本文介绍一种基于荧光的引物延伸方法，用于确定细菌转录本的转录起始位点及RNA加工情况 体内 使用自动凝胶测序仪。
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本文内容
摘要
摘要
基于荧光的引物延伸（FPE）是一种用于确定RNA分子转录起始点或加工位点的分子方法。该方法通过使用特异性荧光标记的引物对目标RNA进行逆转录，随后通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析生成的cDNA片段。同时，在凝胶上运行传统的桑格测序反应，以将cDNA片段的末端精确定位到其对应的碱基位置。与5'-RACE（cDNA末端快速扩增）技术不同，后者需要对产物进行克隆并测序多个候选克隆，而引物延伸产生的大量cDNA片段可在一次凝胶电泳中同时被检测。此外，整个实验流程（从逆转录到最终结果分析）可在一天内完成。通过使用荧光标记的引物，可避免使用具有危害性的放射性同位素标记试剂，并且由于产物可在电泳过程中直接检测，处理时间也得以缩短。
在以下实验方案中，我们描述了一种体内荧光引物延伸方法，可可靠且快速地检测RNA的5'端，以推断金黄色葡萄球菌（S. aureus）、大肠杆菌（E. coli）及其他细菌中的转录起始点以及RNA加工位点（例如，由毒素-抗毒素系统组分介导的加工位点）。
引言
引物延伸1是一种分子生物学方法，可用于以单碱基分辨率确定特定RNA分子的5’端。与其他方法（如5’-RACE（cDNA末端快速扩增））相比，该方法的优势在于实验周期短，并且能够轻松分析不同长度RNA分子的混合物。
该方法通过使用特异性的荧光引物对RNA分子进行逆转录反应，生成特定长度的cDNA片段。这些cDNA分子与传统的Sanger测序反应2一同在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，由于使用了荧光标记的引物，可通过荧光检测到cDNA分子。通过与测序梯度标记物比较cDNA片段的长度，从而实现对RNA 5’端的定位作图。
传统上，引物延伸反应结合放射性同位素使用，以在X射线胶片上检测cDNA分子。由于放射性物质存在健康风险、废物处理问题且操作不便，较新的实验方案采用荧光标记结合自动测序仪来检测引物延伸产物，尽管其灵敏度略低。使用荧光标记的引物后，可省去重复的放射性标记步骤，因为荧光引物具有长期稳定性（据我们经验，可稳定保存一年以上）。
本文所述方法采用自动凝胶测序仪，但经过稍加改进后，毛细管测序仪也可用于cDNA的分离与检测3。凝胶分析的并行特性使其能够检测到极微量的RNA切割或加工事件。另一个优势在于该方法具有高分辨率，甚至可以检测到仅一个碱基的末端切割或加工。
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方案
1. 高产量RNA制备
- RNA 提取
注意：引物延伸反应需要较高浓度的总 RNA。通常，离心柱试剂盒无法获得所需的 RNA 量（约 5 - 16 µg，溶于 5 µl 体积中）。因此，建议采用酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取法进行纯化，具体步骤如下。
注意：苯酚具有致癌性、毒性和腐蚀性。请阅读材料安全数据表，并在通风橱内佩戴适当防护装备操作！- 按实验需求培养或处理细菌细胞（本示例中为 S. aureus 或 E. coli），通过在 4 °C 条件下以 4,600 × g 离心 10 分钟收集细胞。注意：通常我们收集总 OD600 为 20 - 70 的菌体。细胞沉淀可在 -20 °C 下保存数周。
- 将细胞沉淀重悬于 1 ml 酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿溶液中，并转移至含有 0.5 ml 0.1 mm 玻璃锆/二氧化硅珠的 2 ml 螺口管中。
- 使用快速破碎仪或珠磨机在 6.5 m/sec 条件下裂解细胞，每次 30 秒，共进行三轮，每轮之间将样品置于冰上冷却 5 分钟。注意：均质化后的样品可在 -80 °C 下保存数周。
- 在室温孵育裂解液 5 分钟，然后加入 200 µl 氯仿。
- 剧烈振荡或涡旋样品 30 秒以提取 RNA。
- 室温孵育 3 分钟后，在 4 °C 条件下以 13,000 ....
