使用静态箱法测定农业土壤温室气体通量

摘要

本文展示了基于静态箱法测量土壤系统温室气体通量的方法。通过相对较低的基础设施投入，可在多个处理组/地点以及从数小时到数年的不同时间尺度上获取测量数据。

摘要

测量受管理与非管理生态系统的土壤与大气之间的温室气体（GHG）通量，对于理解气候变化的生物地球化学驱动因素，以及基于调控景观管理措施的温室气体减排策略的制定与评估至关重要。本文所述的静态箱法，其原理是通过密闭箱体捕获土壤表面排放的气体，并定期采集箱体顶空中的气体样品，利用气相色谱法进行分析。通过气体浓度随时间的变化计算通量。该方法可用于测量基于景观尺度的二氧化碳、一氧化二氮和甲烷的通量，评估不同处理间的差异，或探究系统在不同季节或年份的动态变化。该方法对基础设施要求较低，但需要严谨的实验设计。该方法易于在野外部署，符合既定的技术规范，所获得的数据适用于大规模的温室气体排放研究。

引言

在努力减缓人类活动对温室效应影响的过程中，理解人类活动和自然系统对大气辐射特性的贡献是一个至关重要的研究领域。除了二氧化碳（CO₂）之外，氧化亚氮（N₂O）和甲烷（CH₄）也是强效的温室气体，分别约占全球变暖效应的7%和19%，其中大部分排放来源于陆地景观源^1,2。这些来源包括农业田地、水稻田和垃圾填埋场等人为管理的系统，以及森林地表、湿地和白蚁丘等自然系统。准确测量基于陆地景观的温室气体排放，对于支持科学建模、理解气候变化的驱动因素以及识别减排机会至关重要。

多种温室气体测量方法各有其优势与局限性^2-5。质量平衡法依赖于风驱动的气体扩散，适用于测量填埋场和畜牧放牧区等小范围、边界明确的排放源的通量。微气象学方法（如涡动协方差法）基于对垂直气体通量的实时直接测量，可实现对大范围区域的直接观测。然而，这类方法隐含地假设了源区地形的均质性（因为测量结果反映的是研究区域的平均值），且高昂的基础设施成本可能限制其应用范围。最后，基于密闭箱的方法通过采集地表上方有限空间内的气体样品，监测土壤表面气体浓度的变化。该方法可用于小面积区域和多种处理条件下的测量，但由于土壤气体通量存在空间异质性，其测量结果通常具有较高的变异系数。

本文讨论了基于腔室测量的最常见且易于实施的方法，即使用无气流通过的密闭腔室，通常称为“静态”或“非稳态无气流”腔室。该方法通过带通气孔的腔室捕获土壤表面的气体排放，并通过测量腔室顶空内气体浓度随时间的变化来确定通量速率。静态腔室技术已广泛应用于人工管理和自然景观中，构成了大部分土壤源温室气体通量数据的基础，尤其是N₂O^6,7的测量。该方法特别适用于研究小型实验小区、地形多变的多个不同地点，或在无需大量基础设施投入的情况下需考察多个独立位置的情形。典型的实验应用包括探索替代性景观管理措施及其对土壤源CO₂、N₂O和/或CH₄排放的影响，研究在人为模拟气候变化情景（如增温、降雨排除或补充）下的景观尺度通量动态，或对自然与农业生态系统及其子系统进行描述性研究。

作为温室气体测量和通量估算的关键工具，静态箱法已得到充分评估，人们在技术标准化和数据报告规范化方面已做出大量努力^4,6,8,9。其中尤为突出的是美国农业部农业研究局农业碳增汇网络（GRACEnet）⁸和全球农业温室气体研究联盟（GRA）⁹发布的详细综述和指导文件。这些指南为协调工作提供了宝贵的资源和平台，因为最终来自大量研究的数据互操作性对于将局部发现扩展到全球模型，以及将研究成果转化为可行的减排策略至关重要。

