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方法文章

基于荧光的PAD4活性监测：利用一种前荧光底物类似物

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DOI：

10.3791/52114

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2014年11月5日

 ,  , 
1Department of Chemistry, Lehigh University

本文内容

摘要

PAD4 是一种负责将肽基精氨酸转化为肽基瓜氨酸的酶。PAD4 的失调与多种人类疾病相关。本文描述了一种简便且适用于高通量的基于荧光的 PAD4 检测方法。

摘要

翻译后蛋白修饰可能通过增加多种蛋白底物侧链上的共价修饰，从而导致蛋白功能状态的改变。组蛋白尾部是所有人源蛋白中修饰程度最高的区域之一。已有研究证明，肽基精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）能够将精氨酸残基转化为非遗传编码的瓜氨酸残基。迄今为止，已报道的检测方法中，操作简便且灵敏度令人满意者甚少。因此，合适的检测方法的缺乏可能在很大程度上导致了强效非共价PAD4抑制剂的缺失。本文介绍了一种新型的基于荧光的检测方法，可用于监测PAD4的酶活性。该方法设计了一种前荧光底物类似物，通过加入蛋白酶胰蛋白酶后释放荧光，从而将PAD4的酶学活性与荧光信号关联起来。结果表明，该检测方法适用于高通量筛选条件，并具有较高的信噪比。此外，该方法也可用于含有过表达PAD4的粗制细胞裂解液样品的检测。

引言

大量哺乳动物蛋白质在核糖体完成蛋白质生物合成后，会受到酶的作用而发生显著修饰。这些翻译后修饰（PTMs）可通过改变蛋白质的大小、电荷、结构和寡聚状态（以及其他特性）极大地增加蛋白质组的功能多样性1-3。因此，蛋白质结构的改变可能导致一系列生理后果，例如蛋白质降解、细胞分化、信号传导、基因表达调控以及蛋白质-蛋白质相互作用。尽管这些修饰在人类蛋白质中普遍存在，但组蛋白的末端却经历了异常高频的共价修饰4。组蛋白是一类结构蛋白，有助于基因组DNA的压缩。无序的组蛋白尾部的共价修饰由一系列酶催化并受到调控，这些酶能够催化残基的共价修饰（书写酶），逆转相同的修饰（擦除酶），并识别组蛋白尾部所携带的修饰变化（阅读器）5-7。事实上，大多数已知的翻译后修饰均可在此段短小的组蛋白区域中观察到，包括甲基化、磷酸化、乙酰化、SUMO化、泛素化和瓜氨酸化8。

瓜氨酸化涉及肽基精氨酸转化为非tRNA编码的肽基瓜氨酸图1A）。负责该侧链中和作用的蛋白质属于PAD（peptide a精氨酸 deiminase）蛋白家族，该家族均为依赖钙离子的酶。9,10迄今为止，已发现五种PAD家族成员（PAD1、PAD2、PAD3、PAD4和PAD6）。该家族的每个成员似乎靶向不同的细胞蛋白，并表现出独特的组织分布特征。PAD4是该蛋白家族中唯一已知通过核定位序列定位于细胞核内的成员。11因此，已发现其可对多种核内靶点进行瓜氨酸化修饰，包括组蛋白H2A第3位精氨酸（H2R3）、H3第2、17和26位精氨酸（H3R2、H3R17和H3R26）以及H4第3位精氨酸（H4R3）侧链上的精氨酸残基。12,13尽管每种PAD同工酶都具有特定且关键的生理功能，但PAD4因其在健康和疾病状态下多种人类细胞过程中的重要作用而受到更多关注。最近研究表明，PAD4是多能性转录调控网络的成员之一。14小鼠重编程过程及原始态多能性状态下，PAD4的表达水平和活性均被证实升高。通过调控干细胞基因的表达，PAD4可能在细胞重编程效率中发挥关键作用。PAD4还参与中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps）的形成，该结构在结合病原体后有助于其系统性清除。PAD4介导组蛋白蛋白的过度瓜氨酸化，诱导染色质去凝集，从而为胞外诱捕网包裹病原菌提供基础材料，进而抵御细菌感染15,16.