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结果
如图6所示，可通过引物延伸反应确定目标转录本的转录起始位点，并有助于推断启动子区域（通常由-10和-35元件识别）。最上方（最长）的cDNA片段代表mRNA的5’端，因此在与测序梯度标记比较时可轻松定位。
图6. 引物延伸反应的代表性结果左侧为完整 体内 引物延伸凝胶来自 E. coli 使用不同质粒的结果如图所示。感兴趣区域已放大。上部分 （A），对的测定 ompA 转录起始点被标示。逆转录在m.......
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讨论
荧光引物延伸是一种简单快速的方法，用于确定RNA的5’端，既可用于TSP识别，也可用于二级RNA加工的鉴定。由于使用了荧光标记的引物，该反应的设置和运行无需额外的安全防护措施（与放射性标记引物的情况不同）。由于样品通过荧光检测，可在电泳进行过程中实时成像，相比通常使用X光胶片的放射性方法，可实现更快速的分析。
通常，引物延伸反应的质量在很大程度上取决于引物的纯度及其结合能力。如果结合位点选择得距离目标区域过近，可能会产生引物拖尾现象而掩盖信号；而若结合位点距离5’端过远（>300 bp），则可能导致信号微弱。
在合成过程中，荧光染料必须共价连接至定制DNA寡核苷酸的5’端，且该寡核苷酸应通过HPLC纯化，以避免残留盐类对逆转录反应产生干扰。带有适当染料修饰的寡核苷酸（有关兼容染料的更多信息，请参见试剂列表表格）可向大多数寡核苷酸合成公司订购，并应避光保存。遗憾的是，目前我们尚不了解任何可将染料酶促连接至已有寡核苷酸的方法，而放射性标记核苷酸则可实现此类标记。
在此.......
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披露
作者声明无任何可能构成利益冲突的事项需要披露。
致谢
感谢Anne Wochele在实验室中的协助，以及Vera Augsburger在自动凝胶测序仪使用方面的帮助。感谢德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）通过“重点计划”SPP1316和SPP1617中的资助项目BE4038/2和BE4038/5提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AMV 逆转录酶（20-25 U/μL）µl) | NEB / Roche | NEB: M0277-T / Roche: 10109118001 | |
| DNase I（RNase-free） | Ambion（Life Technologies） | AM2222 | |
| FastPrep-24 仪器 | MPBio | 116004500 | |
| 荧光标记引物 | Biomers | n/a | 5’ DY-681 修饰 “普通” DNA 寡核苷酸。兼容的染料（如 LICOR IRDye 700/800）也可从其他供应商（如 IDTdna）获得。 |
| Li-Cor 4200 测序仪，含 ImagIR 数据采集软件 | Li-Cor | 产品已停产 | |
| NanoDrop 2000 | 赛默飞世尔科技 | ||
| 无核酸酶水 | Ambion（Life Technologies） | AM9915G | |
| 质粒小提试剂盒 | QIAGEN | 12125 | |
| RapidGel-XL-40% 浓缩液 | USB | US75863 | |
| RNA储存缓冲液 | Ambion（Life Technologies） | AM7000 | |
| Roti-Aqua-P/C/I | 卡尔·罗斯 | X985.3 | 替代方案： “酸性酚-氯仿，pH 4.5（含IAA，125:24:1）” 来自 Ambion (AM9720) |
| SUPERase•在RNase抑制剂中 | Ambion（Life Technologies） | AM2696 | |
| 含7-脱氮-dGTP的Thermo Sequenase荧光标记引物循环测序试剂盒 | GE Healthcare | RPN2538 | |
| TRIzol试剂 | 生命技术公司 | 15596-026 | |
| 氧化锆/二氧化硅珠 0.1 mm | BioSpec | 11079101z |
参考文献
- Simpson, C. G., Brown, J. W. Primer extension assay. Methods Mol. Biol. 49, 249-256 (1995).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467 (1977).
- Fekete, R. A., Miller, M. J., Chattoraj, D. K.
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