本文介绍了一种用于可视化致癌细菌细胞器——Cag IV型分泌系统（Cag-T4SS）的方法。我们发现，H. pylori在不同铁离子可利用条件下，其表面Cag-T4SS的产生存在差异。
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本文内容
摘要
摘要
Helicobacter pylori 是一种螺旋形、革兰氏阴性细菌，可定植于人类胃部微环境，感染全球约一半人口1,2。H. pylori 是胃癌的主要致病因素，而胃癌是全球癌症相关死亡的第二大原因3。一个与胃部疾病风险增加相关的毒力因子是 Cag 致病岛（Cag-pathogenicity island），这是 H. pylori 染色体上一段约 40 kb 的区域，编码 IV 型分泌系统（type IV secretion system）及其相应的效应分子 CagA4,5。Cag-T4SS 负责将 CagA 和肽聚糖转运至宿主上皮细胞内5,6。Cag-T4SS 的活性可引发宿主细胞生物学的多种变化，包括细胞因子表达上调、促炎信号通路激活、细胞骨架重塑以及致癌性细胞信号网络的诱导5-8。Cag-T4SS 是一种大分子机器，由跨越内膜和外膜并从细胞向外延伸至胞外空间的亚复合物组成。其胞外部分被称为“菌毛”（pilus）5。大量研究表明，Cag-T4SS 菌毛在病原体与宿主细胞相互作用界面处形成9,10。然而，调控这一重要细胞器生物合成的环境因素仍 largely 不明确。近期，我们报道了低铁环境可增强 Cag-T4SS 的活性及菌毛的生物合成。本文中，我们提供了一种优化的实验方案，用于在不同铁可用性条件下培养 H. pylori，以用于后续与人胃上皮细胞的共培养实验。此外，我们还提供了完整的高分辨率扫描电子显微镜分析方案，用于观察在铁限制条件下表现出的超菌毛表型。
引言
H. pylori 感染是胃癌的重要风险因素1然而，疾病结局存在差异，且取决于多种因素，如宿主遗传背景、病原体遗传多样性等 H. pylori 菌株以及宿主饮食等环境因素11已有先前报道证实，两者之间存在相关性 H. pylori 感染、铁缺乏（表现为血液铁蛋白和血红蛋白浓度降低）以及促炎性细胞因子（包括IL-8分泌）产生增加，最终导致胃部疾病进展加剧12急性 H. pylori 感染还与低胃酸症相关，后者会损害宿主对营养性铁的吸收能力，最终导致铁稳态的改变13这些临床发现表明，胃部微环境中铁的可利用性可能是影响疾病转归的重要因素。事实上，动物模型研究 H. pylori 感染研究表明，低膳食铁摄入会加重胃部疾病14这些动物体内的铁水平降低，因此需要 H. pylori 诱导铁获取反应，以获得细菌复制所需的铁。 H. pylori 能够以CagA依赖的方式干扰宿主细胞内的铁转运，从而促进细菌复制15有趣的是， cag-毒力岛已被证实受铁响应性转录因子 Fur 调控16,17此外，Cag+菌株与炎症加剧及胃部疾病（如胃癌）相关。1这些发现支持一种模型，其中 H. pylori 在铁缺乏的环境中，通过改....
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方案
1. H. pylori 不同铁可用性条件下的生长及与人胃上皮细胞的共培养
- 选择 H. pylori 在这些研究中使用菌株 PMSS1，因为它具有完整的 cag 致病岛并表达有功能的IV型分泌系统。同时利用一种同基因型 cagE 突变体（PMSSI ΔcagE）作为阴性对照。将细菌接种于添加5%绵羊血的TSA平板（血琼脂平板）中，培养24小时。 在37 °C、5% CO存在条件下2.
注意：按照材料与设备表中所述准备试剂并组装材料。每种试剂的终浓度均列于括号中。 - 使用无菌棉签从平板上刮取细菌，并接种至由组分配制的改良布鲁氏菌肉汤（见材料与设备表）中，该肉汤需添加胆固醇。将培养物置于含5% CO₂的空气环境中，37 °C培养过夜。2 以每分钟200转（rpm）的速度振荡。
注意：由于血清成分复杂，含有血红素等多种营养性铁来源，会导致实验结果出现变异，因此使用胆固醇替代胎牛血清。 - 在进行细菌培养的当天，将AGS人胃上皮细胞（ATCC CRL-1739）接种于12孔板中经多聚-D-赖氨酸处理的盖玻片上（约1 × 10⁶个细胞/孔）5 每孔细胞数
- 次日，用改良布氏肉汤将细菌培养物稀释至OD600为0.3，可单独使用改良布氏肉汤，或添加100 µM FeCl....