GRACEnet、GRA 以及其他综述也强调，基于静态箱法的温室气体通量测量技术具有高度多样性，在几乎每个操作步骤中都可能存在显著的方法学差异，包括箱体设计、时空布设、采样体积、样品分析以及通量计算等环节。本文所述方法仅为其中一种可行方案，同时展示了生成高质量、广泛适用数据的最佳实践，并指出了关键注意事项。本方法旨在为该标准化流程提供易于理解的概述，并作为进一步探索文献中所描述的各种细微差异与变异形式的平台。

方案

1. 腔室构建与锚定装置安装

1. 设计并制作测量室——每个测量室由一个插入土壤中的底座和一个在测量气体通量时放置于底座上方的顶盖组成——以满足实验需求。
   1. 在设计测量室的形状和尺寸时，需考虑空间因素，如作物行距、肥料或粪肥条施位置以及植株高度。由于底座突出于土壤表面可能导致微气候效应和积水现象，应尽量使顶盖贴近土壤表面。鉴于测量室高度与检测灵敏度之间存在权衡关系，应根据所研究系统的实际情况，将顶盖设计得尽可能短但可行。
   2. 测量室应采用坚固且惰性的材料（如不锈钢或PVC）建造，并配备将顶盖密封到底座的装置。顶盖应进行隔热处理，并覆盖浅色或反光材料，以防止测量过程中热量积聚。应设置隔膜以便采集气体样品，并安装通气管，以避免在放置测量室和取样过程中产生压力扰动。更多细节请参见材料表、Parkin 和 Venterea⁸，以及 Clough et al¹⁰。
2. 至少在采样前1天，将测量室底座安装到预定的土壤位置。安装方法取决于测量室的设计，但通常应均匀施力，确保底座不会扭曲或破坏土壤结构。根据土壤类型、部署时长和测量室体积^6,11，将底座插入土壤深度2.5–13 cm。底座露出土壤表面的部分应尽可能少，不超过5 cm。

2. 校准与实验设计

注意：在开始实验之前，请遵循以下步骤确定合适的取样时间进程，以便将数据拟合到适当的线性或非线性通量模型（参见 Parkin 等¹²）。这需要使用步骤3-5中所述的技术（野外采样、样品分析和数据分析）。最佳采样时机取决于所研究的系统以及所用采样箱的尺寸，可能需要进行若干次尝试与调整。参见Venterea¹³ 以获取替代方法。