此外，PAD4 被发现参与多种人类疾病的发生发展。已有研究表明，PAD4 的异常表达与类风湿性关节炎、阿尔茨海默病、帕金森病以及多发性硬化症的发病和严重程度相关17。事实上，抗瓜氨酸化蛋白抗体的存在是类风湿性关节炎最可靠且明确的诊断和预后生物标志物之一18。同样，最近研究发现 PAD4 活性的失调存在于多种人类癌症中，包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌和食管癌19-22。PAD4 与癌症之间的关联已被证实可通过 ELK1 癌基因或 p53 肿瘤抑制蛋白介导22,23，先前的研究也提示 PAD4 可能是一个新型的抗癌治疗靶点17,24,25。在一项原理验证研究中，通过 shRNA 耗竭结直肠癌细胞系 HCT116 中的 PAD4 被证明足以诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞26。一种新近开发的不可逆 PAD4 抑制剂在小鼠模型中使肿瘤质量减少了百分之七十27。尤为显著的是，PAD4 抑制似乎发挥了一种靶向治疗作用，能够选择性地杀伤癌细胞，同时保留未转化的正常细胞。

使用小分子关闭PAD4功能可能成为靶向癌细胞或增强现有癌症化学治疗药物疗效的一种强大新策略28。然而，目前尚未发现强效且可逆的PAD4抑制剂。已有多种共价抑制剂被开发出来，它们采用氯代/氟代咪啶结构模拟精氨酸底物27,29,30，并已被证实是研究PAD4在健康与疾病状态下细胞中作用的实用工具。但这些分子对所有活性PAD同工酶均具有相似的抑制效力。因此，迫切需要一种简便的检测方法来报告PAD4的活性。迄今为止，已有多种PAD4检测方法被报道：将反应中释放的氨与比色信号关联31；利用荧光标记的氯代乙脒底物类似物进行荧光偏振分析32；依赖乙二醛与瓜氨酸在酸性条件下的反应33；以及将PAD4活性与荧光去猝灭步骤偶联34。其中，只有共价修饰型卤代乙脒策略被证明适用于高通量筛选平台32,35,36。本文描述了一种简便的基于荧光的检测方法，可稳定地测量PAD4活性。该检测方法具有高信噪比、分析速度快和测量结果稳健等优点，有望用于发现真正强效且选择性的PAD4抑制剂。

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方案

1. PAD4 的转化、表达与纯化

  1. 进行PAD4转化时，将含有PAD4 GST融合蛋白的pGEX质粒转入化学感受态的大肠杆菌（E. Coli BL21(DE3)）细胞中，用于蛋白表达，具体操作步骤如下。根据标准操作流程制备化学感受态（氯化钙法）大肠杆菌（E. Coli BL21(DE3)）细胞。
    1. 将50 μl预先制备好的化学感受态BL21(DE3)细胞置于冰上融化，加入1 μl含有PAD4基因的pGEX质粒，于5 ml离心管中混匀。将混合物置于冰上孵育10分钟，期间每2分钟轻轻振荡一次。
    2. 将混合物放入42 °C水浴中热激40秒，立即放回冰上孵育2分钟，使细胞恢复。向混合物中加入1 ml无菌LB液体培养基，继续在冰上放置1分钟。
    3. 将热激后的细胞在37 °C、250 rpm振荡条件下培养1小时。取75 μl转化后的细胞涂布于含氨苄青霉素的琼脂平板，37 °C孵育15小时。孵育后将平板保存于4 °C。
  2. PAD4表达。
    1. 从氨苄青霉素琼脂平板上挑取单克隆BL21(DE3)菌落，接种至5 ml含1×氨苄青霉素的LB培养基中，置于37 °C培养箱中振荡过夜 培养。
    2. 将5 ml LB菌液（种子液）转接至1 L含1×氨苄青霉素三水合物（分子量403.45 g/mol）的无菌LB培养基中，置于37 °C振荡培养箱中培养。监测菌液在600 nm处的光密度（OD600）。当OD600达到0.3时，将培养物转移至16 °C振荡培养箱中继续培养。
    3. 当OD600达到0.6时，加入0.3 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，分子量238.30 g/mol）诱导表达。继续在16 °C振荡培养15小时。
    4. 在0 °C条件下，以4,000 × g离心20分钟收集菌体。弃去上清液，将菌体沉淀保存于-80 °C。
  3. PAD4纯化。
    1. 将表达PAD4的BL21(DE3)菌体沉淀用裂解缓冲液重悬，缓冲液组成为：50 mM NaCl（分子量58.44 g/mol）、300 mM NaH2PO4（分子量119.98 g/mol）、10 mM 咪唑（分子量68.077 g/mol）、0.1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF，分子量174.94 g/mol）和1 mM 二硫苏糖醇（DTT，分子量154.25 g/mol），pH = 8.0。
    2. 在4 °C条件下进行超声破碎，总时长15分钟。超声结束后，在0 °C条件下以20,000 × g离心20分钟。弃去沉淀，保留上清液。将上清液与谷胱甘肽（GSH）琼脂糖微珠在室温下孵育30分钟进行结合。
    3. 通过重力流将GST微珠或层析柱中的上清液排干。在室温下用4 × 25 ml的1× PBS（磷酸盐缓冲盐水，pH = 8.0）洗涤微珠。
    4. 用洗脱缓冲液（2 × 10 ml）洗脱PAD4蛋白，洗脱缓冲液组成为：50 mM 三（羟甲基）氨基甲烷（Tris Base，分子量121.14 g/mol）、10 mM 谷胱甘肽（GSH，分子量307.32 g/mol），pH = 8.0。
    5. 使用100 kDa截留分子量的超滤离心管，在4 °C条件下以4,000 × g离心20分钟浓缩PAD4蛋白。将蛋白分装至1.0 ml微量离心管中，每管200 μl，保存于-80 °C。

