高分辨率电子显微镜观察 幽门螺杆菌 铁可利用性不同条件下产生的 Cag IV 型分泌系统菌毛

摘要

本文介绍了一种用于可视化致癌细菌细胞器——Cag IV型分泌系统（Cag-T4SS）的方法。我们发现，H. pylori在不同铁离子可利用条件下，其表面Cag-T4SS的产生存在差异。

摘要

Helicobacter pylori 是一种螺旋形、革兰氏阴性细菌，可定植于人类胃部微环境，感染全球约一半人口^1,2。H. pylori 是胃癌的主要致病因素，而胃癌是全球癌症相关死亡的第二大原因³。一个与胃部疾病风险增加相关的毒力因子是 Cag 致病岛（Cag-pathogenicity island），这是 H. pylori 染色体上一段约 40 kb 的区域，编码 IV 型分泌系统（type IV secretion system）及其相应的效应分子 CagA^4,5。Cag-T4SS 负责将 CagA 和肽聚糖转运至宿主上皮细胞内^5,6。Cag-T4SS 的活性可引发宿主细胞生物学的多种变化，包括细胞因子表达上调、促炎信号通路激活、细胞骨架重塑以及致癌性细胞信号网络的诱导^5-8。Cag-T4SS 是一种大分子机器，由跨越内膜和外膜并从细胞向外延伸至胞外空间的亚复合物组成。其胞外部分被称为“菌毛”（pilus）⁵。大量研究表明，Cag-T4SS 菌毛在病原体与宿主细胞相互作用界面处形成^9,10。然而，调控这一重要细胞器生物合成的环境因素仍 largely 不明确。近期，我们报道了低铁环境可增强 Cag-T4SS 的活性及菌毛的生物合成。本文中，我们提供了一种优化的实验方案，用于在不同铁可用性条件下培养 H. pylori，以用于后续与人胃上皮细胞的共培养实验。此外，我们还提供了完整的高分辨率扫描电子显微镜分析方案，用于观察在铁限制条件下表现出的超菌毛表型。

引言

H. pylori 感染是胃癌的重要风险因素¹然而，疾病结局存在差异，且取决于多种因素，如宿主遗传背景、病原体遗传多样性等 H. pylori 菌株以及宿主饮食等环境因素¹¹已有先前报道证实，两者之间存在相关性 H. pylori 感染、铁缺乏（表现为血液铁蛋白和血红蛋白浓度降低）以及促炎性细胞因子（包括IL-8分泌）产生增加，最终导致胃部疾病进展加剧¹²急性 H. pylori 感染还与低胃酸症相关，后者会损害宿主对营养性铁的吸收能力，最终导致铁稳态的改变¹³这些临床发现表明，胃部微环境中铁的可利用性可能是影响疾病转归的重要因素。事实上，动物模型研究 H. pylori 感染研究表明，低膳食铁摄入会加重胃部疾病¹⁴这些动物体内的铁水平降低，因此需要 H. pylori 诱导铁获取反应，以获得细菌复制所需的铁。 H. pylori 能够以CagA依赖的方式干扰宿主细胞内的铁转运，从而促进细菌复制¹⁵有趣的是， cag-毒力岛已被证实受铁响应性转录因子 Fur 调控^16,17此外，Cag+菌株与炎症加剧及胃部疾病（如胃癌）相关。¹这些发现支持一种模型，其中 H. pylori 在铁缺乏的环境中，通过改变Cag-T4SS的表达以从宿主细胞中获取铁，导致疾病后果加重。

增加炎症和疾病严重程度的两个因素是Cag表达和低膳食铁摄入。这些事实支持了以下假说：铁的可利用性降低会增加宿主-病原体界面处Cag-T4SS菌毛的产生，从而导致更严重的胃部疾病^11-14本文所提供的方法旨在阐明微量元素铁在调控Cag-T4SS菌毛生物合成中的作用。在前期研究中，我们采用两种方法观察到Cag-T4SS表达呈现铁依赖性增强。首先，通过分析来自饲喂高铁与低铁饮食动物的输出菌株发现，低铁饮食组来源的菌株产生的Cag-T4SS菌毛多于高铁饮食组菌株¹⁴其次，培养 H. pylori 7.13 菌株 体外 在铁充足条件下，菌毛形成减少，而在添加铁螯合剂的条件下培养的细胞则产生显著更多的菌毛。

我们持续研究铁依赖性对Cag-T4SS菌毛表型的调控作用，并提供了采用另一种Helicobacter pylori菌株PMSS1所完成的优化实验方案及代表性结果。该技术的开发旨在将铁限制条件下Cag-T4SS活性的增强与Cag-T4SS菌毛形成的增加相关联。该技术的广泛意义和应用价值在于提供经过优化的培养条件，从而显著提高Cag-T4SS菌毛的产量。本实验方法将有助于研究人员通过富集这一重要的细菌表面结构，来解析Cag-T4SS的组成与结构。相较于光学显微镜等其他可视化技术，采用场发射电子显微镜进行样品制备与观察具有诸多优势，适用于致力于研究该细胞器调控机制的科研人员¹⁰。