1. 校准采样与分析
   1. 在预计会产生较高痕量气体通量的环境或管理条件下，按照第3节所述技术进行密集采样。采用时间点间隔较短的采样方式，建立持续时间长于常规水平的时间序列。首先，在一小时内对若干代表性密闭箱体进行5–10个等时间间隔的采样。
   2. 按照第4节所述方法，使用气相色谱法分析样品。
2. 校准结果解读
   1. 针对每组校准时间序列及每种目标气体，绘制浓度随时间变化的曲线图。
   2. 确认通量速率处于预期范围的较高水平。通量计算方法见第5节。若遇问题，请参考第2.3节的故障排查建议。
   3. 检查图表中是否存在非线性迹象，或更具体地说，气体浓度随时间趋于平台期的现象。
      注：不同气体类型开始出现平台期的时间点各不相同，其取决于土壤中气体生成或消耗的速率、密闭箱体顶空中的气体浓度以及两个区域之间的扩散情况。因此，该时间点受密闭箱体高度的显著影响，箱体越矮，达到平台期所需时间越短。
   4. 利用校准数据集确定实验系统中密闭箱体部署的最佳时长。若数据分析将采用线性回归法（如本方案第5节所述），应选择能够使所有目标气体/系统的浓度与时间之间尽可能保持线性关系的采样时长，同时确保时间序列内至少包含三个、最好四个采样时间点⁶。对于高度为10–30 cm、用于测量CO₂和N₂O的密闭箱体，时间序列通常持续20–60分钟^8,14。
3. 校准故障排查
   1. 若气体浓度变化差异不明显和/或难以判断线性或平台期特征，可采用更密集的校准时间点或延长校准时间序列，并检查浓度是否处于检测限范围内。对于通量较低的情况，在测试时间段内可能无法观察到累积速率的下降，此现象无需担忧。
   2. 若通量未达到预期实验范围的较高水平，应重新进行校准，通过改变处理方式或环境条件（例如施用肥料或灌溉）以诱导更高的通量。或者，在实验设计中至少设置四个时间点，以便在实验通量显著高于校准期间观测值并出现平台期时，可剔除后期时间点，但仍保留至少三个时间点用于线性回归分析。也可采用曲线回归方法。
4. 实验设计
   1. 根据第2.2.4节确定的最佳采样时长，制定整体采样方案，涵盖所有相关样地、处理方式和/或重复组，并确保人员能够高效地依次完成各密闭箱体的采样。如有必要，可将采样点划分为若干“轮次”，依次进行采样。
      1. 若需使测量结果代表全天情况，应在日间温度相对于极端值较为适中的时段进行采样。在典型的温带作物系统中，最佳采样窗口为上午中后期。
      2. 若需进行连续多轮采样，应注意避免因每天在同一时段重复采样相同处理组而引入偏差。应以重复组块为单位构建采样轮次，而非按处理方式逐一采样。
      3. 根据实际情况，在轮次内或轮次前后预留足够时间进行必要的辅助测量。（典型辅助测量项目见第3.3节。）
      4. 可选：预留时间采集环境空气样品，用于非线性通量模型分析，或作为初始（零时，“T₀”）浓度的近似值（本文未详述）。
      5. 可选：在采样时预留时间将参考气体注入小瓶，用于评估样品在采样与分析期间可能发生的降解情况。有关样品储存注意事项，请参见Parkin和Venterea⁸的研究。
   2. 根据研究目标确定通量测量的频率。该频率可从单次测量到每日、每周或数月乃至数年内的周期性测量不等。有关实验设计的详细讨论，请参见Rochette et al.¹⁴ 的文献。
   3. 若需在低温条件下采集样品，应计划配备加热装置（如暖包）与样品小瓶一同使用，以防止隔垫变脆。

3. 野外采样

注意：每次采样日期均需遵循第2.4节中建立的采样方案，并采用下述技术进行操作。所用仪器和样品体积可根据采用的采集与转移方法以及气相色谱分析所需的样品量而有所变化⁸。本方案使用5.9 ml的采集瓶和30 ml注射器，通过冲洗法进行样品转移。其他可选方法详见讨论部分。

