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方法文章

用于视网膜色素上皮细胞吞噬功能检测的大规模猪或牛感光细胞外节段纯化

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DOI：

10.3791/52100

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2014年12月12日

 ,  ,  ,  , 
1INSERM, U968, 2Sorbonne Universités, UPMC Paris 06, UMR_S 968, Institut de la Vision, 3CNRS, UMR_7210, 4Department of Biological Sciences, Center for Cancer, Genetic Diseases and Gene Regulation, Fordham University

本文内容

摘要

本文介绍了通过匀浆和蔗糖梯度离心结合超速离心法从猪或牛视网膜中纯化光感受器外节片段（POS）的实验方案。该方案可用于制备大量标记或未标记的POS分装样品，并可于-80 °C长期保存。

摘要

分析视网膜色素上皮（RPE）细胞的一项重要功能——吞噬光感受器外节段（POS）衰老脱落的远端片段——可被实施 体外. 含有堆叠的膜盘并承载光转导机制的感光细胞外节段在视网膜中持续更新。衰老的外节段（POS）每日由视网膜色素上皮（RPE）细胞清除。啮齿类、猪/牛及人类RPE细胞以相似的方式识别来自不同物种的POS。为便于开展大量重复性实验并减少变异，可从猪眼大量分离POS，并分装后冷冻保存。本方案利用了光敏色素在暗处呈现橙色的特性。在红光下，将剖开并切半的眼杯用缓冲液收集视网膜。将视网膜细胞悬液进行匀浆、过滤后加载至连续蔗糖梯度中。离心后，POS位于梯度上部具有特征性橙色的条带中。收集该条带，离心、依次用洗涤缓冲液重悬、计数并分装。由此获得的POS可用于POS刺激后不同时间点的吞噬作用检测，以及蛋白质活化、定位或相互作用的分析。此外，POS也可用荧光染料标记， e.g，FITC，分装后用于后续POS结合或吞噬的荧光定量分析。其他可能的应用包括使用修饰的POS或POS刺激联合应激条件，以研究氧化应激或衰老对RPE细胞的影响。

引言

在视网膜中，视觉的产生始于一类称为视蛋白（opsins）的光敏分子发生异构化，随后转化为可在神经元之间传递的信号，最终传至大脑的视觉区域。这些分子嵌在形似薄煎饼的膜盘层状结构中，构成光感受器细胞（PRs）外节部分。由于持续暴露于光线之下，光感受器细胞因而承受较高水平的氧化应激，必须不断更新其外节部分，以减少潜在的氧化损伤。光感受器外节与邻近的视网膜色素上皮（RPE）细胞的顶端微绒毛紧密接触。RPE细胞构成血-视网膜屏障的外层，承担多种对光感受器健康与功能至关重要的任务1，例如通过黑色素色素淬灭光线、将光敏视蛋白组分视黄醛重新异构化、提供营养物质和生长因子，以及参与光感受器代谢产物的清除。

此外，视网膜色素上皮（RPE）细胞可清除衰老的感光细胞外节段（POS）并回收其组分，这一日常活动受哺乳动物视网膜昼夜节律的调控2,3脱落的光感受器外节段（POS）的清除对于光感受器（PR）的存活至关重要。当清除过程被完全阻断时，POS碎片积聚，导致光感受器退化，进而引起视力迅速丧失4,5若节律性特征消失并被持续性活动取代，PR和RPE缺陷会随年龄增长而累积6因此，阐明RPE吞噬作用的分子调控机制非常重要 体外 为了理解与其功能障碍相关的表型。有趣的是，视网膜色素上皮（RPE）细胞中的分子机制与巨噬细胞清除凋亡细胞所用的机制非常相似，且两者均依赖于对吞噬碎片表面暴露的磷脂酰丝氨酸的识别。7-9然而，视网膜色素上皮（RPE）细胞与巨噬细胞对吞噬作用的调控方式不同：巨噬细胞在接触时即刻清除凋亡细胞，而RPE细胞尽管持续与感光细胞外节段接触，却仅每天节律性地吞噬一次外节段（POS）。这提示存在尚未完全阐明的特异性调控机制。