2. 缓冲液储备溶液的配制

  1. 称取氯化钠（NaCl，分子量 58.44 g/mol），配制 2 M 溶液。搅拌至溶液澄清。
  2. 称取三（羟甲基）氨基甲烷（Tris Base，分子量 121.14 g/mol），配制 2 M 溶液，pH = 8.0。搅拌至溶液澄清。
  3. 称取二水合氯化钙（CaCl2 · 2H2O, 分子量 147.01 g/mol），配制 500 mM 溶液。搅拌至溶液澄清。
  4. 称取三（2-羧乙基）膦（TCEP，分子量 250.19 g/mol），配制 200 mM 溶液。搅拌至溶液澄清，并于 -20 °C 保存。
  5. 称取二硫苏糖醇（DTT，分子量 154.25 g/mol），配制 1 M 溶液。搅拌至溶液澄清，并于 -20 °C 保存。
  6. 配制 0.5% 的 Triton X-100 溶液。
  7. 称取乙二胺四乙酸（EDTA，分子量 292.24 g/mol），配制 100 mM 溶液。搅拌至溶液澄清。
  8. 称取 Z-​Arg-​Arg-​7-​氨基-​4-​甲基香豆素盐酸盐（ZRcoum，分子量 621.69 g/mol），用二甲基亚砜（DMSO）配制 10 mM 溶液。

3. 37 °C 下的 PAD4 检测

  1. 从10 mM ZRcoum储备液中，用水配制125 μM的ZRcoum溶液。此125 μM ZRcoum溶液为溶液A。
  2. 配制含有62.5 mM NaCl、62.5 mM Tris、12.5 mM CaCl2、6.25 mM DTT和5 μM PAD4（pH = 8.0）的缓冲液。此为溶液B。
  3. 配制含有62.5 mM NaCl、62.5 mM Tris、12.5 mM CaCl2和6.25 mM DTT（pH = 8.0）的缓冲液。此为溶液C。
  4. 称取胰蛋白酶（结晶型，来源于牛胰腺），用100 mM EDTA配制成10 mg/ml的溶液。搅拌至澄清，于-20 °C保存。此为溶液D。
  5. 取一块96孔板，设定若干孔作为对照孔（无PAD4）和检测孔（+ PAD4）。
  6. 向检测孔中加入160 μl溶液B，向对照孔中加入160 μl溶液C。在37 °C孵育15分钟。
  7. 向所有孔中加入40 μl溶液A，在37 °C孵育45分钟。
  8. 向一半对照孔和一半检测孔中加入10 μl dH2O；向另一半对照孔和检测孔中加入10 μl溶液D。在37 °C孵育10分钟。
  9. 使用多功能酶标仪，在激发波长345 nm、发射波长465 nm条件下读取荧光值。

4. 室温下进行 PAD4 检测

  1. 从10 mM ZRcoum储备液中，用水配制50 μM的ZRcoum溶液。此50 μM ZRcoum溶液为溶液A。
  2. 配制含有100 mM NaCl、100 mM Tris、20 mM CaCl2、2 mM TCEP、0.02% Triton X-100和8 μM PAD4（pH = 8.0）的缓冲液。此为溶液B。
  3. 配制含有100 mM NaCl、100 mM Tris、20 mM CaCl2、2 mM TCEP和0.02% Triton X-100（pH = 8.0）的缓冲液。此为溶液C。
  4. 称取胰蛋白酶（结晶型，来源于牛胰腺），用100 mM EDTA配制成10 mg/ml的溶液。搅拌至溶液澄清，并于-20 °C保存。此为溶液D。
  5. 取一块384孔板，标记出对照孔（无PAD4）和检测孔（+ PAD4）。
  6. 向检测孔中加入25 μl溶液B，向对照孔中加入25 μl溶液C。让含或不含PAD4的缓冲液在孔中于室温孵育20分钟。
  7. 向所有孔中加入25 μl溶液C，并于室温孵育45分钟。
  8. 向一半对照孔和一半检测孔中加入10 μl dH2O；向另一半对照孔和检测孔中加入10 μl溶液D。室温孵育10分钟。
  9. 使用多功能酶标仪，在激发波长345 nm、发射波长465 nm条件下读取荧光值。