1. 准备
   1. 若每轮从多个腔室取样，请准备一个时间点参考网格（见图2），以便轻松追踪取样位置和时间。或者，在取样期间安排记录每个时间点。
   2. 预先标记并排列好收集小瓶，以实现取样过程中的最高效率并最大程度避免混淆。
   3. 为节省取样时间，应提前准备好所有材料和设备。包括可能损坏或易丢失物品的备用件（如针头、注射器、旋塞等），并将其放入手提箱、桶或其他容器中。
   4. 应准备好记录因设备故障或其他不可预见情况导致的延迟时间点，并可在数据分析阶段通过调整与特定样品相关的时间进行校正。
2. 样品采集
   1. 将腔室盖与预安装的腔室锚固件连接并密封，并启动秒表。此为T₀时间点。
   2. 密封盖后立即从靠近腔室的位置、大致与腔室顶部等高的地方采集环境空气样品：使用装有针头且旋塞处于打开状态的空30 ml注射器，抽取30 ml空气样品后关闭旋塞。此即T₀样品。或者，也可从腔室内采集T₀样品⁶。
      注意：两种方法之间存在权衡——需评估空间因素（外部样品与采样点的距离或微气候差异）与时间因素（盖子关闭与样品采集之间的延迟）之间的关系，并根据所用设备和研究系统的具体情况确定最合适的技术。
   3. 用注射器针头刺穿已有一个针头从隔膜边缘附近穿过的5.9 ml收集小瓶的隔膜。
   4. 打开注射器旋塞，将约20 ml样品注入小瓶中（这会使小瓶中原有气体通过额外针头排出，并被新样品取代）。
   5. 在平稳操作下，一边继续注入尽可能多的剩余样品（约10 ml），一边拔出额外针头，使小瓶内略微加压，以确保样品完整性，并在必要时允许进行多次分析⁸。
   6. 关闭旋塞，并将注射器针头从隔膜中抽出。将装满样品的小瓶倒置，以区别于未装填的小瓶。
   7. 前往下一个腔室，重复步骤3.2.1–3.2.6，按照预先确定的正确T₀时间点密封盖子。
   8. 继续重复步骤3.2.1–3.2.7，直至本轮所有腔室均已密封并完成T₀样品采集。
   9. 返回第一个腔室。
   10. 当接近T₁时间点前10秒时，用注射器针头刺穿腔室顶部的隔膜。
   11. 在T₁时间点前后10秒范围内，从腔室内抽取30 ml空气样品并关闭旋塞。将注射器针头从腔室隔膜中取出。
   12. 按照步骤3.2.3–3.2.6将样品转移至收集小瓶。
   13. 根据第2.4节中建立的取样方案，继续按照步骤3.2.10–3.2.12采集样品。
3. 辅助测量
   1. 为将气体浓度转换为质量，需在取样时测量空气温度。根据研究目标，可在每个位置和/或时间点记录或进行其他辅助测量，如土壤温度、土壤含水量、日降雨量、土壤容重、土壤硝酸盐和铵态氮浓度等。获取这些数据的方法多种多样——请遵循标准操作规程。
   2. 可选地，采集环境空气样品和/或向小瓶中加载已知浓度的现场标准气体，以评估采样至分析期间的环境温室气体浓度及可能发生的储存小瓶样品降解情况（见第2.4.1.4和2.4.1.5节）。

4. 样本分析

1. 使用配备电子捕获检测器（用于 N₂O）、红外气体分析仪或热导检测器（用于 CO₂）以及火焰离子化检测器（用于 CH₄）的仪器，通过气相色谱法测定每个样品中目标气体的浓度。
   注意：必须能够使用正确配置用于温室气体分析且具备足够运行时间的仪器。气相色谱法的原理和方法在其他文献中有详细描述^5,15,16。
2. 利用理想气体定律将痕量气体浓度从体积单位转换为质量单位：

PV = nRT

其中 P 表示压强，V 表示体积，n 表示气体的物质的量，R 为气体常数，T 表示温度。因此：

5. 数据分析

1. 针对每个时间序列，绘制时间-浓度关系图并评估其线性。通过拟合优度或目视检查进行评估，排除显示平台期迹象的后期时间点，不再纳入后续分析。用于通量计算的时间点至少应包含三个，包括 T₀（T₀、T₁、T₂…）。建立统一的分析标准，并剔除不符合该线性标准的时间序列。有关通量计算中误差、偏差和方差的详细讨论，请参见 Parkin 和 Venterea⁸。
2. 进行线性回归分析。
3. 利用回归直线的斜率计算通量：