通过使用分离的视网膜外节段（POS）和细胞培养吞噬实验，已鉴定或验证了多种参与视网膜色素上皮（RPE）吞噬机制的分子。位于RPE细胞顶膜表面的αvβ5整合素受体在其配体MFG-E8的协同作用下，可特异性结合POS10-12，随后通过 MerTK 酪氨酸激酶受体被内化13-15CD36 清道夫受体已被证实参与 POS 的摄取，并影响其摄取速度16,17，可能作为POS表面氧化磷脂的感应器18内化过程需要招募与F-actin细胞骨架相关的蛋白质，例如annexin 219肌球蛋白II20 和肌球蛋白VIIA21,22天然或氧化的POS 体外 也被用于研究RPE细胞的衰老表型 体内 与未充分消化的氧化POS的积聚相关23-28由干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞的生成，为分离的视外节段（POS）带来了一种新的应用，这些POS可用于在细胞移植至动物或患者之前验证其功能。29,30,27.

Molday 及其同事于 1987 年首次描述了牛视杆细胞外节段（POS）的分离方案31，该方案结合了视网膜匀浆物在连续蔗糖梯度中进行超速离心的步骤，并通过观察未漂白视网膜感光色素（含有 11-cis 视黄醛）特有的橙色外观来进行鉴定。在过去十年中，由于为降低疯牛病风险而采取的预防措施，猪眼的使用变得日益普遍。本文所述方案展示了如何从猪或牛的眼球中获取大量 POS，并可将其分装后长期保存。这消除了使用啮齿类动物眼球制备 POS 的需要，后者每次 POS 制备和检测均需使用大量动物32,33,21,22。此外，本文还提供了在储存前使用荧光分子对 POS 进行标记的详细步骤，以便在某些应用中比在吞噬检测后标记 POS 的方式更简化且更具可比性地实现 POS 的定量与可视化32,10。因此，这些大量储备的 POS 样品可在多种不同类型的实验中实现良好的可重复性和操作便利性。

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方案

此POS分离实验耗时较长，若在储存前对POS进行标记，则可能需要长达12小时才能完成。本实验方案改编自R.S. Molday及其同事于1987年发表的一篇论文31，并由S.C. Finnemann及其同事于1997年进行了修改10。

动物的处理遵循视力与眼科学研究协会（ARVO）关于动物在眼科和视觉研究中使用的声明。实验方案已通过巴黎第六大学皮埃尔与玛丽·居里分校查尔斯·达尔文伦理委员会以及福特汉姆大学机构动物护理和使用委员会的审查与批准。

1. 通用设置

  1. 获取80只新鲜的猪眼或牛眼，尽量在屠宰后尽快取得，并在避光条件下冷藏保存。向供应方提供明确指示，确保其采用相同的处理方式。本实验方案已针对80只眼进行优化。若需处理更多眼组织以获得更大批量的样本（例如，，来自160只眼睛），将溶液用量加倍，并进行两轮超速离心；在收集步骤时再合并样品（见 步骤 2.2.2).
  2. 在实验台上设置红色安全灯、吸水垫和擦拭纸（材料表）。准备15 cm培养皿和生物危害废物袋用于废弃物收集（未使用的的眼部组织、玻璃体…穿戴合身的实验服、手套、袖套和护目镜。
  3. 注意事项：
    1. 预冷所有溶液，并在所有步骤中保持低温。尽可能将眼睛和梯度液置于冰上冷藏。
    2. 保持眼睛及衍生组织避光 尽可能避免在超速离心后的收集步骤之前暴露于光，以防止视色素的光漂白以及活性形式视色素橙粉色的丧失。

