PAD4活动通过亲荧光底物类似物基于荧光监测

Summary

PAD4 是一种负责将肽基-精氨酸转化为肽基-瓜氨酸的酶。PAD4 失调与许多人类疾病有关。描述了一种简单且高通量兼容的基于荧光的 PAD4 测定。

Abstract

翻译后修饰可能通过增加许多蛋白质底物侧链上的共价变化来改变蛋白质功能状态。组蛋白尾部代表了所有人类蛋白质中修饰最严重的延伸之一。肽基-精氨酸脱亚胺酶 4 （PAD4） 已被证明可将精氨酸残基转化为非基因编码的瓜氨酸残基。迄今为止描述的少数检测在作上简单且具有令人满意的敏感性。因此，缺乏足够的检测可能导致缺乏有效的非共价 PAD4 抑制剂。在此描述了一种允许监测 PAD4 活性的新型基于荧光的测定法。设计了一种促荧光底物类似物，用于将 PAD4 酶活性与添加蛋白酶胰蛋白酶后的荧光释放联系起来。结果表明，该检测与高通量筛选条件兼容，并且具有很强的信噪比。此外，也可以使用含有过表达 PAD4 的粗细胞裂解物进行检测。

Introduction

大量的哺乳动物蛋白质都很大程度上受到酶的下列蛋白质的核糖体的生物合成中的作用进行修改。这些翻译后修饰（翻译后修饰），可以通过改变蛋白^1-3的大小，电荷，结构，和低聚状态（除其他特征），大大提高了蛋白质的功能多样性。其结果是，在蛋白质结构中的改变可以导致生理后果，如蛋白降解，细胞分化，信号传导，调节基因表达，和蛋白质 - 蛋白质相互作用。而这些修改都是在所有人类蛋白质所占的比例很大普及，终端结束对组蛋白进行非常多的共价修饰^4。组蛋白是一族结构蛋白，以促进基因组DNA的缩合的。非结构化组蛋白尾巴的共价修饰都进行了规范，并通过意甲酶可以催化残基（刻录机）的共价修饰，反向相同的修改（橡皮擦），以及其中的变化区分号被印记到组蛋白尾部（读卡器^）5-7。事实上，大多数已知的翻译后修饰可以在组蛋白包括甲基化，磷酸化，乙酰化，SUMO化，泛素化，和瓜氨酸化⁸的这个短段内被观察到。

瓜氨酸化涉及肽基精氨酸转化成非吨的RNA编码的肽基-瓜氨酸（ 图1A）。的蛋白质，负责该侧链中和，是PAD的成员（对eptide 一个rginineðeiminase）蛋白家族，所有这些都是钙依赖性酶^。9,10。到今天为止，PAD家庭的五名成员已被描述（PAD1，PAD2，PAD3，PAD4和PAD6）。这个家庭的每个成员....

Protocol

1. PAD4改造，表达和纯化

1. 对于PAD4改造，改造PAD4含GST融合到化学感受态中的pGEX质粒大肠杆菌 （BL21（DE3））细胞，使用以下过程蛋白质表达。准备化学感受（氯化钙）E.根据标准方法， 大肠杆菌 （BL21（DE3））的细胞。
   1. 解冻加入50μl预先制备的化学感受态大肠杆菌BL21（DE3）细胞在冰上，并用1微升含有PAD4基因中有5毫升培养管中的质粒pGEX质粒混合。在冰上孵育混合物10分钟，同时轻轻摇动，每2分钟。
   2. 热量通过在42℃水浴中放置该混合物40秒电击细胞。立即将细胞质粒混合物回在冰上2分钟以使细胞恢复。加入1毫升无菌LB肉汤中的混合物中，并置于冰上1分钟。
   3. 孵育震惊细胞的热量，在37℃下，以250rpm振荡1小时。移液器75微升转化细胞上的氨苄青霉素抗性琼脂平板孵育在37℃下搅拌15小时。商店板在4℃下。
2. PAD4表达。
   1. 挑1菌落大肠杆菌BL21（DE3）细胞中从氨苄青霉素琼脂平板上，并装在5ml的LB中含有1x氨苄青霉素。发生在孵化器和动摇O / N在37℃。
   2. 转移到1升的无菌LB含有1x氨苄青霉素三水酸（MW403.45克/摩尔）的5ml的LB（首发）的。地方生长在37℃下振荡培养箱。监测生长的OD _600。当增长达到了OD ₆₀₀ 0.....

