小鼠耳蜗组织外植体的长期延时成像

摘要

活体成像哺乳动物胚胎耳蜗具有挑战性，因为相关发育过程在十天内呈现时间梯度变化。本文介绍一种方法，用于培养并连续五天对来自荧光报告小鼠的胚胎耳蜗外植体组织进行成像。

摘要

本文介绍了一种对活体小鼠胚胎耳蜗组织外植体进行长期延时成像的方法。构建哺乳动物耳蜗高度有序且复杂结构的发育程序持续约十天。为了研究此期间基因表达的变化及其对药物或遗传操作的响应，需要进行长期成像。以往，活体成像通常受限于置于标准显微镜上加湿培养箱中组织外植体的存活能力。由于难以在培养过程中维持适宜的湿度和温度条件，成像实验的持续时间受到限制。将显微镜整合到改良的组织培养孵育箱中，可为长期活体成像提供理想环境。本方法展示了如何建立小鼠胚胎耳蜗外植体，并利用孵育箱显微镜通过明场和荧光显微镜技术，对胚胎第13天（E13）耳蜗外植体及耳蜗前感觉细胞标志物Sox2在5天内的动态行为进行延时成像观察。

引言

哺乳动物的耳蜗是一个高度有序的复杂器官。在小鼠中，从胚胎第11天（E11）耳泡发育出原始内耳开始，到出生后早期发育程序完成为止，期间发生多轮细胞信号传导及协调的基因表达变化。沿耳蜗管从基底端到顶端走行的是声音感知的感觉上皮，即柯蒂器官。柯蒂器官的发育受到精细调控，至发育结束时，其结构将包含一列内毛细胞、三列外毛细胞，以及穿插于其间的支持细胞（两列柱细胞和三列德特尔斯细胞），共五列。¹偏离这一精确顺序会导致听力损失，凸显了研究的重要性 感觉上皮发生与图式形成的机制².

体外培养小鼠胚胎耳蜗是研究柯蒂氏器发育机制的重要工具。该技术建立于1974年，在过去40多年中，已被用于阐明感觉上皮特化及柯蒂氏器形成的多种机制³。耳蜗是一个具有动态发育过程的复杂器官；某种干预可能需要长达七天才能显现其效应¹。例如，在E13期向耳蜗外植体培养物中添加GSK 3β抑制剂时，观察该化合物显著效应的最佳孵育时间为六天⁴。

活体成像技术可用于观察耳蜗发育过程中柯蒂氏器形态的变化、基因表达的改变、细胞迁移、增殖或死亡的追踪，同时可实时观察药物处理及信号通路干扰所产生的效应。迄今为止，耳蜗的活体成像主要依赖共聚焦显微镜，对柯蒂氏器的小范围区域进行短时间成像^5-8，但该技术受限于组织外植体的存活能力。在研究长期干预对缓慢发育过程的影响时，成像环境尤为关键。典型的共聚焦活体成像系统采用一个加湿的塑料培养箱，放置在显微镜载物台上。然而，热量和湿度会通过培养箱与显微镜台接触处的缝隙、观察窗口、铰链开口，以及显微镜各部件（如物镜或光源）周围的间隙散失。这种环境条件不利于外植体在两至三天以上维持良好的生理状态。

我们将“培养箱显微镜”定义为置于标准CO₂培养箱内部的倒置显微镜，而非围绕显微镜构建的培养箱。使用培养箱显微镜可延长实验周期，使样本成像时间从两到三天延长至长达两周。培养箱显微镜为细胞生长与分化提供了优良环境，对外植体培养的干扰极小，并能维持标准的可控条件。在持续多日的研究中，通常需要每天将样本从培养箱中取出，转移至倒置荧光显微镜进行成像。尽管该方法可行，但将培养皿移出培养箱会对敏感的发育组织造成应激。培养基酸碱度的变化以及因移出培养箱导致的温度波动，可能引起发育不良和组织状态不佳。此外，在每个时间点对同一区域以相同的焦平面和相同的方向进行成像极为困难。通过在培养箱内使用自动化系统，可维持组织的健康状态，增加成像时间点的数量，并确保每一帧图像均捕获相同区域。近年来，已开发出多种集成式显微镜组织培养箱，这些设备不仅在临床实践中具有应用价值⁹，也在干细胞与癌症研究中发挥重要作用^10,11。

