小龙虾的腹肢系统：神经索解剖与运动模式细胞外记录的实用指南

摘要

本文介绍了小龙虾腹部神经索的解剖方法。同时，我们还演示了一种电生理学技术，用于记录泳足运动神经元的虚拟运动活动。

摘要

本文展示了小龙虾腹神经索的解剖过程。该制备标本包含最后两个胸神经节（T4、T5）以及由腹神经节（A1至A6）组成的神经节链。该神经节链包含了中枢神经系统（CNS）中控制泳足（swimmerets）协调运动的部分，即泳足系统。已知在小龙虾中，每个泳足均由自身独立的节律性运动模式生成核心驱动，该核心可产生节律性的交替活动，这一现象已有五十多年的研究历史。 ^1-3支配每个游泳足肌肉组织的运动神经元包含两个在解剖结构和功能上截然不同的群体 ⁴一个负责泳足的回缩（动力冲程，PS），另一个驱动泳足的前伸（回复冲程，RS）。泳足系统的运动神经元能够自发产生一种虚拟运动模式，该模式与记录到的模式相同 体内 ¹.

本报告旨在为学生实验课程介绍一种有趣且便捷的模型系统，用于研究节律产生网络以及独立微环路之间的协调。所提供的实验方案包含逐步操作指南，包括小龙虾腹部神经索的解剖、分离出的神经节链的固定、神经节去鞘处理，以及从离体神经系统中细胞外记录游泳足的虚拟运动模式。

此外，我们还可以监测从树突进行细胞内记录的泳足神经元的活动。本文还简要描述了这些技术并提供了一些示例。此外，可利用多种染色技术评估泳足神经元的形态。本文展示了通过离子电泳进行细胞内染料填充的神经元以及泳足运动神经元池的逆向填充示例。在本实验室中，我们利用该制备标本研究虚拟运动的基本功能、感觉反馈对中枢神经系统活动的影响，以及在细胞水平上微环路之间的协调性。

引言

小龙虾的游泳足在姿势控制中起作用，当动物向前游动、通风洞穴或雌性为卵供氧时，游泳足会节律性地摆动^{5, 6}。信号小龙虾（Pacifastacus leniusculus）的游泳足成对出现在第二至第五腹节，腹部每侧各有一肢⁷。中枢神经系统自身即可产生节律性运动模式，驱动完整动物以及离体神经索制备中的游泳足运动。当不存在感觉反馈或下行输入时，所产生的节律性运动模式称为虚构运动^{1, 2}。在游泳足系统中，该运动模式在任何参数上均与完整动物中测得的游泳足活动无差异。

每个腹肢的运动均由一个位于并局限于相应半体神经节内的微环路驱动^{1 - 3}。每个微环路中包含一个模式生成核心，该核心由五个已鉴定的非尖峰中间神经元组成。这些中间神经元在功能上可被归类为动力冲程抑制神经元（Inhibitor of Power Stroke, IPS）或回程冲程抑制神经元（Inhibitor of Return Stroke, IRS）⁸。这些IPS和IRS中间神经元并非内在振荡器，其交替活动由相互抑制驱动⁹。由于这些中间神经元直接抑制腹肢运动神经元，从而产生交替的动力冲程-回程冲程运动¹⁰。然而，运动不仅需要产生神经活动，还需要协调各个独立的微环路。在腹肢系统中，这种协调由协调性微环路实现，该环路确保各附肢在正确的时间处于活动状态。该微环路由....

方案

该解剖程序符合欧洲共同体理事会2007年2月22日颁布的第2007/52/EC号指令^nd 2010年9月（2010/63/EU）

1. 准备

1. 获取两种性别的小龙虾 Pacifastacus leniusculus (Dana)，体长均不小于 8 cm。确保动物状态活跃，腹部及腹肢完整无损。
2. 仔细检查头胸甲，确保其外骨骼坚硬且坚固。蜕皮前和蜕皮后的个体头胸甲较软，不适合用于实验，因为在蜕皮过程中许多参数会发生变化（例如，运动活动减少）。
3. 准备解剖、固定和剥离神经索过程中所需的所有工具和材料，如 图 2 所示，并参见补充材料中的列表。

图 2：用于神经索解剖、固定和去鞘的材料与工具。

（1）装满冰的....

