小龙虾的腹肢系统：神经索解剖与运动模式细胞外记录的实用指南

摘要

本文介绍了小龙虾腹部神经索的解剖方法。同时，我们还演示了一种电生理学技术，用于记录泳足运动神经元的虚拟运动活动。

摘要

本文展示了小龙虾腹神经索的解剖过程。该制备标本包含最后两个胸神经节（T4、T5）以及由腹神经节（A1至A6）组成的神经节链。该神经节链包含了中枢神经系统（CNS）中控制泳足（swimmerets）协调运动的部分，即泳足系统。已知在小龙虾中，每个泳足均由自身独立的节律性运动模式生成核心驱动，该核心可产生节律性的交替活动，这一现象已有五十多年的研究历史。 ^1-3支配每个游泳足肌肉组织的运动神经元包含两个在解剖结构和功能上截然不同的群体 ⁴一个负责泳足的回缩（动力冲程，PS），另一个驱动泳足的前伸（回复冲程，RS）。泳足系统的运动神经元能够自发产生一种虚拟运动模式，该模式与记录到的模式相同 体内 ¹.

本报告旨在为学生实验课程介绍一种有趣且便捷的模型系统，用于研究节律产生网络以及独立微环路之间的协调。所提供的实验方案包含逐步操作指南，包括小龙虾腹部神经索的解剖、分离出的神经节链的固定、神经节去鞘处理，以及从离体神经系统中细胞外记录游泳足的虚拟运动模式。

此外，我们还可以监测从树突进行细胞内记录的泳足神经元的活动。本文还简要描述了这些技术并提供了一些示例。此外，可利用多种染色技术评估泳足神经元的形态。本文展示了通过离子电泳进行细胞内染料填充的神经元以及泳足运动神经元池的逆向填充示例。在本实验室中，我们利用该制备标本研究虚拟运动的基本功能、感觉反馈对中枢神经系统活动的影响，以及在细胞水平上微环路之间的协调性。

引言

小龙虾的游泳足在姿势控制中起作用，当动物向前游动、通风洞穴或雌性为卵供氧时，游泳足会进行节律性摆动^{5, 6}。信号小龙虾（Pacifastacus leniusculus）的游泳足成对出现，位于腹部第二至第五节，腹部每侧各有一肢⁷。中枢神经系统能够自主产生节律性运动模式，驱动完整动物以及离体神经索制备中的游泳足运动。当不存在感觉反馈或下行输入时，所产生的节律性运动模式被称为拟态运动^{1, 2}。在游泳足系统中，该运动模式在任何参数上均与完整动物中测得的游泳足活动无差异。

每个游泳足的运动由一个位于并局限于相应半神经节内的微环路驱动^{1 - 3}。在每个微环路中，存在一个模式生成核心，该核心由五个已鉴定的非放电中间神经元组成。这些中间神经元在功能上可被定义为动力冲程抑制神经元（Inhibitor of Power Stroke, IPS）或回程冲程抑制神经元（Inhibitor of Return Stroke, IRS）⁸。这些IPS和IRS中间神经元并非内在振荡器，其交替活动由相互抑制驱动⁹。由于这些中间神经元直接抑制游泳足运动神经元，从而产生交替的动力冲程（PS）与回程冲程（RS）运动¹⁰。然而，运动不仅需要产生神经活动，还需要协调各个独立的微环路。在游泳足系统中，这种协调由协调微环路实现，该环路确保各肢体在正确的时间激活。该微环路由每个体节中的三个已鉴定神经元构成^11-15。

本方案首次提供了分离神经节链（T4至A6，图1）的逐步解剖指南。我们展示了如何将分离的腹神经索固定，并逐个去除每个神经节的鞘膜。在此分离的神经系统制备中，控制 swimmeret 运动的神经元已处于适合进行电生理学和形态学实验的状态。本方案的第二部分演示了 swimmeret 运动模式的主要特征，包括细胞外记录 swimmeret 运动神经元活动的逐步操作指南。RS运动神经元的轴突经由神经N1的前支投射，而PS运动神经元的轴突则经由同一神经的后支投射（图1）⁴。因此，可使用差分针电极从这些分支记录其神经活动。

图 1： 从第4胸神经节（T4）至第6腹神经节（A6）分离出的神经系统及其示意图。 T4：第4胸神经节；T5：第5胸神经节；A1、A2 … A6：第1腹神经节、第2腹神经节 … 第6腹神经节；N1：N1神经；N2：N2神经；N3：N3神经；PS：动力冲程；RS：复位冲程。方向缩写： A = 前侧；P = 后侧。