本文介绍了一种对小鼠胚胎耳蜗组织外植体进行长期活体成像的实验方案。我们使用置于标准CO₂培养箱内的自动化显微成像系统，该系统能够在预设的时间点自动采集多个样本的图像。该系统由一台倒置显微镜组成，整体置于培养箱内。样本放置于可旋转的载物台上，使得在每个时间点均可对多个样本进行成像。照明、图像采集以及载物台的旋转均由自动化系统控制，并通过Metamorph软件进行操作。通过在操作软件中设定成像程序，可实现长达两周的连续实验，期间仅需极少的人工干预。在本示例中，我们同时采用明场和荧光成像，以展示耳蜗整体的生长与结构重组，特别是其中的前感觉区。在本实验中，耳蜗组织将从胚胎第13天（E13）的Sox2^EGFP报告基因小鼠中分离获取。体外培养建立后，将对样本进行为期五天的连续成像观察。

方案

小鼠组织取自Sox2^EGFP报告基因小鼠¹²，这些小鼠的饲养和处死均遵循加拿大动物护理委员会关于实验动物护理和使用的指南。

1. 胚胎耳蜗的培养

1. 通过混合 8.89 ml DMEM、1 ml 胎牛血清（FBS）、100 μl 100 倍 N2 添加剂和 10 μl 10 mg/ml 环丙沙星，制备补充改良杜尔贝科氏最低必需培养基（DMEM）。通过将 495 ml HBSS 与 5 ml 100% HEPES 混合，制备补充汉克氏平衡盐溶液（HBSS）。
2. 准备玻璃底培养皿：
   1. 在超净工作台内，将 200 µl 基底膜提取物基质溶于 5 ml DMEM 中。准备直径为 35 mm、带有 10 mm 孔的玻璃底培养皿。将 150 µl 基质/DMEM 滴加至每个玻璃底培养皿的中央。这些培养皿可在 40 分钟孵育后使用，或在 35 °C 的 CO₂ 培养箱中保存至少一周。
      注意：使用玻璃底培养皿的原因如下：确保培养皿底部透明，适用于成像；在培养皿中央形成一个凹槽，使外植体能够沉降在易于定位的区域；最后，在实验结束后，样品可进行免疫染色及后续分析。
3. 准备工作站和工具：
   1. 开启超净工作台，并用 70% 乙醇喷洒以创建洁净的工作环境。将镊子、勺子和一个黑色 184 硅胶弹性体培养皿（由 184 硅胶弹性体（10 份）、固化剂（1 份）和炭粉（2.5 g）混合制成）浸泡在 70% 乙醇中。
4. 在洁净工作区内收获用于实验的胚胎。在冰上冷的、补充了 1% HEPES 的 HBSS 中收集处于适当妊娠阶段的胚胎。
   1. 确定一个能显示报告基因活性的外部或可见器官，并使用荧光体视显微镜观察胚胎。将表现出报告基因活性的胚胎收集至冰上冷的、补充了 1% HEPES 的 HBSS 中，这些胚胎即为实验对象。
5. 收集颞骨：
   1. 操作需迅速，使用冷光源和精细镊子取下幼崽头部。注意在颈椎和下颌以下剪切，以避免损伤颞骨。
   2. 小心打开颅骨，移除脑组织，剪去头部前部，并将后颅骨转移至洁净培养皿中盛有的、补充了 1% HEPES 的冰上冷 HBSS 中。小心解剖出花生状的颞骨，注意保持前庭系统的完整性。
6. 解剖耳蜗：
   1. 将颞骨转移至盛有补充了 1% HEPES 的冰上冷 HBSS 的黑色硅胶弹性体包被培养皿中，固定骨的前庭区域。以倾斜角度插入昆虫针，以稳定颞骨并为镊子操作留出空间。固定是该过程中的关键步骤，若颞骨移动过多，则很难完整收获耳蜗。
   2. 小心去除耳蜗周围的软骨。将镊子的一侧尖端插入耳蜗基部外缘的软骨中，并在软骨上剪出一个小孔。
   3. 沿侧面剪开一片软骨瓣，插入镊子尖端，轻轻分离导管顶部与软骨。进行水平和斜向剪切，小心揭去囊的前部。将镊子的一个尖端插入剩余软骨与导管之间，轻轻剪下最后一部分。此时耳蜗的顶面已暴露。
   4. 从基部开始，夹住导管顶部与耳蜗上皮相接的区域，打开耳蜗导管。轻轻剥离顶部，必要时进行修剪，直至完全去除。剪除导管内侧残留的任何膜状组织。清除导管上多余的间充质组织，并将导管从前庭系统分离。
7. 培养外植体：
   1. 将外植体（腔面朝上）置于基质包被的玻璃底培养皿中央，小心吸去所有液体并静置两分钟。以滴加方式加入 150 µl 补充 DMEM，注意不要扰动外植体。若外植体漂浮，可用镊子重新定位，但需确保其沉降至培养皿底部，以便附着于基质上。
   2. 将玻璃底培养皿放入直径为 12 cm 的深型培养皿中，并在其中放置一小皿无菌水以维持湿度。将培养物置于 35 °C 培养箱中过夜，使外植体附着于基质并展平。