5. 在 37 °C 和室温下进行 PAD4 时间进程实验

  1. 从10 mM ZRcoum储备液中，用水配制125 μM的ZRcoum溶液。此125 μM ZRcoum溶液为溶液A。
  2. 配制含有62.5 mM NaCl、62.5 mM Tris、12.5 mM CaCl2、6.25 mM DTT和5 μM PAD4（pH = 8.0）的缓冲液。此为溶液B。
  3. 称取胰蛋白酶（结晶型，来源于牛胰腺），用100 mM EDTA配制成10 mg/ml的溶液。搅拌至完全溶解后，于-20 °C保存。此为溶液C。
  4. 取2块96孔板，向每块板中相应数量的孔（孔数取决于时间点数量）加入160 μl溶液B。
  5. 将其中一块96孔板在37 °C孵育，另一块96孔板在室温（RT）孵育。
  6. 向两块96孔板的所有孔中加入40 μl溶液A，随后立即向t = 0 min的孔中加入10 μl溶液C。在各个特定时间点依次加入10 μl溶液C，直至所有孔均被淬灭。
  7. 使用多功能酶标仪，在激发波长345 nm、发射波长465 nm的条件下读取荧光值。

6. 室温下PAD4抑制活性检测

  1. 从10 mM ZRcoum储备液中，用水配制83 μM的ZRcoum溶液。该83 μM ZRcoum溶液为溶液A。
  2. 称取Cl-amidine（分子量424.8 g/mol），配制100 μM的储备液。该溶液为溶液B。
  3. 配制含有100 mM NaCl、100 mM Tris、20 mM CaCl2、2 mM TCEP、0.02% Triton X-100和8 μM PAD4的缓冲液（pH = 8.0）。该溶液为溶液C。
  4. 配制含有100 mM NaCl、100 mM Tris、20 mM CaCl2、2 mM TCEP和0.02% Triton X-100的缓冲液（pH = 8.0）。该溶液为溶液D。
  5. 称取胰蛋白酶（结晶型，来源于牛胰腺），用100 mM EDTA配制成10 mg/ml的溶液。搅拌至澄清后，于-20 °C保存。该溶液为溶液E。
  6. 取一块384孔板，设定对照孔（无PAD4）、检测孔（含PAD4）和抑制孔（PAD4 + Cl-amidine）。
  7. 向检测孔中加入25 μl溶液C，向对照孔中加入25 μl溶液D。将含或不含PAD4的缓冲液在室温下孵育20分钟。
  8. 向抑制孔中加入10 μl溶液B，并在室温下孵育20分钟。
  9. 向所有孔中加入15 μl溶液A，并在室温下孵育45分钟。
  10. 向所有孔中加入10 μl溶液E，在室温下孵育10分钟。
  11. 使用多功能酶标仪在激发波长345 nm、发射波长465 nm条件下读取荧光值。

7. 室温下粗制细胞裂解液检测

  1. 从 PAD4 1 L 培养物中收获细胞后，将细胞重悬于 10 ml 的 50 mM Tris、50 mM NaCl、0.1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF，分子量 174.94 g/mol）和 1 mM 二硫苏糖醇（DTT，154.25 g/mol）溶液中，pH = 8.0。
  2. 在 4 °C 条件下超声破碎细胞 15 分钟。将细胞裂解液在 0 °C 下以 20,000 × g 离心 20 分钟。使用 100 kDa 截留分子量的离心管，在 4 °C 下以 4,000 rpm 离心，将澄清上清液浓缩至原体积的一半。
  3. 从 10 mM ZRcoum 储存液中，配制 250 μM 的 ZRcoum 水溶液。此 250 μM ZRcoum 溶液为溶液 A。
  4. 配制含 100 mM NaCl、100 mM Tris、20 mM CaCl2 和 2 mM TCEP 的缓冲液（pH = 8.0）。此为溶液 B。
  5. 称取胰蛋白酶（结晶型，来源于牛胰腺），用 100 mM EDTA 配制成 10 mg/ml 溶液。搅拌至完全溶解后，于 -20 °C 保存。此为溶液 C。
  6. 取一块黑色 384 孔板，设定对照孔（不加细胞裂解液）和检测孔（加入细胞裂解液）。
  7. 向所有孔中加入 100 μl 溶液 B，并向检测孔中加入 60 μl 细胞裂解液。室温孵育 20 分钟。
  8. 向所有孔中加入 40 μl 溶液 A，室温孵育 45 分钟。
  9. 向所有孔中加入 10 μl 溶液 C，室温孵育 10 分钟。
  10. 使用多功能酶标仪检测荧光信号，激发波长为 345 nm，发射波长为 465 nm。