该解剖操作及所展示的电生理技术对本科生而言较为简便，可作为生理学实验课程的有益补充。离体神经节链已被广泛应用于多项实验，用于研究神经系统功能、运动节律的协调或泳足微回路的调节机制⁶，以及运动过程中适应性行为的神经调控机制^{16, 17}。因此，螯虾泳足系统提供了大量富有价值的教学与训练机会，而这些研究均始于螯虾腹神经索的解剖及假性运动模式的细胞外记录。

方案

该解剖操作程序符合欧洲共同体理事会22日颁布的指令^nd 2010年9月（2010/63/EU）

1. 准备

1. 获取两种性别的小龙虾 Pacifastacus leniusculus (Dana)，体长均不小于 8 cm。确保动物状态活跃，腹部及腹肢完整无损。
2. 仔细检查头胸甲，确保其外骨骼坚硬且坚固。蜕皮前和蜕皮后的个体头胸甲较软，不适合用于实验，因为在蜕皮过程中许多参数会发生变化（例如，运动活动减少）。
3. 准备所有用于解剖、固定和剥离神经索的工具和材料，如 图 2 所示，并参见补充材料中的列表。

图 2：用于神经索解剖、固定和去鞘的材料与工具。

（1）装满冰的大桶；（2）螯虾生理盐水；（3）生理盐水分配器；（4）解剖显微镜；（5）解剖皿；（6）高强度剪刀；（7）镊子；（8）弹簧剪刀；（9）内衬透明硅胶的培养皿；（10）固定针；（11）冷光源灯。

2. 大体解剖

1. 将动物置于冰上麻醉15–20分钟。由于解剖过程包含放血步骤，且标本在操作过程中需定期用螯虾生理盐水冲洗，因此前半部分的大体解剖应在靠近水槽的实验台面上进行。
2. 将动物腹面朝上固定，使用锋利的剪刀在靠近胸部的位置从基部剪除两侧螯足（图3-1）。移除左右尾肢（uropod）图3-2).
3. 将动物腹面朝上置于铺有黑色硅胶的解剖皿中。通过在头胸部下方插入冰块将其抬高，并在尾节处固定腹部。图4A).
4. 用约 60 ml 冰冷的螯虾生理盐水填充生理盐水分配器。通过螯足开口用冷生理盐水灌注螯虾。图4B）。多余的生理盐水将通过尾肢上的切口流出。在放血过程中用冰覆盖螯虾
5. 使用锋利的剪刀在动物眼睛后方稍远处进行一次横向切割，将动物断头图5A）。按图示移除靠近基部关节的所有步足 图 5B.
6. 用最后一段胸节将腹部与头胸部的其余部分分离。在第二对步足（第三胸节）水平处进行第一刀，将剪刀尖插入第二对步足的开口，剪至对侧。图6A-1).
7. 将这一刀口沿头胸部向两侧延伸图 6A-2).
8. 将动物体翻开，使部分内脏器官可见。推动明显的消化腺（图6B-3将标本的前部朝上，用镊子从腹腔中移除生殖器官。
9. 去除头胸部的前部图6C）。使用侧向切口切除覆盖鳃部的甲壳两侧部分，操作于剩余胸甲的两侧图 6D-4）。去除鳃部，并用冷生理盐水冲洗标本。
10. 沿胸板全长进行切割，如图所示继续解剖 图 6E-5在pleuron与游泳足之间的最外侧位置进行切割图6E 红色标记处）。在另一侧进行相同的切口。用冷生理盐水冲洗标本。
11. 在解剖显微镜下进行后续解剖操作。将 crayfish 的腹部朝上放置于铺有黑色 Sylgard 的解剖皿中，并加入 crayfish 生理盐水，使液体浸没标本。
    注意：以下步骤（2.12–4.8）中的操作方向说明适用于惯用右手的实验者。在后续步骤（2.12–6.8）中，需每隔20–30分钟定期更换冷水生理盐水，以维持神经系统的健康状态。
12. 用昆虫针在尾节后端和头胸甲残余前端固定标本。将标本放置成尾节指向左侧，并与桌面边缘平行。
13. 用左手持粗镊子，从步足的开口处穿过图7A）并拉开样本（图7B 白色箭头）。辨认出两条较大的背侧屈肌肌束（图7B-1 和 C-1）并按图示方式切开其腹侧基部 图7B.
14. 识别胸廓内动脉（图 7C-2），从背侧（心脏）向腹侧下降，位于第4^th 胸节。该动脉位于神经索正上方（图 7C-3），然后在神经索下方延伸，形成腹动脉。
15. 横断胸骨动脉。如图所示 图7C先用剪刀的一侧刀片抬起动脉，只有在腹侧的神经索可见时才进行切割。
16. 将背侧屈肌固定在前方（右侧）。应使用大头针在肌肉最大程度拉伸的位置进行固定，以确保不妨碍视野，且标本保持拉伸状态。当背侧肌束被固定后（图8-1)，第一腹神经节A1和A2及其相关神经N1、N2和N3清晰可见（图8).
17. 用左手持镊子夹住标本的一侧步足开口处。在后续解剖步骤中，轻轻牵拉以保持标本开口。
18. 在距离神经索最远的位置横切 N3 神经。图 8-3).
19. 如图所示，在靠近腹侧附着点处切断屈肌 图8-4注意避免损伤神经索或N2神经。
20. 对 N3 神经及剩余腹神经节 A2 至 A5 的屈肌重复执行步骤 2.18 和 2.19。
21. 在最后一对腹神经节 A6 处，从腹侧骨片上剪断背侧屈肌，标本应呈现如下所示的形态 图9.
22. 在第六腹节（A6）神经后方切断胸骨板图9-1）并保留腹侧部分（图9-2）。弃去带有屈肌的背侧部分（图9-3用针穿过步行足的开口将胸板前部固定，并将其后部固定至A6。