结果

通过同时记录RS和PS一个神经节的运动神经元的胞外信号，可以监测这些运动神经元群的交替活动（图18），从而反映虚拟运动模式。

图 18： 一个神经节及其差分针电极放置位置的示意图。 RS运动神经元（上迹线）和PS运动神经元（下迹线）的细胞外记录。

同侧PS 2至PS 5运动神经元的细胞外PS活性凸显了泳足系统中节间协调的有趣特征（图19A）。

首先，该活动总是以 A5 中的 PS 爆发开始图19A, 4

讨论

先前已对小龙虾的解剖结构及其腹部神经节进行过描述^{5, 18, 19, 20}，建议在进行解剖前先熟悉这些结构，以避免切断重要神经。

必须将制备过程的温度保持在23 °C以下，以防止分离的腹神经索降解。通过每隔20–30分钟用冰冷的螯虾生理盐水更换灌流液，可轻松实现这一条件。在此情况下，神经节链可用于电生理实验长达12小时。

有时，游泳足运动神经元处于不活跃状态，不表现出自发性爆发活动。可使用胆碱能激动剂卡巴胆碱诱导此类制备样本产生爆发活动。将1-3 µM卡巴胆碱溶解于冰冷的螯虾生理盐水中，通过灌流施加即可足以激活游泳足节律²¹。

该系统中记录的假性运动，尤其是肢体协调性，为节律性活动和协调的细胞特性提供了大量信息。在此系统中，局部微环路的神经元组分^8-10已被鉴定，且协调网络在细胞水平上的详细结构也已明确^11,14,15。通过细胞外记录实验获得的结果，已可用于数学模型的构建以及为机器人学.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4通道细胞外放大器：MA 102	放大器	电子实验室，动物学，Universität zu Kö德国
防震台		Technical Manufacturing Corporation （TMC），美国马萨诸塞州皮博迪市 AMETEK 超精密技术公司旗下单位	63-534
Axon Digidata 1440A	数位仪	Axon Instruments，Molecular Devices 设计，Union City，CA	DD1440A
大桶
Clampex &和 Clampfit	pClamp 10，记录与分析软件	Molecular Devices 公司，美国加利福尼亚州联合市	pClamp 10 标准版
冷光源灯	带柔性导光管（光纤束）	Euromex 显微镜，荷兰阿纳姆，BD	LE.5211 & LE.5235
计算机和显示器	配备记录软件
液体废料容器和移液器
小龙虾生理盐水	含有（单位：mM）：5.4 KCl、2.6 MgCl₂、13.5 CaCl₂ 和 195 NaCl，用 10 mM Tris 碱和 4.7 mM 马来酸缓冲；通气 3 小时。调节 pH 至 7.4。
右旋糖酐，德克萨斯红（3000MW，赖氨酸可固定）	荧光染料，可被赖氨酸固定的	Life Technologies GmbH，德国达姆施塔特	D3328
解剖皿	（长×宽×高）15×7×5 cm；内衬黑色硅胶
法拉第笼
固定针
镊子（生物用，Dumont #5）	镊子：生物学用，尖端尺寸 0.05 × 0.02 mm，长度 11 cm，INOX	Fine Science Tools (FST)，德国	11252-20
镊子（生物学用，Dumont #55）	镊子：生物学用，尖端尺寸 0.05 × 0.02 mm，长度 11 cm，INOX	Fine Science Tools (FST)，德国	11255-20
镊子（电子，Dumont #5）	镊子：标准型，尖端 0.1 x 0.06 mm，长度 11 cm，INOX	Fine Science Tools (FST)，德国	11251-20
细胞内电极	含丝硼硅酸盐玻璃毛细管（外径/内径：1 mm/0.5 mm）	Sutter Instruments，诺瓦托，加利福尼亚州	BF100-50-10
Leica S8 Apo StereoZoom	解剖显微镜                       放大倍数 1x - 8x	Leica，德国	10446298
显微镜载物台
镜像	从下方照亮标本
建模黏土
奥林巴斯 SZ61	解剖显微镜                       0.67倍 - 4.5倍缩放	德国 Olympus
培养皿	94 x 16 mm；内衬透明硅胶	Greiner bio-one，德国	633180
环形剪刀	锐利/钝头，直剪：13厘米	Fine Science Tools (FST)，德国	14054-13
弹簧剪或替代工具：Vannas 弹簧剪	锋利边缘：8 mm，尖端直径：0.2 mm，直头：10 cm；或锋利边缘：2.5 mm，尖端直径：0.075 mm，直头：8 cm	Fine Science Tools (FST)，德国	15024-10 或          15000-08
学生万纳斯  弹簧剪或替代工具：  莫里亚弹簧剪	锋利边缘：5 mm，尖端直径：0.35 mm，直头：9 cm 或锋利边缘：5 mm，尖端直径：0.1 mm，直头：8 cm	Fine Science Tools (FST)，德国	91500-09 或           15396-00
硅胶	184 硅胶弹性体基础剂与固化剂；用于配制黑色硅胶时需添加活性炭	道康宁公司，密歇根州米德兰，美国
装有石蜡油并配有20号钝头斜针的注射器