2. 活体成像

1. 选取外植体样本。使用荧光体视显微镜评估每个外植耳蜗的状态。仅选择从基部到顶端导管完整且牢固附着于玻璃表面的外植体。
2. 将培养箱设置为 35 °C、5% CO₂ 条件以培养耳蜗组织。将培养样本放入培养箱显微镜中：
   1. 轻柔吸除补充型 DMEM 培养基，并替换为至少 500 μl 新鲜培养基。若需进行长达 6 天的成像，使用 1–1.5 ml 更为适宜。对于附着较松的外植体，可在培养皿边缘用移液器滴加一圈培养基。额外液体可形成微型“加湿腔室”，在组织继续附着基质的过程中避免扰动外植体。
      1. 或者，若需在图像采集间隔期间更换试剂，可使用带铰链的培养皿盖，使皿盖在显微镜适配位置上打开，而培养皿仍保留在原位。铰链式皿盖可在不扰动样本或移出培养皿的情况下开启，从而保持其精确位置，便于后续图像采集。
   2. 将含有适当样本的玻璃底培养皿插入样本皿架中。本示例中的显微镜配备可旋转平台，最多可容纳八个 35 mm 样本皿。
   3. 在超净工作台内，将塑料皿盖更换为玻璃皿盖，并将培养皿插入样本皿架。将样本皿架放入培养箱时，需小心操作，避免使外植体从培养皿底部脱落或扰动培养基。
3. 设置成像程序：
   1. 开启显微镜、紫外灯和相机，并打开成像软件。
   2. 定位样本，依次为每个培养皿选择成像区域、对焦平面并调整曝光时间。选择对焦平面时，不仅需考虑开始时外植体的视野状态，还需考虑组织在实验过程中的移动情况以及时间序列的持续时长。
   3. 在荧光通道中设置以选定对焦平面为中心的 Z 轴层扫范围。设定实验的采样频率和持续时间。采样频率受限于图像采集所需时间，因此应在选定视野并设置 Z 轴层扫后确定。本实验中，每 30 分钟采样一次，持续五天。实验总时长最长可达 14 天。
4. 生成动态图像：
   1. 在延时成像结束后打开图像文件。本例中使用 Metamorph 软件打开连续采集的图像点。逐帧选择最能清晰显示目标细胞群体的对焦平面。
   2. 将这些图像转换为 .avi 文件，或导出为图像拼接图，以生成可在图像处理软件中打开和分析的一组图像，或使用视频处理软件转换为多种格式。

结果

此处展示了一张图集（图1）和一段视频（图2），演示了典型的耳蜗类器官外植体在E13.5接种后的生长过程。实验使用Sox2报告基因小鼠以显示前感觉区域。视频显示，耳蜗经历了生长以及收敛-延伸过程，绿色Sox2结构域侧向区域的细胞在周围组织扩展时似乎并未发生分裂。这是柯蒂氏器的特征之一：在E13时期，前感觉上皮退出细胞周期，随后被称为非增殖区¹³。另一项延时成像实验聚焦于另一个耳蜗外植体的中基底部（图3和图4），结果显示，随着组织延伸，前感觉区域逐渐变窄。请注意，培养三天后，组织已明显变平，使得单个荧光标记的细胞得以清晰分辨；而在实验初期，由于组织较厚导致光线发生内部反射，仅能识别出表达区域，无法分辨单个细胞。