3. 精细解剖

1. 将标本置于显微镜下，使前端朝远离操作者方向，后端朝向实验台边缘。
2. 如图10A所示，使用镊子移除头胸部腹甲最前端的部分。
   注意：胸神经节及其相关神经部分被步足肌肉和头胸部腹甲覆盖。头胸部腹甲构成一个骨架结构，将外侧的步足腔彼此之间以及与中央容纳腹神经索的腔分隔开来。
3. 按照图10B-1 和 B2 所示位置，切断残留外骨骼结构之间的肌肉。用镊子夹住并轻轻提起腹神经索的前端（图10C）。
   注意：此过程中神经索可能受损，因此应避免多次夹取神经索。
4. 在提起神经索的同时，从侧面切断胸神经（图10C-3）。保留这些神经至适合固定的长度。通过切除T4节段之前的所有组织，去除曾用镊子夹持而受压的神经节链部分（图10C-4）。
5. 将标本摆放为前端在左侧，聚焦于A1节段。将A1的N1和N2神经切断至适合展开固定的长度（最长1 cm）。
6. 聚焦于A2节段，识别该节段的N1、N2和N3神经（图11）。A2-A5腹神经节的N1神经位于每节段两个腹甲角质层内褶之间（图11A-1），并被肌肉组织覆盖。沿后侧腹甲角质层内褶做一切口，从腹部外侧边缘开始，向中线方向进行，如图11A所示。
7. 如果目标N1神经仍被组织覆盖，如图11B（红色箭头）所示，则横切肌肉束，但此次切口位于两个腹甲角质层内褶及N1神经的前方（图11B-2）。
8. 尽可能远端地切断N1神经（图11C-3）。此时N1神经完全可见，可辨认其前支和后支（图11C）。
9. 转向对侧的N1神经，首先从腹甲角质层后侧内褶处切断肌肉，起始于靠近神经节的中线位置（图11D）。如果神经仍被组织覆盖，则参照图11B-2的方式，在两个腹甲角质层内褶及N1神经前方横切肌肉束。尽可能远端地切断N1神经。
10. 将该神经节的N2神经切断至适合固定的长度（约0.5 cm）。
11. 对A3-A5节段的神经重复步骤3.7–3.11。
12. 尽可能远端地切断A6神经节的神经（图12A）。使用镊子夹住A6的多条神经以提起该神经节，并开始将神经节链从腹甲板上分离。
13. 在提起神经索的同时，如图12B（白色箭头）所示，轻柔地向前（前端方向）牵拉。随着各个神经节被提起，清除可能附着在神经索腹面的腹动脉（图12C）。持续进行这种轻柔的牵拉-切割操作，直至神经索完全分离。
14. 将分离出的神经节链转移至内衬透明硅胶并盛有螯虾生理盐水的培养皿中（图12D）。

