | 用于梯度胶制备的管路 | ||
| 小型磁力搅拌子 | 适用于梯度混合器腔室的搅拌子 | ||
| 红色安全灯 | 暗处解剖用无活性光灯 | ||
| Ultra Clear 25 x 89 cm 管 | Beckman | 344058 | 超速离心管 |
| PP Oak Ridge 管 | Nalgene | 3119-0050 | 30 ml 离心管 |
| Optima LE-80K | Beckman Coulter | 365668 | 超速离心机 |
| SW 32Ti 摆动转子 | Beckman Coulter | 369694 | 超速离心机用摆动转子 |
| Avanti J-26 XP | Beckman Coulter | 393124 | 离心机 |
| JA-25.50 转子 | Beckman Coulter | 363058 | Avanti J-26 XP 离心机用转子 |
| FITC 异构体 I | Life Technologies | F-1906 | 荧光染料 |
| 其他材料/设备 | |||
| 计数板（如 Neubauer 或 Malassez 计数板） | |||
| 带盖避光冰桶 | |||
| 天平 | |||
| 磁力搅拌器及固定杆 | |||
| 制冷型微量离心机 | |||
| 37 °C 水浴锅 | |||
| -80 °C 冰箱 | |||
| 耗材 | |||
| 实验服 | 健康与安全防护 | ||
| 手套 | |||
| 袖套 | |||
| 护目镜 | |||
| 吸水垫 | |||
| 生物危害垃圾袋和垃圾桶 | |||
| Weck-Prep 刀片 | 解剖 | 60 mm/2.25 英寸宽剃须刀片 | |
| 15 cm 塑料培养皿 | |||
| 无菌纱布片 | |||
| 15 和 50 ml 离心管 | 常用耗材 | ||
| 微量离心管 | |||
| 铝箔 |
参考文献
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Young, R. W., Bok, D. Participation of the retinal pigment epithelium in the rod outer segment renewal process. J. Cell Biol. 42 (2), 392-403 (1969).....
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重印与许可