2. 实验方案操作

  1. 配制溶液和梯度：
    1. 完全解冻牛磺酸储备液，使用37 °C 水浴
    2. 从储备液配制所有溶液（表1，储备溶液），并使用磁力搅拌器将蔗糖与其他成分充分混匀，每种溶液均需如此操作。
      1. 配制15 ml匀浆液，终浓度为20%蔗糖、20 mM Tris-乙酸盐（pH 7.2）、2 mM MgCl₂210 mM 葡萄糖和 5 mM 牛磺酸。
      2. 配制25%蔗糖溶液，终浓度为25%蔗糖（使用70%蔗糖储备液）、20 mM Tris-乙酸盐（pH 7.2）、10 mM葡萄糖和5 mM牛磺酸。
      3. 配制60%蔗糖溶液，终浓度为60%蔗糖（使用蔗糖粉末）、20 mM 醋酸三羟甲基氨基甲烷（pH 7.2）、10 mM 葡萄糖和5 mM 牛磺酸。
      4. 配制洗涤液1，终浓度为20 mM醋酸三羟甲基氨基甲烷（pH 7.2）和5 mM牛磺酸。
      5. 配制洗涤液2，终浓度为10%蔗糖、20 mM醋酸三羟甲基氨基甲烷（pH 7.2）和5 mM牛磺酸。
      6. 配制洗涤液3，终浓度为10%蔗糖、20 mM磷酸钠（pH 7.2）和5 mM牛磺酸。
    3. 将梯度制备器固定在磁力搅拌器上，并在靠近出口的腔室中放入搅拌子，该腔室用于加入60%溶液。在导管出口处使用截断的P200移液器吸头，以获得合适的灌胶速度。
    4. 使用每种溶液各12 ml，将60%蔗糖溶液与25%蔗糖溶液混合稀释并轻轻搅拌，精细制备线性梯度即， 总共6个管（用于80只眼），置于预冷的超速离心管中。充分搅拌逐渐稀释的60%蔗糖溶液。控制梯度流速稳定，缓慢而平稳地倒入溶液，避免过快。
      注意：为了获得连续且线性的梯度，整个梯度形成过程中应始终保持移液器吸头开口位于溶液表面。
    5. 将梯度液置于冰上静置约1小时以达到稳定。在上样前始终保持梯度液处于低温状态。切勿振荡试管，以免破坏梯度。
  2. 组织采集：
    1. 在暗红光下采集组织。用手握住一只眼睛，用剃刀刀片的边缘触碰其前部，同时将眼睛远离身体持握（以避免溅射）； 图1）。使用剃刀刀片将眼球前部切成两半（包括角膜及至少5 mm的巩膜）。取出晶状体，并将眼杯翻转，使其能够套在一根手指的指尖上，从而暴露视网膜。
    2. 使用剃刀片以一定角度轻轻刮取视网膜，将其从脉络膜表面分离下来（视网膜呈粉红色薄膜状），并在视神经乳头处剪断图1将所有视网膜收集至2个50 ml离心管中，每管含15 ml匀浆液，置于冰上。
    3. 视网膜匀浆：
      1. 用手剧烈振荡悬浮液2分钟，以破坏不同的细胞层，使感光细胞外节段（POS）从感光细胞其余部分脱落，破碎POS，并使视网膜悬浮液均质化。
      2. 用双层洁净纱布过滤3次，以去除较大的组织碎片，并将滤过液收集至洁净的50 ml离心管中（图1视网膜悬液较为浓稠，为最大限度提高得率，每次过滤后应轻压纱布，以释放残留的组织碎片。
  3. 光感受器外节片段（POS）的分离
    1. 轻轻将粗制视网膜样本（每管约6–7 ml）铺置于6根超速离心管中，每根离心管内已预先加入24 ml新鲜预冷的25–60%连续蔗糖梯度溶液图1）。根据所用转子的要求适当平衡相对的离心管。在 4 ℃ 下以 106,000 × g 超速离心 50 分钟 °C.
