一种新型方法 体外 研究人全血与内皮相互作用的模型

摘要

可靠的人类血管血液相互作用研究模型尚且缺乏。我们提出一种 体外 结合人全血与培养的原代人内皮细胞模型，用于研究血液中（ELISA）和血管腔室（显微镜）的细胞相互作用。

摘要

目前已知的大多数疾病均伴随心血管系统的功能紊乱。然而，由于缺乏可靠且具有生理相关性的方法，对心血管病理过程中相互作用通路复杂性的研究受到限制。为了模拟病理性的血管事件，我们已开发出一种 体外 用于研究内皮细胞与全血相互作用的检测方法。该检测采用原代人内皮细胞，使其与人全血直接接触。该方法使用天然血液，抗凝剂用量极少或不使用抗凝剂，从而能够研究存在于血管中的分子与细胞组分之间的精细相互作用。

我们通过比较不同血量在有或无人类脐静脉内皮细胞（HUVEC）孵育条件下对凝血激活的影响，来验证该检测方法的功能性。较大的血量会促进凝血酶-抗凝血酶（TAT）复合物的形成增加，而 HUVEC 的存在则导致凝血激活减弱。此外，我们采用图像分析方法检测了在肿瘤坏死因子（TNFα）刺激后白细胞与 HUVEC 的黏附情况，发现与未刺激细胞相比，血液接触后 TNFα 刺激的细胞表面 CD16⁺ 细胞数量显著升高。综上所述，该检测方法可用于研究内皮层与血液组分之间相互作用发生紊乱的血管病理过程。

引言

分析心血管疾病中血液-血管相互作用的方法通常涉及动物实验研究。然而，在实验性动物模型中获得的结果可能对人类疾病几乎没有或没有任何意义。^1,2 因此，有必要采用良好且可靠的 体外 用于在类人系统中研究血液组分与血管内皮细胞之间细胞相互作用的模型。因此，我们建立了一种血液内皮细胞腔室模型。该模型基于先前描述的一种用于研究生物材料与人全血之间相互作用的模型。.³ 与其他情况相反 体外 通常使用有限数量纯化组分的实验装置， 即， 血小板、白细胞或内皮细胞均可获得时，本模型包含了血管中存在的全部组分。

血液内皮细胞腔室模型的建立旨在能够使用新鲜抽取的人类血液，且几乎无需添加抗凝剂。储存时间较长的血液会产生所谓的储存性损伤，其中红细胞的破坏可能干扰血液与内皮细胞之间精细的相互作用。⁴

为避免全血处理过程中形成凝块 离体 需要使用高剂量抗凝剂，或确保所有与血液接触的材料均具有非激活特性。由于实验室环境中非激活表面较为罕见，因此可选择对材料进行表面修饰，使其具备固定化肝素的保护层。这种固定化肝素保护层（以下简称Corline肝素表面（CHS））可应用于大多数材料，形成一种与血液接触时不会触发凝血级联反应激活的表面。⁵ 因此，通过向腔室中提供CHS，血液内皮细胞腔室模型能够在血液中使用极低浓度的抗凝剂。在血液内皮腔室模型中避免添加高浓度抗凝剂，使得研究血管内可能被掩盖的敏感相互作用成为可能。⁶

血液内皮细胞腔室模型由两个腔室构成，腔室通过将塑料圆筒（高度：8 mm；半径：9 mm）固定在塑料显微镜载玻片上形成。圆筒朝上的边缘设有凹槽，凹槽内装有橡胶O形圈，用于将腔室密封在细胞培养载玻片上。向腔室内仅部分填充血液，腔室内残留的空气可在腔室随后垂直旋转时保持血液流动（图1）。

为了评估该模型的功能，我们分别在完全涂覆CHS的腔室或人脐静脉内皮细胞（HUVEC）条件下进行实验。对两个独立的血液体积进行了检测，并通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）测量凝血酶-抗凝血酶（TAT）复合物（凝血的间接标志物）的形成。随后，我们通过图像分析评估了血液体积以及肿瘤坏死因子（TNFα）刺激的内皮细胞对白细胞募集的影响。