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结果
本报告表明，在宿主-病原体界面，铁的不同可利用性能够调节 H. pylori Cag-T4SS 菌毛的生物合成。当仅在培养基中培养时，H. pylori 平均每细胞形成 3 根菌毛。当使用合成螯合剂二吡啶（dipyridyl）建立对细菌生长无抑制作用的低铁环境时（图 1），H. pylori 与人胃上皮细胞共培养时会产生大量 Cag-T4SS 菌毛（约 7 根/细胞）（图 2）。相反，当存在外源性营养铁时，Cag-T4SS 菌毛的形成受到抑制（FE 样品中少于 1 根/细胞，FE+DIP 样品中少于 1 根/细胞）（图 2）。在宿主-病原体界面处对菌毛进行定量分析显示，在铁限制条件下，H. pylori 的 Cag-T4SS 菌毛数量增加至 2 倍（p<0.0001），有菌毛的细胞比例增加 11%（p<0.05），相较于仅在培养基中培养的细胞（图 3）。有趣的是，通过宿主 IL-8 分泌量测定的 Cag-T4SS 活性在.......
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讨论
铁是包括细菌病原体在内的大多数生命形式所必需的微量营养素。脊椎动物宿主通过一种称为“营养免疫”的过程将营养性铁隔离，以限制入侵微生物的生存能力18。作为应对，细菌病原体已进化出将铁作为全局信号分子来感知周围环境，并调控毒力相关特征的表达，例如铁获取系统、毒素以及毒素分泌机制19,20。
H. pylori 的生长需要铁、锌和镁等微量营养素22，并可利用血红素、血红蛋白、转铁蛋白和乳铁蛋白等替代性铁源23。与大多数成功的病原体一样，H. pylori 进化出多种毒力因子，以帮助其从宿主中获取营养性铁21。其中一种毒力因子 CagA 是 Cag-T4SS 的效应分子，可促使极化细胞的转铁蛋白从基底外侧重新定向至顶膜表面，使细菌细胞能够直接利用其作为营养性铁源并促进复制15。因此，在铁缺乏条件下促进 CagA 的分泌似乎是一种符合直觉的进化策略。
H. pyl.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究得到了美国退伍军人事务部职业发展奖 1IK2BX001701 和美国国家转化科学促进中心 CTSA 奖项 UL1TR000445 的支持。本研究内容完全由作者负责，不代表美国国家转化科学促进中心或美国国立卫生研究院的官方观点。扫描电子显微镜实验部分通过范德堡大学医学中心细胞成像共享资源完成，该资源得到了美国国立卫生研究院资助 CA68485、DK20593、DK58404、DK59637 和 EY08126 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 改良布氏肉汤 | |||
| 酪蛋白蛋白胨（10 g/L） | Sigma | 70172 | |
| 动物组织胃蛋白酶消化物（10 g/L） | Sigma | 70174 | |
| 酵母提取物（2 g/L） | Sigma | 92144 | |
| 葡萄糖（1 g/L） | Sigma | D9434 | |
| 氯化钠（5 g/L） | Thermo Fisher | S271-10 | |
| 胆固醇（250X）（4 ml/L） | Life Technologies | 12531018 | |
| 氯化铁（100 或 250 µM） | Sigma | 157740-100G | |
| 二吡啶（200 µM） | Sigma | D216305-100G | |
| 改良 RPMI 培养基 | |||
| RPMI+HEPES（1X） | Life Technologies | 22400-121 | |
| 胎牛血清（100 ml/L） | Life Technologies | 10438-026 | |
| 透射电镜样品制备 | |||
| 多聚甲醛（2.0% 水溶液） | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| 戊二醛（2.5% 水溶液） | Electron Microscopy Sciences | 16220 | |
| 二甲胂酸钠（0.05 M） | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| 四氧化锇（0.1% 水溶液） | Electron Microscopy Sciences | 19150 | |
| 乙醇（无水） | Sigma | E7023 | |
| 胶体银导电涂料 | Electron Microscopy Sciences | 12630 | |
| 扫描电镜样品台 | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
| 盖玻片 | Thermo Fisher | 08-774-383 | |
| IL-8 分泌水平检测 | |||
| Quantikine IL-8 ELISA 试剂盒 | R&D Systems | D8000C |
参考文献
- Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. (6), 1863-1873 (2009).
- Sycuro, L. K., et al. Peptidoglycan crosslinking relaxation promotes Helicobacter pylori's helical shape and stomach colonization. Cell. 141
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重印与许可
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