优化的 体外培养 培养鸡胚胎至发育的较晚阶段

摘要

在发育过程中观察和接触鸡胚具有一定的挑战性。我们开发了一种简单、经济的体外培养（ex ovo）方法，可广泛应用于课堂教学或科研环境。该方法能够使研究者在胚胎发育的较晚阶段（HH 40期）仍可方便地接触胚胎。

摘要

解剖学、胚胎学和发育生物学的研究在很大程度上依赖于模式生物。为了在活体胚胎中研究发育过程，通常使用鸡等模式生物。鸡是一种理想的模式生物，因其成本低廉且饲养简单，但由于其胚胎被包裹在不透明的蛋壳内，观察上存在挑战。为了清晰地观察胚胎的发育过程，必须对蛋壳进行开窗或完全去除。目前已有开窗法和体外（ex ovo）培养技术，以帮助研究人员研究胚胎发育。然而，这些方法均存在一定的局限性和操作难点。本文介绍一种简便且经过优化的鸡胚胎体外（ex ovo）培养技术，可实现从HH 19期到发育晚期（HH 40期，此时多数器官已形成）的胚胎发育过程的持续观察。该技术易于在本科教学课程以及开展胚胎操作的高级研究实验室中推广应用。

引言

体外孵化 培养在鸡胚胎发育研究中发挥了重要作用^{1, 2}该培养方法已被用于研究神经系统疾病、肢体发育、颅面发育，以及作为探究与糖尿病相关畸形的模型。 ^{3, 4, 5}.

在ex ovo技术中存在多种变异方法。最常见的方式是使用聚苯乙烯泡沫杯^6,7,8或玻璃碗⁵。在这些方法中，将塑料薄膜衬在杯或碗内以托住胚胎，然后在杯口加盖，并将整个装置置于具有适当湿度的培养箱中⁶。然而，这种设置在技术上具有挑战性。第一个挑战是用于托持胚胎的塑料薄膜。这种薄膜操作困难，且通常难以很好地贴附在杯壁上。为解决此问题，需在杯外缠绕弹性带以固定薄膜。即便如此，薄膜仍可能滑脱，这对胚胎是致命的。此外，塑料薄膜有可能被操作过程中使用的镊子或针头刺破或撕裂。最后，该装置稳定性差，学生容易碰倒杯子。杯子的高度也使得将胚胎置于体视显微镜下观察变得极为困难，因为显微镜物镜到载物台的高度有限。这些困难使得本科生在教学实验课（如高级发育生物学课程）中操作活体鸡胚极具挑战性。

上述 ex ovo 方法中的挑战使得研究人员转而采用开窗法^9,10来观察鸡胚的发育过程。该技术是在覆盖胚胎的蛋壳上开一个孔或“窗口”，之后可用胶带或石蜡⁹将孔封闭，以允许胚胎继续发育。尽管开窗法具有一些优势，例如便于观察胚胎发育且易于维护，但该方法也存在若干局限性。其一是为了观察整个胚胎（尤其是在发育后期阶段），窗口必须开得足够大；其二是较大的窗口难以有效密封，密封不当会导致污染和胚胎存活率下降的问题。使用熔融石蜡作为密封材料还会为实验流程增加额外不便且繁琐的步骤。因此，尽管开窗法可能适用于早期鸡胚（HH 11 – HH 27）的研究，但在后期阶段完整观察整个胚胎仍难以实现。

本文介绍了一种改进且简便的体外（ex ovo）培养技术¹¹，该方法无需使用高精尖设备，在体视显微镜下操作简便，能够为胚胎提供足够的支撑以进行显微操作，并使研究人员能够完整观察胚胎在发育后期阶段（直至HH 40-41期）的生长过程。随着体外（ex ovo）培养技术的这些进步，研究者可以获得对胚胎发育更为全面的理解。例如，胚胎发育至后期阶段后，可观察到一些直到该时期才发生的发育过程，如骨化、羽毛发育以及四肢和眼睛的进一步发育。整个胚胎及其胚外膜和脉管系统均清晰可见。此外，还可开展更深入的研究，例如胚胎操作（即植入浸有抑制剂的琼脂糖珠或在组织层之间插入屏障），随后研究人员能够观察这些操作对后期胚胎发育所产生的影响。

方案

注意：所有耗材均列于表1中。

1. 鸡胚的保存

1. 将 Gallus gallus 品系的鸡胚蛋水平放置于 37^oC、相对湿度约 40% 的条件下孵育，并每日翻蛋一次或两次。翻蛋对于防止胚胎黏附于蛋壳至关重要。
2. 在进行培养设置前 24 小时 内不要翻动蛋，否则胚胎将位于卵黄团腹侧，在第 3 步打开蛋时会受到损伤。此外，孵化前将蛋保存在 4^oC 的时间不应超过一周，以“暂停”其发育，但此做法并非理想。