图1. 血液内皮细胞腔室模型的构建。(A) 由聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）制成的血液腔室的俯视示意图。(B) 在单孔腔室载玻片上培养原代人内皮细胞。将新鲜人全血加入显微镜载玻片上的两个腔室中。所有腔室及用于处理血液的材料均经保护性HS涂层处理。移除细胞培养载玻片的壁后，将细胞面朝血液放置，并用夹具固定密闭。(C) 随后将血液-内皮细胞腔室在37 °C下旋转孵育。孵育结束后，可通过ELISA分析血液区室中的反应，通过显微镜分析内皮细胞。

方案

注意：血液通过开放式静脉穿刺法从健康个体采集，该操作已获得乌普萨拉伦理审查委员会的批准（许可号：2008/264）。

1. 接种细胞

1. 在 PBS（pH 7.4）中含 1% 明胶包被的 T75 培养瓶中，于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC）。
2. 从含有 HUVEC（或其他类型的原代人内皮细胞）的 T75 培养瓶中移除培养基，用 PBS（pH 7.4）中含 2.1 mM EDTA 的溶液洗涤细胞。加入 1 ml 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C 孵育 2–3 分钟，使细胞脱离。
3. 用 9 ml 含 10% 胎牛血清（FBS）的 PBS（pH 7.4）冲洗培养瓶以收集细胞，并将细胞悬液转移至 15 ml 离心管中。在 735 × g 条件下离心 5 分钟。
4. 弃去上清液，小心地将细胞沉淀重悬于微血管内皮细胞生长培养基（EC GMMV）中，使用 Bürker 计数板进行细胞计数。以 21,000 个细胞/cm² 的密度接种于 1 孔细胞爬片中，并在 37 °C 培养。HUVEC 在培养 1–2 天后将达到融合状态。每日在光学显微镜下观察细胞形态和融合度。

2. 全血的制备

1. 根据制造商说明，使用双层固定化肝素（CHS）处理所有将与血液接触的人工表面。CHS涂层材料若防尘保存，可在室温下储存长达6个月而不影响功能。
2. 在开始血液内皮腔实验前短时间内（<30分钟），采用开放式静脉穿刺法从健康供体采集血液。在采集血液前，将皮下注射针头（18 G × 50 mm）连接至CHS涂层硅胶管（内径：2 mm），然后小心地将血液收集到CHS涂层的50 ml离心管中。向血液中添加未分级肝素，使其终浓度达到0.75 IU/ml。通过轻轻倒置离心管2–3次，使血液均匀混合。

3. 血管内皮细胞腔室模型

1. 在丙烯酸聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）材料中制作血液腔室（图1A；俯视图），该腔室由两个圆柱体（高8 mm，半径9 mm）组成，将其粘接到一块PMMA载片（25 × 75 mm）上。将圆柱体朝上的边缘装配橡胶O型圈，以便将血液腔室与培养有内皮细胞的玻璃载片密封（图1B）。随后将连接了内皮细胞培养载片的血液腔室垂直旋转放置（图1C）。
2. 使用经CHS包被的移液枪头，小心地将1.5 ml血液转移至每个经CHS包被的腔室中，注意避免激活血液。
3. 将1 ml血液转移至含有30 μl 0.34 M K₃EDTA的微量离心管中，使K₃EDTA终浓度达到10 mM，用于通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测初始血浆蛋白浓度。轻轻混匀血液，并将离心管置于冰上保存。
4. 根据制造商说明，移除细胞培养玻璃载片的塑料壁，并用pH 7.4的PBS小心清洗细胞。确保随后尽可能去除载片上的液体，但切勿使细胞干燥。
5. 将载片放置在血液腔室上方，使细胞面朝向血液。使用夹具固定载片与血液-内皮细胞腔室的组合体。在夹紧时，使用塑料载片提供额外支撑，以防止细胞培养玻璃载片破裂。
6. 将血液-内皮细胞腔室固定于直径为40 cm的旋转轮上，并置于37 °C水浴中。以0.5 × g的转速在旋转轮上转动每个腔室，持续30分钟。
7. 孵育结束后，拆卸血液-内皮细胞腔室。用pH 7.4的PBS清洗细胞培养载片，并用预冷的1%多聚甲醛（PFA）在冰上固定细胞10分钟。从每个腔室中取出1 ml血液，转移至含有30 μl 0.34 M K₃EDTA的微量离心管中，使K₃EDTA终浓度达到10 mM，轻轻混匀后置于冰上保存。
8. 在4 °C条件下，以4,560 × g离心10分钟。将血浆转移至新的微量离心管中，并储存在-70 °C，待后续分析。