4. 将神经索固定在培养皿中

注意：使用从不锈钢丝上剪下的细小图钉（参见补充材料）固定神经索。用镊子仅接触神经末梢，不要挤压神经连合或神经节。

1. 将神经节链拉直并用大头针固定，同时施加轻柔的拉伸。
2. 将神经索置于培养皿中，背侧朝上（图13，黑线）。神经节的腹侧可通过其凸起特征识别；背侧则较平坦。将胸部神经固定于两侧。继续处理第6腹节（A6）的神经，沿神经索的纵轴方向进行拉伸。
3. 将第1腹节（A1）的神经以与神经索成90°角的方向展开并固定。
4. 进行至第2腹节（A2），将N2神经以与神经索成35–45°角的方向固定（图1A）。
5. 在固定前，参照图14所示方法，将N1神经的前支和后支分开。使用两对精细镊子，一对夹住N1神经的前支，另一对夹住后支，注意仅夹取神经分支最远端的部分，然后小心地将其拉开。
6. 将N1神经的前支以与神经索成90°角的方向固定（图1A）；将N1神经的后支固定于前支与N2神经之间。
7. 对第3至第5腹节（A3–A5）神经节的神经重复步骤4.4–4.6。在固定神经索的同时，沿纵向和横向进行拉伸。

5. 去除神经节的鞘膜

1. 将标本放置妥当，使实验者的双手始终 resting 在一个稳定的平面上，以避免抖动。为了剥离神经节的鞘膜，需从下方照亮腹神经索。
2. 聚焦于任一腹部神经节 A1 至 A5。使用精细弹簧剪刀，在神经节后方、神经 N2 与 N3 之间，通过神经节鞘膜做一小的侧向切口（图 15A 红色箭头所示）。
3. 用极细的镊子夹起神经节鞘膜，并在连索上方横向剪开鞘膜，如 图 15A-1 所示。注意不要用剪刀挤压或剪断神经索。
4. 继续用镊子夹住并提起神经节鞘膜，沿神经节的侧缘继续剪开（图 15B-2 和 -3 所示）。完全移除鞘膜；或 alternatively 将其固定在连索两侧，使其固定但不压迫神经索。
5. 对所有腹部神经节 A1 至 A5 重复步骤 5.2–5.4。
6. 以类似方式剥离胸部神经节及神经节 A6 的鞘膜。剥离 A6 时，应从神经节前方开始，向后方推进。将 A6 的鞘膜固定在神经节链的后端。

6. 运动神经元的细胞外记录

1. 组装进行细胞外记录所需的所有工具和材料，这些工具和材料如图16B所示，并在补充材料中列出。图16A展示了记录装置的概览。开启本实验中使用的所有电子设备（图16C），以便放大器在记录前至少预热30分钟。打开计算机并启动记录软件。
2. 将神经节链放置在显微镜载物台上，并从下方照明。将记录电极插入靠近目标神经的硅胶中，参考电极则插入神经节附近但侧向的位置（图17A和B）。将目标神经弯曲绕过记录电极（图17C）。
3. 轻微拉伸神经，以确保电极与神经之间良好接触，并用固定针将其固定在侧边（图17D）。使用橡皮泥将电极导线固定在显微镜载物台上，使其保持在理想位置。
4. 使用装有石蜡油、带有圆头的20号针头的注射器（图17E-3），将目标神经与灌流液隔离。首先在记录电极周围的硅胶上点涂一些石蜡油，形成一层覆盖记录电极附近硅胶表面的石蜡油层（图17E-4）。注意不要直接涂抹在神经上，并避免该层中产生气泡。
5. 从四周用石蜡油将记录电极密封，直至与生理盐水液面齐平（图17F）。
6. 对所有需要监测其活动的目标神经重复此操作。
7. 开始记录。采用连续或无间断采集模式，采样频率设为5 kHz。将细胞外放大器设置为以下参数：增益为1,000（信号放大1,000倍，注意在采集软件设置中包含此放大参数），带通滤波范围为300 Hz（低切）至2,000 Hz（高切）。

结果

通过同时记录RS和PS一个神经节的运动神经元的胞外信号，可以监测这些运动神经元群的交替活动（图18），从而反映虚拟运动模式。

图18： 一个神经节及其差分针电极放置位置的示意图。 RS运动神经元（上迹线）和PS运动神经元（下迹线）的细胞外记录。

同侧PS 2至PS 5运动神经元的细胞外PS活性凸显了泳足系统中间节段协调的有趣特征（图19A）。

首先，该活动总是以 A5 中的 PS 爆发开始图19A, 4

讨论

先前已对小龙虾的解剖结构及其腹部神经节进行过描述^{5, 18, 19, 20}，建议在进行解剖前先熟悉这些结构，以避免切断重要神经。

必须将制备过程的温度保持在23 °C以下，以防止分离的腹神经索降解。通过每隔20–30分钟用冰冷的螯虾生理盐水更换灌流液，可轻松实现这一条件。在此情况下，神经节链可用于电生理实验长达12小时。