    2. 用移液法吸除梯度上三分之一处橙粉色条带上方的大部分溶液（图2A）。使用截断的P1000吸头收集橙粉色条带至烧杯中。其余部分用漂白剂中和后弃去（生物废弃物）。
    3. 用约4–5倍体积的冰预冷的Wash 1溶液稀释。根据需要分装至多个30 ml离心管中。在4°C下以3,000 × g离心10分钟 °C. 小心弃去上清液。
    4. 将沉淀物重悬于10 ml洗涤液2中，按上述方法在3,000 × g离心10分钟。将沉淀物重悬于15 ml洗涤液3中，再次在3,000 × g离心10分钟。可将多个沉淀物的悬液合并，以减少在洗涤液2和洗涤液3中离心前所需的离心管数量。
  4. 未标记的 POS 分装：
    1. 将POS重悬于10 - 20 ml DMEM中。预稀释10 µ490 毫升 µl DMEM（1:50）稀释后，在细胞计数板中计数呈长梭形及旋涡状排列的POS细胞图2B）。计算每毫升中POS颗粒的产率和浓度。
      注意：产量有所不同，主要取决于猪/牛的年龄和品系以及眼睛的大小。 例如， 良好的制备浓度范围为 5 - 8 x 109 来自80只猪眼的POS。
    2. 确定最终 DMEM 体积（通常为 10 - 20 ml），并加入蔗糖，使其终浓度为 2.5% 蔗糖。
    3. 制备所需体积的等份试样， 例如， 5 × 107 每管POS，2 ml重悬体积，用于40的96孔实验 µ每孔。取一份样品，在室温下以2,300 × g离心5分钟。 并评估沉淀物大小。根据不同的应用体积准备不同 aliquot 量，因为 POS 不应经历两次冻融。
    4. 将POS分装样品在-80℃下冷冻保存 °直至进一步使用前均需保持在 C 条件下保存。
      注意：分装样品可稳定保存数月。在我们的实验条件下，未标记或标记的POS可保存至少一年。
  5. POS 标记与分装:
    注意：我们通常使用 FITC 标记 POS，以用于吞噬作用检测的定量分析，但也可根据需要选用其他染料。
    1. 将1支10 mg FITC小瓶中的冻干粉用0.1 M NaHCO₃缓冲液（pH 9.5）重悬，配制成2.5 mg/ml的浓度，需加入2.6 ml 0.1 M NaHCO₃缓冲液3 pH 8.4，加入 1.4 ml 0.1 M Na2CO3 pH 11.5（表2，储备溶液）。在室温下避光旋转孵育1小时，然后以最大速度离心5分钟，以沉淀未溶解的FITC固体。
    2. 将POS沉淀重悬于10 ml洗涤液3（或DMEM）中，每80只眼加入2 ml FITC溶液。剩余FITC溶液于-80℃冻存。 °C. 在室温下旋转孵育至少1.5小时，用铝箔避光。
    3. 使用洗涤液3按前述方法将标记的POS洗涤两次 第2.3.4节，然后在DMEM中洗涤一次或两次，直至上清液中几乎检测不到游离的FITC。将POS重悬于DMEM中，并按照未标记POS的方法进行计数和分装（第2.4节).
  6. 在实验中使用POS：
    1. 室温解冻POS，若为荧光标记样本，应尽量避光保存。室温下以2,300 × g离心5分钟。吸除上清液。
    2. 立即根据实验要求，用适当体积的检测溶液重悬。若补体致敏的羊红细胞（POS）攻击时间不同，将重悬的POS在室温避光保存数小时，以用于后续时间点的实验。