F = S • V • A^-1

其中 F = 通量，S = 回归斜率，V = 气室体积，A = 气室面积。因此：

注意：有关通量计算的非线性方法，请参见讨论部分及 Parkin et al.¹²。

结果

在使用静态箱法开展研究项目之前，必须了解整体工作流程，以及in silico、野外和实验室工作的组织关系（图1）。在实验设计严谨并完成系统校准（图2）的前提下，数据分析通常相对直接。通过采用适用于该系统的预设通量模型，对时间与浓度进行回归分析，可确定每个箱体在每个采样时间点的通量速率（图3）。然而，即使遵循最佳实践操作，仍可能遇到问题，因此对原始数据进行质量控制至关重要。例如，箱体密封失效或样品瓶泄漏可能导致异常的浓度值。这些问题可通过目视检查时间序列浓度图轻松识别（图4），其中CO₂的时间序列通常尤为有用，因为与N₂O或CH₄有时接近检测限、可忽略不计甚至出现负通量的情况相比，CO₂的通量通常更为显著且持续。在确认数据质量后，可利用结果比较不同处理之间或一个生长季内气体通量动态的变化（图5）。从5月和6月的通量值及误差棒可以看出，通量空间异质性所导致的变异可能十分显著，尤其在通量速率较高的条件下更为明显。此类变异性并不罕见，凸显了在该技术中进行充分重复实验的重要性。

图 1. 工作流程概览。 本实验方案的各个步骤将在规划阶段、野外工作、实验室操作以及in silico分析中分别进行。箭头表示工作流程的顺序，从腔室设计（如需要，还包括构建）开始，到数据分析结束。野外采样与样品分析之间的多个方框/箭头表示在实验过程中可能存在多个采样时间点。

图 2. 取样时间安排示例。 同时从多个腔室采集样品的时间安排示例。左侧标明腔室编号，顶部标明时间点，表格内列出以整分钟表示的取样时间。在此示例中，四个独立的36分钟时间序列（每个腔室一个）在46分钟内完成，每个时间序列内的时间点间隔为12分钟，腔室之间的转移时间为2分钟。在此假设示例中，36分钟时间序列的适用性应由前期校准确定。虽然时间点无需均匀分布，但均匀安排通常可简化取样方案。此外，研究人员也可单独记录每次取样的时间点，以确定取样间隔。

图3. 通量计算。 一个典型的静态箱时间序列，包含在36分钟采样期间内四个时间点测得的N₂O浓度。图中显示了线性回归结果，其斜率即为通量速率。

图 4. 质量控制。 显示来自同一样品集但不同气体的成对时间序列，其中通过目视检查已识别出瓶体泄漏（红色点）。A) CO₂ 浓度随时间变化。B) N₂O 浓度随时间变化。

图 5. 综合结果。 单个生长季期间农田中 N₂O 通量速率。通量值基于六个腔室的均值，采用四点时间序列法测定。误差线表示标准误。

讨论

本文所述的静态箱法是一种测量土壤系统温室气体通量的有效方法。由于其组件相对简单，该方法特别适用于无法采用需要更多基础设施的测量手段的条件或系统。然而，为了获得高质量的数据，必须严格关注实验设计⁶。其中一个需要特别注意的因素是土壤气体通量的空间变异性，这可能导致基于静态箱的重复测量结果之间出现较大差异。因此，在实验设计中，应设置足够的重复次数，以确保统计分析具有足够的检验效能。在可研究的处理数量与维持足够重复性之间可能存在权衡，通常建议每个处理至少设置四个重复¹⁴。

若需利用测定的通量来估算每日排放量，则必须考虑气温、土壤温度和气体排放的昼夜变化。如果研究目标要求在上午中段进行测量，以使温度反映日均值，则采样时间窗口受限可能会影响可实际监测的 chambers 数量。另一个需要评估的因素是植物根系和地上生物量的包含或排除对气体通量的影响。chamber 相对于植物组织的放置位置将影响通量数据的解释，特别是在 CO₂ 的情况下，不仅需要考虑微生物呼吸，还必须合理平衡根系和茎叶的呼吸作用以及光合作用。有关这些因素的进一步讨论，请参见 Parkin 和 Venterea⁸。

如前所述，该方法存在多种变异形式，包括小室设计和采样体积。其中一种变异体现在注射器与收集瓶之间转移样品所采用的方法。本文所述技术在将收集瓶充至正压之前，首先用样品冲洗收集瓶。⁵一种更常用的技术是将样品从注射器转移至已使用真空泵预先抽真空的样品瓶中，也有报道称可使用未抽真空且未冲洗的样品瓶。^8,17另一个存在多种方法的重要环节是数据分析以及为所研究系统选择最合适的通量模型。除了本文所述的线性回归方法外，还可采用非线性模型，尤其是在使用较长部署时间的情况下。这些模型包括Hutchinson和Mosier开发的算法¹⁸ 及其衍生形式^19,20，Wagner 描述的二次方程法 等²¹，以及Livingston所述的非稳态扩散通量估算方法 等²²有关非线性通量模型的详细讨论，请参见 Parkin 等¹² 和 Venterea 等²³.