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结果

最初，实验表明ZRcoum可在96孔板体系中用于报告PAD4的活性。各孔中加入底物ZRcoum，并分别在有或无PAD4的条件下孵育。在37 °C孵育45分钟后，使用340/40 – 475/15 nm滤光片检测荧光信号（图2A）。如预期所示，由于ZRcoum（或瓜氨酸化后的ZRcoum）中的荧光团仍处于锁定状态，荧光水平保持较低。当向溶液中加入过量胰蛋白酶/EDTA后，荧光团从ZRcoum中释放，而在PAD4存在的情况下荧光信号基本保持不变。添加EDTA的目的是通过螯合PAD4反应所必需的钙离子，从而终止酶促反应。根据这些数据，在PAD4存在条件下观察到荧光信号降低了5.2倍。接下来，验证了新开发的检测方法与高通量筛选平台的兼容性。重点分析了四个对筛选最为关键的反应变量：（1）进一步缩小检测体系的反应体积；（2）在室温（RT）下进行检测的可行性；（3）检测前蛋白与缓冲液混合物的稳定性；（4）有机溶剂/去垢剂可能产生的干扰。

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讨论

本文成功建立了一种基于荧光的检测方法，用于监测PAD4的活性。该方法在多种高通量条件下均表现出极高的稳健性，并且适用于全细胞裂解液37。

组蛋白与周围DNA链之间的亲和力因精氨酸侧链在瓜氨酸化后其正电荷被中和而减弱。人们设想，精氨酸侧链的电荷中和效应也可被类似地用于监测PAD4的活性。PAD4将精氨酸转化为瓜氨酸的反应预计会显著降低其被胰蛋白酶介导水解的敏感性。胰蛋白酶优先水解赖氨酸和精氨酸的C端酰胺键，其最适活性pH范围为7.5至8.5。因此，所有胰蛋白酶溶液均在pH 7.5条件下配制，所有检测均在pH 8.0条件下进行。此外，将荧光团7-氨基-4-甲基香豆素乙酰化连接至精氨酸的C端，可使其荧光处于“关闭”状态（图1C）。经胰蛋白酶处理后，7-氨基-4-甲基香豆素从分子上解离，从而恢复其荧光。在生理pH条件下，荧光的变化可通过其最大激发波长~440 nm在溶液中实时监测。PAD4将精氨酸转化为瓜氨酸的酶活性应能阻止荧光团的暴露，从而降低荧光信号输出。另外，精氨酸的氨基端被乙酰化为羧基苄基结构，以模拟天然肽类底物——后者缺乏带...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由理海大学启动经费支持。我们感谢 Walter Fast 博士提供了用于蛋白质表达的 GST-PAD4 质粒。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
LB Broth, Miller（LURIA-BERTANI）AmrescoJ106-2KGhttp://www.amresco-inc.com
氨苄青霉素三水合物（淡黄色粉末），Fisher BioReagentsFisher ScientificBP902-25 http://www.fishersci.com
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）Life Technogolies15529-019http://www.lifetechnologies.com
所有缓冲液盐类 Fisher Scientific可从 Fisher Scientific、VWR、Acros、Sigma-Aldrich 等公司购买
Protino 谷胱甘肽（GSH）琼脂糖 Machery-Nagel745500.104 °C 保存；http://www.mn-net.com/
氯胺脒 Cayman Chemical 10599-20 °C 保存；https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm
Triton X-100Sigma AldrichX100-100MLwww.sigmaaldrich.com
Corning/Nunclon MicroWell 板（96 孔和 384 孔）可从 Corning 或 Sigma-Aldrich 购买
Tecan Infinite 200 / Tecan i-control 微孔板读板仪软件www.tecan.com
铕激发 340/40 发射 475/15 滤光片http://www.perkinelmer.com

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基于荧光的检测荧光前体底物胰蛋白酶激活蛋白质表达GST纯化高通量筛选荧光测定酶抑制粗裂解液
基于荧光的PAD4活性监测：利用一种前荧光底物类似物
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