4. 血管内皮相互作用的分析

1. 使用小鼠抗人CD16抗体进行免疫荧光染色，随后加入二抗山羊抗小鼠Alexa 488及鬼笔环肽-TexasRed。每步染色均在室温下进行1小时，并在每步之间用pH 7.4的PBS洗涤载玻片。用DAPI在室温下对细胞核复染10分钟。通过荧光显微镜结合图像分析软件（如CellProfiler）对结合于内皮细胞的血液成分进行荧光显微分析。
2. 按照试剂盒说明书，使用凝血酶-抗凝血酶（TAT）ELISA 对血浆样本的血液隔室反应进行定量。
3. 使用适当的统计工具， 例如采用非配对 t 检验分析数据。

结果

CHS 涂层的必要性

为了测量全血中特异性由内皮细胞引发的反应，所有用于血液-内皮细胞共培养腔室的材料在使用前必须经过CHS涂层处理。图2A（左）显示了未涂层腔室在与血液接触30分钟后出现明显可见血凝块的情况。而对腔室进行CHS处理后（图2A，右），可防止血液发生非特异性激活，确保实验结果仅反映内皮细胞与血液之间的相互作用。

腔室内血容量的影响

在静止的血液中，凝血因子被激活后相互作用的概率增加，因此更易发生凝血激活。在血液-内皮细胞腔室模型中，由于腔室内存在气泡循环，血液保持流动状态。为了确定血量变化（从而也影响气泡大小）的影响，将一个CHS包被的腔室连接至CHS包被的玻片，并分别加入1.5 ml或1.75 ml全血进行30分钟的测试。当加入1.75 ml血液时，未被气泡推动的静止血量比使用1.5 ml血液时大2.5倍（图2B）。测得的TAT值表明，随着血量增加，TAT生成量也相应增加（图2D）。当人脐静脉内皮细胞（HUVEC）（图2C）分别与1.5 ml或1.75 ml全血共孵育时，两组之间未观察到差异，提示内皮细胞可能调节凝血的激活过程（图2D）。

TNFα 对血细胞募集和凝血激活的影响

为了研究 TNFα 对白细胞募集的影响，HUVEC 在与血液接触前 4 小时用 20 ng/ml TNFα 处理。血液接触（分别使用 1.5 ml 或 1.75 ml 血液）持续 30 分钟，随后对培养载玻片进行 CD16 染色（图 2F），成像并定量 CD16⁺ 细胞数量。经 TNFα 处理后，CD16⁺ 细胞的募集显著增加（图 2E），使用 1.5 ml 血液时从 100 增至 256 个 CD16⁺ 细胞/mm²（p < 0.0001），使用 1.75 ml 血液时从 172 增至 378（P < 0.0001）。在与 TNFα 处理或未处理细胞共孵育的血液对应的血浆样本中检测了 TAT 复合物的形成（图 2G）。与未处理细胞相比，TNFα 刺激的细胞诱导 TAT 复合物水平大约增加了一倍。