2. 鸡胚发育分期

1. 使用Hamburger和Hamilton¹²分期表对鸡胚进行分期。ex-ovo 培养的理想时期为HH 19-20期（孵化约3天），因为此时刚经历53小时后的头部转动阶段。
   注意：HH 19-20期的形态学特征如下：体节已延伸至尾部大部分区域，但尾部末端仍保持未分节状态，尾芽呈卷曲状，尿囊较小且血管分布有限，腿部芽体大于翼芽，眼睛无色素或呈灰暗色调。

3. 从蛋壳中取出胚胎

1. 在将胚胎从蛋壳中取出之前，用70%乙醇喷洒蛋壳并使其干燥。切勿快速翻转鸡蛋，以免损伤胚胎。
2. 注意保持鸡蛋方向不变，小心地在鸡蛋的下侧（即孵化期间朝下的腹侧）敲裂蛋壳，并将胚胎释放到无菌称量皿（88 × 88 × 23 mm）中。用70%乙醇擦拭称量皿表面。检查胚胎，确保卵黄囊未受损。若卵黄破裂，应丢弃该胚胎，因其无法存活。
3. 观察胚胎以确认其具有活性：心脏正在跳动，血管结构正常，无明显异常。确保称量皿边缘干燥。
4. 使用移液器，在蛋清上方滴加40 μl青霉素/链霉素溶液（每毫升含5,000单位青霉素和5 mg链霉素），以帮助防止感染。

4. 准备湿度培养箱

1. 在已用70%乙醇擦拭过的无菌塑料容器（12 × 12 × 6 cm）底部放置一小叠无尘纸和/或由棉花制成的吸水垫。
2. 加入无菌蒸馏水以润湿无尘纸和/或棉花（约150 ml水）。

5. 构建卵外培养体系

1. 将装有胚胎的称量舟放置在湿润的垫料上方，然后将一半的无菌培养皿（9.5 × 9.5 cm）盖在称量舟上，作为松散的盖子。
2. 用盖子盖住塑料容器，按压盖子的两个角落，确保形成部分密封，同时仍允许腔室内有良好的空气流通。
3. 小心地将整个装置放入 37^oC 培养箱中，直至达到所需发育阶段。
4. 若无恒定湿度的培养箱，可在培养箱内放置盛水容器以帮助控制湿度。所有用于湿度控制的水及培养箱内的水均需灭菌，并在培养期间根据需要及时补充。理想的湿度为 40%。

结果

这种ex ovo方法可用于观察从发育早期阶段（HH 19/20）到晚期阶段（HH 40-41）的胚胎（图1A和1B）。在HH 19-20阶段建立培养体系可提高胚胎在培养中的存活率。在头部转动之前（53 hpf前），胚胎在培养中的存活率极低；而在21期之后，胚胎在取出时更容易粘附于蛋壳，导致获得的完整胚胎数量减少。总体而言，胚胎在ex ovo培养中的存活率在HH 35-36期之前较高（90-100%），但在更晚期的发育阶段存活率会下降（约40%可存活至HH 40-41期）。此外，尽管已有研究表明，在这些晚期阶段胚胎发育外观正常，且骨骼的模式形成未受影响^4,15，但我们观察到在晚期阶段肢体出现弯曲现象，提示骨化程度或骨化时间可能受到影响。考虑到骨化过程需要来自蛋壳的钙质，这一现象并不意外。目前正在进行胚胎发育与对照组的详细比较研究，相关内容已超出本方法学论文的范围。

在整个发育过程中获得对胚胎的访问权限至关重要，主要原因有两个。首先，研究人员能够每天观察发育过程...

讨论

体外孵化 培养和开窗各有其优势与挑战。在此，我们比较泡沫杯法的优势与挑战 体外 方法和窗口化方法应用于我们的优化 体外 此处展示的方法。我们的方法能够实现对发育晚期鸡胚的操作和便捷观察，并对传统方法进行了改进 体外 方法^{1, 2, 3} 使其在本科生教学实验课程中使用更加简便。

尽管许多研究人员倾向于采用开窗法来研究鸡胚发育，因为该方法操作简便且胚胎在后期发育阶段（HH 41-42）具有较高的存活率，但该方法也存在局限性。其中最主要的问题是在HH 30期之后难以完整观察整个胚胎。在HH 30期之后，为了观察不断生长和活动的胚胎，蛋壳上的开窗必须非常大。如此大的窗口难以完全密封（从而导致无菌性和存活率方面的问题），并且在蛋内获得良好的照明也较为困难。此外，晚期胚胎体积较大，通过窗口对其进行观察、操作或处理均较为困难。

本文所述的ex ovo方法可完全无阻碍地接触胚胎。一旦将称量皿放入湿度 chamber 中，整个装置便非...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
青霉素/链霉素	Sigma	P4458	分装成小份以避免冻融循环
方形培养皿			9.5 cm x 9.5 cm
称量舟	Fischer Scientific	8732113	88 x 88 x 23 mm
自封袋容器	Ziplock	N/A	12 cm x 12 cm x 6 cm