讨论

在建立培养物以及设置延时显微镜以进行长期成像时，需考虑若干技术要点。

我们使用基底膜基质作为培养耳蜗外植体的基底，但应根据细胞类型选择合适的基底。例如，若要成像神经元培养物，使用纤连蛋白包被可能更为合适。孵育温度和气体组成也应根据组织类型进行选择。选择外植体的发育年龄非常重要。我们最早从胚胎第13天（E13）开始，因为在E12时生长方向较难预测。由于外植体必须在基底上过夜培养以使其充分贴附，因此实验应计划于次日开始。若实验需在E15或更晚阶段开始，则应在E13建立培养，因为随着时间推移，组织会逐渐展平并铺展开，从而使细胞更易于成像（见图3）。

如果需要对柯蒂氏器进行成像，则必须非常小心地解剖耳蜗。若外侧边缘出现切口，会破坏组织内部的张力，因此当耳蜗发生形态重组时，细胞会从撕裂处“溢出”，形成“V”形突起。该突起可能使目标区域移出视野。此外，必须尽可能彻底清除内侧导管顶部的组织。该组织在组织块扩展过程中会持续增殖，并可能生长至目标区域上方，从而遮挡视野。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Dulbecco改良Eagle培养基	Gibco	12430	多个品牌生产此产品
基底膜提取物	康宁	354230	Matrigel。其他供应商也提供类似的替代产品。 http://catalog2.corning.com/Lifesciences/zh-CN/Shopping/Product.aspx?categoryname=细胞培养与生物工艺%28生命科学%29|细胞外基质蛋白ECMs与贴壁因子%28生命科学%29|Matrigel基底膜基质%28生命科学%29
胎牛血清	Gibco	16000044	多个品牌生产此产品 http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results 每页=15&和自动完成=
HEPES	Gibco	5630080	多个品牌生产此产品 http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results 每页=15&和自动完成=
100 x N2添加剂	Gibco	17502-048	多个品牌生产此产品 http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results 每页=15&和自动完成=
环丙沙星	Sigma Aldrich	17850-5G-F	多个品牌生产此产品 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en®ion=CA
Hank's 平衡盐溶液	Gibco	14170161	多个品牌生产此产品。使用前应冷藏。 http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s
精细镊子	精细科学工具	11254-20	5号大小 http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&&CategoryId=29
刮匙	Fine Science Tools	10080-05	1 mm大小  http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&&CategoryId=118
昆虫针	Fine Science Tools	26001-35	必须为不锈钢材质 http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124
50 mm 塑料培养皿	Corning/Falcon	351006	多个品牌生产此产品
活性炭	Sigma Aldrich	05105-250G	多个品牌生产类似产品 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en®ion=CA
184硅胶弹性体	道康宁	SYLGARD® 184 硅酮弹性体试剂盒	培养皿需提前数周自制。  硅胶弹性体可来自任何供应商。http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291
玻璃底培养皿	MatTek	P35G-0-10-C	培养皿的尺寸由成像系统的规格决定。  直径35 mm、10 mm孔、0号盖玻片，适用于Olympus Vivaview FL。 http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath= 1_4_15&products_id=2
体视显微镜	Zeiss	495101-9804-000	Stemi 2000 型号。多个品牌生产类似产品 http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html
冷光源	Zeiss	000000-1063-182	多个品牌生产类似产品 http://microscopy.zeiss.com/microscopy/zh_cn/products/microscope-components/lightsources.html
荧光体视显微镜	Leica microsystems	联系 Leica Microsystems	徕卡 M165-FC。多个品牌生产类似产品 http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/
培养箱显微镜 + 成像软件	Olympus	联系 Olympus	倒置显微镜密封于CO₂培养箱内。Vivaview FL培养箱显微镜，配备专用的Metamorph成像软件。 http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&；c=0
清洁台	赛默飞世尔科技	51029701	多个品牌生产类似产品 http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html
CO2 培养箱	Thermo Scientific	3310	多个品牌生产类似产品 http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html
层流罩	Thermo Scientific	51026651	多个品牌生产类似产品 http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html