图 2：血液内皮细胞腔室模型的功能性。（A） 含或不含 CHS 的腔室与全血共同孵育。在无 CHS 的情况下，30 分钟后形成血凝块。在未添加 CHS 的血液中，凝血酶-抗凝血酶（TAT）复合物（凝血的间接标志物）的测量值> 6,000 μg/ml。（B） 由旋转气泡未能持续搅动的血液体积会随不同血量而变化。当加入 1.5 ml 血液时，该体积为 0.3 ml；而当加入 1.75 ml 血液时，该体积增加至 0.74 ml。（C） 通过相差显微镜观察的 HUVEC 显示出典型的内皮细胞形态，在接触血液前形成融合的单层细胞。（D） 完全涂覆 CHS 的腔室在加入不同体积血液时，TAT 值仅有轻微差异。加入 1.5 ml 血液时 TAT 为 35 ± 11 μg/ml（n = 7），而加入 1.75 ml 时为 85 ± 70 μg/ml（n = 8）。当 HUVEC 与相同体积的血液共同孵育时，这种差异不再存在：1.5 ml 时为 66 ± 55 μg/ml（n = 5），1.75 ml 时为 66 ± 29 μg/ml（n = 7）。（E） 定量分析血液接触后未刺激或经 TNFα 刺激的 HUVEC 上 CD16⁺ 细胞的数量。与未刺激细胞相比，经 TNFα 刺激的细胞在与 1.5 ml（基础值：100 ± 40 个细胞/mm；TNFα：256 ± 121 个细胞/mm）或 1.75 ml（基础值：172 ± 67 个细胞/mm；TNFα：378 ± 185 个细胞/mm）全血孵育后，CD16⁺ 细胞数量显著增加。（F） 未刺激和 TNFα 刺激的 HUVEC 的代表性图像，分别对 Phalloidin（红色）、CD16（绿色）和 DAPI（蓝色）染色。比例尺 = 250 μm。（G） 与未经处理的细胞相比，经 TNFα 刺激的细胞在与血液孵育后，TAT 复合物的形成大约增加一倍（1.5 ml：TAT 增加 2.1 ± 0.1 倍，n = 3；1.75 ml：TAT 增加 1.7 ± 1.0 倍，n = 4）。所有数值均以均值 ± 标准差表示；p 值通过非配对 t 检验计算。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

血液与血管壁之间的多种相互作用通常因内皮细胞的非黏附性和抗血栓特性而维持在静息状态。⁷ 在涉及炎症的病理状态下，内皮细胞被激活，导致黏附受体表达增加⁸ 抑制止血的能力下降。⁹ 血液中级联系统的激活反过来会增强内皮细胞的血栓形成倾向，导致进一步的血栓形成以及白细胞募集。¹⁰ 为了更深入地理解内皮细胞与全血之间这种精细的相互作用，我们开发了一种新的方法 体外 一种将培养的内皮细胞与全血接触的方法。据我们所知，我们的实验装置是首个实现内皮细胞与人全血在无抗凝剂或极少量抗凝剂条件下长时间共孵育的系统。

该系统的灵敏度得益于开放式静脉穿刺系统，结合在所有接触血液的表面固定化肝素的保护层。在采血过程中使用开放式系统可减少静脉穿刺期间级联系统的激活，同时允许自行确定抗凝剂的使用量。然而，根据研究预期的终点指标，也可使用 commercially available evacuated blood tubes（市售真空采血管）。大多数市售封闭系统采血管中添加的抗凝剂终浓度可能会抑制在实验体系中原本敏感且难以研究的相互作用⁶。固定化肝素表面（CHS）进一步消除了除内皮细胞以外的任何表面与血液接触所引起的血液激活⁵。事实上，在未使用CHS保护的腔室中，向全血中添加少量未分级肝素后孵育，会导致凝块形成。