方案

1. H. pylori 不同铁可用性条件下的生长及与人胃上皮细胞的共培养

1. 选择 H. pylori 在这些研究中使用菌株 PMSS1，因为它具有完整的 cag 致病岛并表达有功能的IV型分泌系统。同时利用一种同基因型 cagE 突变体（PMSSI ΔcagE）作为阴性对照。将细菌接种于添加5%绵羊血的TSA平板（血琼脂平板）中，培养24小时。 在37 °C、5% CO存在条件下₂.
   注意：按照材料与设备表中所述准备试剂并组装材料。每种试剂的终浓度均列于括号中。
2. 使用无菌棉签从平板上刮取细菌，并接种至由组分配制的改良布鲁氏菌肉汤（见材料与设备表）中，该肉汤需添加胆固醇。将培养物置于含5% CO₂的空气环境中，37 °C培养过夜。₂ 以每分钟200转（rpm）的速度振荡。
   注意：由于血清成分复杂，含有血红素等多种营养性铁来源，会导致实验结果出现变异，因此使用胆固醇替代胎牛血清。
3. 在进行细菌培养的当天，将AGS人胃上皮细胞（ATCC CRL-1739）接种于12孔板中经多聚-D-赖氨酸处理的盖玻片上（约1 × 10⁶个细胞/孔）⁵ 每孔细胞数
4. 次日，用改良布氏肉汤将细菌培养物稀释至OD600为0.3，可单独使用改良布氏肉汤，或添加100 µM FeCl₃，200 µM 二吡啶（一种合成铁螯合剂），或 200 µM 二吡啶加上 250 µM FeCl₃在37 °C、含5% CO₂的空气环境中孵育这些培养物4小时₂ 以200 rpm振荡。
5. 在600 nm处测定菌液的光密度（OD600 = 1.0 = 5.5 × 10⁸ CFU/mL），然后在1,000 × g离心收集菌体，弃去上清液，再用等体积添加胆固醇的新鲜改良布氏肉汤重悬菌体。⁸ 细胞/ml），以感染复数（MOI）20:1将细菌加入上皮细胞。进行系列稀释后，将细菌接种于血琼脂平板，以评估细菌细胞的存活率。
6. 孵育 H. pylori 与AGS人胃上皮细胞共培养4小时 在37 °C、5% CO₂条件下₂ 在进行扫描电子显微镜（SEM）样品制备之前，在静态条件下。

2. 扫描电镜样品制备以观察幽门螺杆菌（H. pylori）Cag-T4SS菌毛

1. 从培养箱中取出 H. pylori 与 AGS 共培养物，倾去培养上清液（留作 IL-8 ELISA 检测用）。用 0.05 M 卡可基酸钠缓冲液（pH 7.4）轻柔清洗三次。在室温下用含 2.0% 多聚甲醛、2.5% 戊二醛和 0.05 M 卡可基酸钠缓冲液的固定液固定样品 2–4 小时。初次固定后，用 0.05 M 卡可基酸钠缓冲液清洗样品三次。
2. 使用 0.1% 四氧化锇溶于 0.05 M 卡可基酸钠缓冲液中进行二次固定，分两个连续的 10 分钟 固定步骤。二次固定后，用 0.05 M 卡可基酸钠缓冲液清洗样品三次。
3. 初次和二次固定完成后，按照 表 1 中的顺序，用浓度递增的乙醇逐步清洗样品以进行脱水。
4. 乙醇脱水后，用液态二氧化碳连续清洗三次。然后使用临界点干燥仪在 31.1 ºC 温度和 1073 PSI 压力下对样品进行临界点干燥。
5. 将盖玻片固定在铝制扫描电镜（SEM）样品台上，并在样品边缘涂上一薄条胶态银，以实现良好接地，避免 SEM 成像过程中产生电荷积累。
6. 使用溅射镀膜仪在样品表面镀上 5 nm 厚的金-钯合金层，以增强样品的二次电子信号和边缘效应。

3. 高分辨率扫描电镜分析的成像参数

1. 使用场发射扫描电子显微镜（FEG-SEM）观察样品。
2. 在高真空模式下成像，工作距离为 5–10 mm。
3. 将加速电压设置为 5 kV。
4. 将束斑大小设置为 2–2.5。
5. 将样品倾斜 15–25 度，以获得更清晰的宿主-病原体界面图像。
6. 优先对黏附在上皮细胞边缘的细菌进行高倍率成像，因为这些宿主-病原体相互作用区域富含形成菌毛的细菌。