有时，游泳足运动神经元处于不活跃状态，不表现出自发性爆发活动。可使用胆碱能激动剂卡巴胆碱诱导此类制备样本产生爆发活动。将1-3 µM卡巴胆碱溶解于冰冷的螯虾生理盐水中，通过灌流施加即可足以激活游泳足节律²¹。

该系统中记录的假性运动，尤其是肢体协调性，为节律性活动和协调的细胞特性提供了大量信息。在此系统中，局部微环路的神经元组分^8-10已被鉴定，且协调网络在细胞水平上的详细结构也已明确^11,14,15。通过细胞外记录实验获得的结果，已可用于数学模型的构建以及为机器人学...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4 通道蜂窝外放大器： MA 102	放大器	Elektroniklabor， Zoologie， Universität zu Köln，德国
air-table		Technical Manufacturing Corporation （TMC） 是 AMETEK Ultra Precision Technologies 的一个部门，皮博迪，马萨诸塞州，美国	63-534
Axon Digidata 1440A	数字化仪	Axon Instruments，Molecular Devices Design，加利福尼亚州联合市	DD1440A
大桶
Clampex 和Clampfit	pClamp 10，记录和分析软件	Molecular Devices Design，加利福尼亚州联合市	pClamps 10 标准
冷光源	，带柔性光导（光纤束）	Euromex 显微镜 holland， Arnhem， BD	LE.5211 &LE.5235
计算机和显示器	，配备记录软件
容器和液体废物移液器
小龙虾盐水	包含（以 mM 为单位）：5.4 KCl、2.6 MgCl2、13.5 CaCl2 和 195 NaCl，用 10 mM Tris 碱和 4.7 mM 马来酸缓冲;充气 3 小时。在 pH 值为 7.4 时调节。
葡聚糖，德克萨斯红（3000MW，赖氨酸固定）	荧光染料，赖氨酸固定	Life Technologies GmbH，德国达姆施塔特	D3328
解剖皿	（长 x 宽 x 高）15x7x5 厘米;衬有黑色硅胶
法拉第笼
固定销
镊子（生物学，杜蒙 #5）	镊子：生物学，尖端 0.05 x 0.02 毫米，长度 11 厘米，INOX	Fine Science Tools （FST），德国	11252-20
镊子（生物学，杜蒙 #55）	镊子：生物学，尖端 0.05 x 0.02 毫米，长度 11 厘米，INOX	精细科学工具 （FST），德国	11255-20
镊子（电子，Dumont #5）镊	子：标准，尖端 0.1 x 0.06 毫米，长度 11 厘米，INOX	精细科学工具 （FST），德国	11251-20
细胞内电极	硼硅酸盐玻璃毛细管（外径/内径：1 毫米/0.5 毫米），带细丝	Sutter Instruments，诺瓦托，CA	BF100-50-10
徕卡 S8 Apo 立体变焦	解剖显微镜                      变焦 1 倍 - 8 倍	徕卡，德国	10446298
显微镜台
镜	，从下方
奥林巴斯 SZ61	解剖显微镜                      变焦 0.67 倍 - 4.5 倍	奥林巴斯，德国
培养皿	94 x 16 毫米;内衬透明硅胶	Greiner bio-one，德国	633180
环形剪刀	ThoughCut，切削刃：锋利/钝，直：13 厘米	精细科学工具 （FST），德国	14054-13
弹簧剪刀或替代品：Vannas 弹簧剪刀	切割边缘：8 毫米，尖端直径：0.2 毫米，直：10 厘米或切割边缘 2.5 毫米，尖端直径 0.075 毫米，直：8 厘米	精细科学工具 （FST）， 德国	15024-10 或         15000-08
学生 Vannas  弹簧剪刀或替代品：Moria 弹簧剪刀	切割边缘：5 毫米，尖端直径：0.35 毫米，直：9 厘米或切割边缘：5 毫米，尖端直径 0,1 毫米，直：8 厘米	精细科学工具 （FST），德国	91500-09 或          15396-00
sylgard	184 有机硅弹性体基料和固化剂;对于黑色 sylgard，添加活性炭	道康宁公司，美国密歇根州米德兰市
，填充有凡士林，并配备 20 焦针头，带圆头