腔室内的气泡可在血液与内皮细胞共孵育过程中促进混匀。为评估气泡大小的影响，我们采用了两种不同的血液体积。在该模型中，无论气泡大小如何，与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）共孵育的腔室内TAT水平相似。然而，在完全CHS处理的腔室中，较小的气泡尺寸导致TAT水平升高。这一结果与先前报道的内皮细胞特性一致¹¹，表明内皮细胞增强了凝血激活的调节作用，而惰性CHS腔室缺乏这种调节效应。系统中的气泡在腔室旋转时产生流动，气泡的大小会影响该旋转系统内的作用力。我们的结果已对此进行了展示 图 2D 较小的气泡会产生更高的TAT值，代表对血液的作用力降低 即, 腔室内血液流动速度较低，从而导致级联系统的激活程度更高。需要指出的是，在该系统中我们产生的是旋转流动，其在腔室内的流速分布不均，腔壁处流速最高，中心区域最低。显然，这种流动和剪切应力条件对内皮细胞而言并非理想环境，但我们仍拥有一个能够产生稳定且可重复结果的系统。更理想的条件应包括无湍流的循环层流。然而，在本研究展示的模型中无法实现这一点，据我们所知，目前尚无此类系统可用。尽管市面上已有多种微流控系统，但这些系统无法与未添加或仅添加极低浓度抗凝剂的全血联合使用，因而无法实现对血液中所有组分与内皮细胞之间相互作用的充分且敏感的评估。

此外，在肿瘤坏死因子α（TNFα）激活的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中，无论血量如何，白细胞向内皮细胞的募集增加了2倍，同时凝血酶-抗凝血酶复合物（TAT）的形成也增加了一倍。这验证了该模型系统的稳定性，并表明可将活化的内皮细胞与全血联合使用。未来，该血液-内皮细胞共培养装置可用于研究在不同条件和激活阶段下，多种细胞表面标志物介导的血细胞向活化内皮细胞的募集过程。此外，该模型还可与药理学试剂联合使用，以评估其对炎症状态的影响。

总之，我们展示了将腔室模型与人源血液和血管细胞相结合以构建完整的人体模型的巨大优势 体外 用于开展血管疾病相关研究的系统。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）	PromoCell	C-12200	可使用其他类型的原代人内皮细胞。
内皮细胞生长培养基 MV（ECGM MV）	PromoCell	C-22120
明胶	Sigma-Aldrich	G-2500	用 PBS 配制 1% 明胶溶液，在 T75 培养瓶中加入 5 ml 孵育 15 分钟，接种细胞前去除。
TAT ELISA	Enzyme Research Lab.	TAT-EIA-C
小鼠抗人 CD16 抗体	DAKO	F7011	稀释比例 1:100
山羊抗小鼠 Alexa 488 抗体	Molecular Probes	A11001	稀释比例 1:500
Phalloidin-Texas Red	Molecular Probes	A22287	稀释比例 1:200
DAPI	Molecular Probes	D1306	稀释至 10 μg/ml
EDTA	Sigma	E-6758
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco Life Tecnologies	25200-056
胎牛血清（FBS）	Gibco Life Technologies	10437
单孔细胞培养载玻片	BD Falcon	354101
血流腔室	NA	NA	血流腔室可由 PMMA 或其他能够结合 CHS 的塑料材料制成
夹具	Office Depot	2052204
Corline 肝素表面（CHS）	Corline Systems AB	945-00
皮下注射针头	Terumo	NN-1850R	规格：18 G × 5 mm
未分级肝素（UFH）	Leo Pharma	585679
K3EDTA	Alfa Aesar	1709958	用 milliQ H2O 配制 0.34 M 储存液
PFA	Sigma-Aldrich	P-6148
荧光显微镜	Nikon	80i
光学显微镜	Nikon	TS100
图像分析软件	Broad Institute	CellProfiler	可免费下载，网址为 www.cellprofiler.org