Results

最初，它被证明ZRcoum可以在96孔板形式的PAD4的酶活性的报告。孔用基板ZRcoum并在存在/不存在PAD4的。以下的45分钟，在37℃温育期间，荧光用一个四十〇分之三百四十零测定-一十五分之四百七十五纳米过滤器（ 图2A）。正如所料，荧光水平保持最低值内ZRcoum（或瓜氨酸ZRcoum）的荧光团保持在锁定状态。一旦加入过量的胰蛋白酶/ EDTA的溶液中，所述荧光团是从ZRcoum释出但仍然大致不变的PAD4的存在。加入EDTA的目的是协助在PAD4反应的停止，由于其以螯合的必要的钙离子的能力。从这些数据中，在荧光输出一个5.2倍的下降，观察PAD4的存在。其次，补偿新开发的测定法与高通量筛选平台atibility证实。这是主要感兴趣的分析4反应变量，这将是最有利的筛选目的（1）在测定体积的进一步的小型化（2）在室温下进行测定的蛋白质和缓冲液的混合物（3）的稳定性的可能性之前完成测定和有机溶剂/去污剂（4）的潜在干扰。

.......

Discussion

在此，成功开发了一种基于荧光的测定方法，用于监测 PAD4 的活性。该测定已被证明在许多高通量条件下具有令人难以置信的稳健性，并且还与全细胞裂解物^{兼容 37}。

由于瓜氨酸化时精氨酸侧链上的正电荷被中和，组蛋白与其周围的 DNA 链之间的亲和力松动。设想精氨酸侧链的中和可以类似地用于监测 PAD4 活性。PAD4 将精氨酸转化为瓜氨酸有望大大降低其对胰蛋白酶介导的水解的敏感性。胰蛋白酶在水解赖氨酸和精氨酸的 C 端酰胺键方面具有明显的偏好，在 7.5 至 8.5 的 pH 值范围附近具有最佳活性。因此，所有胰蛋白酶溶液均在 pH 值为 7.5 下制备，所有测定均在 pH 值为 8.0 下进行。此外，荧光团7-酰胺-4-甲基香豆素乙酰化到精氨酸C末端，用于将其荧光“锁定”在关闭状态（图1C）。用胰蛋白酶处理后，7-酰胺-4-甲基香豆素与分子解偶联，从而恢复其荧光。在生理 pH 条件下，可以通过其最大激发 ~440 nm 在溶液中轻松监测荧光的变化。PAD4 在将精氨酸转化为瓜氨酸方面的酶活性应防止荧光团的揭露，从而降低荧光输出。此.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB 肉汤，米勒 （LURIA-BERTANI）	Amresco	J106-2KG	http://www.amresco-inc.com
氨苄青霉素三水合物（灰白色粉末），Fisher 生物试剂	Fisher Scientific	BP902-25	http://www.fishersci.com
异丙基噻加内酯 （IPTG）	Life Technogolies	15529-019	http://www.lifetechnologies.com
All 缓冲盐	Fisher Scientific		Can 从 Fisher Scieintifc 购买;VWR;阿克罗斯;Sigma-Aldrich;等。
蛋白谷胱甘肽 （GSH） 琼脂糖	Machery-Nagel	745500.10	商店在 4 °C;http://www.mn-net.com/
氯脒	开曼化工	10599	储存在 -20 °C;https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ML	www.sigmaaldrich.com
康宁/Nunclon 微孔板（96 和 384）			从康宁购买;Sigma-Aldrich
Tecan Infinite 200 / Tecan i-control 酶标仪软件			www.tecan.com
铕 Ex. 340/40 Em. 475/15 filter			http://www.perkinelmer.com