4. 评估菌毛定量的统计学分析

1. 使用 ImageJ 软件分析 H. pylori Cag-T4SS 菌毛，按照以下说明定量每细胞的菌毛数量以及呈现菌毛表型的细胞百分比。
2. 在 ImageJ 软件中打开显微照片文件。将菌毛识别为细菌细胞与宿主细胞之间形成的结构，具有均匀的宽度（10–13 nm）和长度（60–150 nm）。
   注意：菌毛结构存在于野生型（WT）细菌菌株中，但在同基因型菌株（如 ΔcagE 突变株）中缺失，后者在编码主要ATP酶的基因上存在失活，该酶为IV型分泌系统菌毛组装提供动力。
3. 使用直线工具画一条线以校准测量工具，然后点击“Analyze”选项卡。从下拉菜单中选择“Set Scale”，将已知的放大标尺数值输入“Known Distance”框中，并将长度单位设置为适当的单位（nm）。点击“OK”。
4. 使用直线工具沿菌毛的长度或宽度划线，然后按“Ctrl-M”测量每根菌毛。观察弹出的对话框中的测量值。记录这些数值，或复制粘贴至电子表格程序中。
5. 采用先前建立的长度和宽度参数²⁴，排除不符合 Cag-T4SS 菌毛特征的结构。然后根据宽度在10–13 nm、长度在60–150 nm范围内的数值统计菌毛数量。
6. 使用 GraphPad Prism 软件，通过双尾 Student’s t 检验对菌毛数量的定量结果进行统计分析。

5. 可选：评估 IL-8 分泌以关联菌毛产生

1. 使用步骤 2.1 的上清液，按照试剂盒说明书（参见材料与设备表）进行 IL-8 ELISA 检测。
2. 分析宿主细胞分泌的 IL-8，并以单独培养基中培养的野生型 PMSS1 为对照，计算 IL-8 诱导百分比。使用 GraphPad Prism 软件进行双尾 Student’s t 检验以完成统计学分析。

结果

本报告表明，在宿主-病原体界面，铁的不同可利用性能够调节 H. pylori Cag-T4SS 菌毛的生物合成。当仅在培养基中培养时，H. pylori 平均每细胞形成 3 根菌毛。当使用合成螯合剂二吡啶（dipyridyl）建立对细菌生长无抑制作用的低铁环境时（图 1），H. pylori 与人胃上皮细胞共培养时会产生大量 Cag-T4SS 菌毛（约 7 根/细胞）（图 2）。相反，当存在外源性营养铁时，Cag-T4SS 菌毛的形成受到抑制（FE 样品中少于 1 根/细胞，FE+DIP 样品中少于 1 根/细胞）（图 2）。在宿主-病原体界面处对菌毛进行定量分析显示，在铁限制条件下，H. pylori 的 Cag-T4SS 菌毛数量增加至 2 倍（p<0.0001），有菌毛的细胞比例增加 11%（p<0.05），相较于仅在培养基中培养的细胞（图 3）。有趣的是，通过宿主 IL-8 分泌量测定的 Cag-T4SS 活性在...

讨论

铁是包括细菌病原体在内的大多数生命形式所必需的微量营养素。脊椎动物宿主通过一种称为“营养免疫”的过程将营养性铁隔离，以限制入侵微生物的生存能力¹⁸。作为应对，细菌病原体已进化出将铁作为全局信号分子来感知周围环境，并调控毒力相关特征的表达，例如铁获取系统、毒素以及毒素分泌机制^19,20。

H. pylori 的生长需要铁、锌和镁等微量营养素²²，并可利用血红素、血红蛋白、转铁蛋白和乳铁蛋白等替代性铁源²³。与大多数成功的病原体一样，H. pylori 进化出多种毒力因子，以帮助其从宿主中获取营养性铁²¹。其中一种毒力因子 CagA 是 Cag-T4SS 的效应分子，可促使极化细胞的转铁蛋白从基底外侧重新定向至顶膜表面，使细菌细胞能够直接利用其作为营养性铁源并促进复制¹⁵。因此，在铁缺乏条件下促进 CagA 的分泌似乎是一种符合直觉的进化策略。

H. pyl...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
改良布氏肉汤
酪蛋白蛋白胨（10 g/L）	Sigma	70172
动物组织胃蛋白酶消化物（10 g/L）	Sigma	70174
酵母提取物（2 g/L）	Sigma	92144
葡萄糖（1 g/L）	Sigma	D9434
氯化钠（5 g/L）	Thermo Fisher	S271-10
胆固醇（250X）（4 ml/L）	Life Technologies	12531018
氯化铁（100 或 250 µM）	Sigma	157740-100G
二吡啶（200 µM）	Sigma	D216305-100G
改良 RPMI 培养基
RPMI+HEPES（1X）	Life Technologies	22400-121
胎牛血清（100 ml/L）	Life Technologies	10438-026
透射电镜样品制备
多聚甲醛（2.0% 水溶液）	Electron Microscopy Sciences	15713
戊二醛（2.5% 水溶液）	Electron Microscopy Sciences	16220
二甲胂酸钠（0.05 M）	Electron Microscopy Sciences	12300
四氧化锇（0.1% 水溶液）	Electron Microscopy Sciences	19150
乙醇（无水）	Sigma	E7023
胶体银导电涂料	Electron Microscopy Sciences	12630
扫描电镜样品台	Electron Microscopy Sciences	75220
盖玻片	Thermo Fisher	08-774-383
IL-8 分泌水平检测
Quantikine IL-8 ELISA 试剂盒	R&D Systems	D8000C