与静态箱法类似的方法包括使用带有傅里叶变换红外光谱（FTIR）的流动测量系统，以替代注射器取样和气相色谱法，以及通过多种方式实现箱体封闭和取样的自动化。自动化系统能够更频繁地进行测量并减少人力需求，但也需要额外的基础设施投入。Grace et al.²⁴ 对基于自动箱体的 N₂O 测量方法的各种选择及其权衡进行了全面综述。

对人为管理和自然系统的温室气体通量进行表征，对于完善基于过程的模型、理解管理措施的影响、制定减排策略以及支持全球温室气体核算和气候变化建模具有重要意义。因此，尽管单个研究在局部尺度上具有参考价值，但若能将数据贡献于并借鉴全球范围内关于地表与大气间气体交换的知识体系，则可获得更大的科学价值。关键在于，数据的采集与报告方式必须确保其长期可用性，并能与更广泛的知识库实现互操作。这包括遵循最佳实践以保证数据质量，同时采集辅助性测量数据，并全面报告元数据，从而使研究结果能够超越单一研究的局限而得到推广。GRACEnet 项目和 GRA²⁵ 提供了出色的数据报告指南。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5.9 ml 钠钙玻璃平底试管 55 x 15.5 mm	Labco Limited	719W	收集管
带可穿刺橡胶隔垫的16.5 mm螺口盖	Labco Limited	VC309	帽盖用于  小瓶
90孔塑料试管架，17.1 mm孔内径	Wheaton	868810	用于整理小瓶的架子
23 G × 1 常规斜面针头"	BD	305193	用于样本采集的针头
带鲁尔接头的三通阀，单向，公端滑动接头	Cole-Parmer	EW-30600-01	用于注射器的旋塞阀
30 ml 注射器，滑动接头	BD	309651	用于样品采集的注射器
秒表或计时器	各种	N/A	用于确定野外采样的时间
带边沿的不锈钢或镀锌金属托盘，或定制的不锈钢或PVC培养室及盖子，尺寸根据实验系统适当选择	各种	N/A	腔室锚定装置及盖子——锚定装置底部已切除，盖子上钻有隔膜和通气管穿过的孔
灰色丁基橡胶塞 20 mm	Wheaton	W224100-173	用于注射器取样的腔室隔片——插入盖子顶部的钻孔中
Tygon 管道，内径 4.0 mm × 外径 5.6 mm	Sigma-Aldrich	Z685623	腔室通气管——插入盖子侧面钻出的孔中，与外侧齐平，约25 cm长的部分在盖子内部盘绕（可使用1 ml注射器尖端作为固定装置）
粘性泡沫橡胶带或高密度聚乙烯（HDPE）O型圈	各种	N/A	腔室密封机制——固定于盖缘下侧
反射性  绝缘，0.3125" 厚度	Lowe's	409818	隔热与反射涂层——粘附于腔室盖外表面
大型金属活页夹，2 个" 大小为1" 容量，或根据需要选择制造的拉扣式锁扣	斯台普斯 / 麦克马斯特	831610（Staples）/ 1863A21（McMaster）	盖子固定机制——用于在采样过程中将盖子夹紧固定至锚定点
配备电子捕获检测器（用于氧化亚氮）、红外气体分析仪或热导检测器（用于二氧化碳）以及火焰离子化检测器（用于甲烷）的气相色谱设备	各种	N/A	用于样品分析