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结果

线性蔗糖梯度与超速离心的结合，可依据密度差异分离视网膜悬液中的不同组分。较重且较大的视网膜碎片和视网膜色素上皮（RPE）细胞会沉降至梯度底部或接近底部的位置（图 2A）。较轻的感光细胞外节段（POS）以及来自视网膜的较轻单个细胞或细胞碎片则迁移形成独立条带，在离心结束时位于梯度的上半部分。通过在离心步骤完成前始终保持眼球和样品处于避光环境中，含有POS的条带可立即通过其明亮的橙色被识别。该条带的宽度和强度取决于梯度的质量和离心管高度（推荐使用89 mm高度的离心管）。通常情况下，正确分离的POS在显微镜载玻片上观察时应呈细长状，笔直或略弯曲（图 2B）。根据显微镜焦平面的不同，它们可能呈现为暗色或有光泽。若未充分重悬，POS会以团块状存在；若发生损伤（见下文段落），则会表现为更小的碎片，类似“粉尘状”背景。

可能出现的问题主要与以下三个方面有关。第一个可能的问题是视网膜匀浆物的振荡步骤不够剧烈，导致外节小盘（POS）仍附着在感光细胞（PRs）上，从而降低产量。第二个可能的问题与梯度层析柱制备不良或梯度质量受损有关，...

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讨论

优化纯化的三个步骤或条件至关重要：梯度离心管的制备质量及精细操作、在收集步骤前始终保持组织处于低温避光环境，以及视网膜匀浆时振荡强度的控制，以实现外节段（POS）与感光细胞其余部分的有效分离。如果无法清晰观察到橙色条带，最可能的原因即为上述三种情况之一（另见结果部分第二段）。某些条件可进行适当调整，例如使用27–50%的蔗糖梯度浓度32，或采用Optiprep不连续梯度33,21。

由于POS不应经历两次冻融，因此在制备实验用分装样品时需加以注意。建议根据不同的应用体积准备多种规格的分装样品。

应谨慎使用POS预标记。共价标记会产生荧光极强的POS，使共定位研究变得困难。此外，预标记后的冻融过程可能无法维持POS的表面特性，并改变其免疫原性。因此，对于共定位实验，建议储存未标记的POS，并在解冻后立即进行标记，然后用于实验10,13-15,32。

制备大规模的外节段（POS...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作由法国国家研究局（Agence Nationale de la Recherche，授予 EFN 的青年研究者项目）、视觉与听觉基金会（Fondation Voir et Entendre）和贝当古·舒勒基金会（Fondation Bettencourt Schueller，授予 EFN 的青年研究者资助）、法国国家科学研究中心（Centre National de la Recherche Scientifique，CNRS，为 EFN 提供常任职位）以及美国国立卫生研究院国家眼科研究所（National Eye Institute of the National Institutes of Health，项目编号 R01-EY13295，授予 SCF）提供资助。此外，巴黎视觉研究所（Institut de la Vision）由法国国家健康与医学研究院（Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale）、巴黎第六大学（Université Pierre et Marie Curie-Paris 6）、法国国家科学研究中心（Centre National de la Recherche Scientifique）和巴黎市政府（Départment de Paris）共同资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
特定材料/设备
2 室梯度混合器带有 30 ml 腔室的梯度混合器
3 mm 直径硅胶管用于梯度胶制备的管路
小型磁力搅拌子适用于梯度混合器腔室的搅拌子
红色安全灯暗处解剖用无活性光灯
Ultra Clear 25 x 89 cm 管Beckman344058超速离心管
PP Oak Ridge 管Nalgene3119-005030 ml 离心管
Optima LE-80KBeckman Coulter365668超速离心机
SW 32Ti 摆动转子Beckman Coulter369694超速离心机用摆动转子
Avanti J-26 XPBeckman Coulter393124离心机
JA-25.50 转子Beckman Coulter363058Avanti J-26 XP 离心机用转子
FITC 异构体 ILife TechnologiesF-1906荧光染料
其他材料/设备
计数板（如 Neubauer 或 Malassez 计数板）
带盖避光冰桶
天平
磁力搅拌器及固定杆
制冷型微量离心机
37 °C 水浴锅
-80 °C 冰箱
耗材
实验服健康与安全防护
手套
袖套
护目镜
吸水垫
生物危害垃圾袋和垃圾桶
Weck-Prep 刀片解剖60 mm/2.25 英寸宽剃须刀片
15 cm 塑料培养皿
无菌纱布片
15 和 50 ml 离心管常用耗材
微量离心管
铝箔

参考文献

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