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优化人源间充质干细胞在聚(ε-己内酯)电纺纱线上的贴附

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DOI：

10.3791/52135

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2015年4月10日

 ,  , 
1School of Materials, The University of Manchester

本文内容

摘要

本文介绍了一系列将人源间充质干细胞接种到材料（本实验中为电纺纱线）上的方法，这些材料未覆盖标准培养板底部，旨在与已知的接种密度相比，最大化并量化最初贴附的细胞数量。

摘要

生物材料与组织工程研究通常包括基于细胞的 体外 研究需要了解起始细胞数量。尽管研究人员通常会参考其接种密度，但这并不一定反映实际黏附到目标材料上的细胞数量。对于未覆盖标准细胞培养板底部的材料或支架而言，这一问题尤为突出。本研究探讨了在培养4小时后，将已知数量的人类间充质干细胞接种到电纺聚(ε-己内酯)纤维上时的初始黏附情况。电纺纤维被固定在多种不同装置中，包括以9 rpm旋转的生物反应器容器、置于低结合力培养板中的细胞培养小室，以及放置于培养皿内的聚四氟乙烯（PTFE）槽。后两种装置分别在静态条件下培养，或置于摇板上（30 rpm）进行震荡培养。 rpm。37℃孵育4小时后 oC，5% CO2通过细胞DNA检测确定了接种细胞的位置。将支架从容器中取出并置于裂解缓冲液中。培养基组分同样被移除并进行离心，弃去上清液，沉淀用裂解缓冲液重悬。向每个容器或孔中加入裂解缓冲液，并刮取以释放可能存在的任何细胞。通过细胞DNA检测测定存在于支架、培养基及孔组分中的细胞百分比。所有实验设置中的细胞黏附率均较低，其中以置于细胞培养插入物内并施加振荡运动的纱线表现出最高的黏附率（30%）。该研究强调了实际黏附至支架上的细胞数量，而不论所标注的细胞接种密度如何。

引言

支架材料正被常规地开发并用于生物材料和组织工程领域的研究与应用。因此，它们通常会被接种细胞，并对其 体外 通过测定细胞增殖和细胞数量等实验方法来表征行为，例如。对于此类实验，明确初始细胞数量至关重要，研究人员通常以每毫升或每平方厘米的细胞数量来表示接种浓度2尽管这是一种良好的操作方式，尤其适用于放大生产，但它并未考虑实际黏附于支架表面的细胞数量（该数量还取决于生物材料表面的黏附特性）。1）。这一点对于那些未覆盖细胞培养板孔底部的支架材料尤为明显，因为细胞可能会从支架上脱落，并且由于实验通常处于静态条件，可能再也不会与目标材料接触。电纺纤维纱线就是一个未覆盖孔底的支架实例。图1A此时应使用未经表面处理的低吸附孔板，以防止细胞贴附于孔板表面，从而避免对基于孔板的检测结果造成干扰。

培养板常用于将细胞接种到支架上，但并非唯一可用的方法。旋转式细胞培养系统是一种由美国国家航空航天局（NASA）生命科学部在20世纪80年代末开发的生物反应器，也可用于在模拟微重力的三维（3D）环境中对支架进行细胞接种。此类生物反应器至今仍受到全球研究人员的广泛青睐，并已被应用于细胞信号传导2,3、干细胞4,5和组织工程6,7等研究中。与培养板相比，旋转式生物反应器的优势在于能够维持三维环境，有助于防止已分化细胞发生去分化，而这种情况在传统的二维培养条件下常常出现8。

本文研究了在Bosworth制备的电纺聚(ε-己内酯)纤维纱线上接种人源间充质干细胞的不同技术。 等.,9 为了在4小时内最大化细胞在这些支架上的初始黏附数量。对于二维培养，将纱线牢固地固定在孔板或定制的聚四氟乙烯（PTFE）槽中，并在静态条件下培养，或以30 rpm振荡培养。对于三维培养，将纱线与细胞置于生物反应器容器中，并以9 rpm旋转培养。

方案

1. 支架的制备与灭菌

  1. 将PCL溶解于1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇中，配制成10% w/v浓度的溶液。参照Bosworth et al.9 所述方法，对聚合物溶液进行电纺（参数：20 kV，1 ml/hr，20 cm），并在旋转芯轴（600 rpm）边缘收集取向纤维。用手术刀取下收集的纤维带，然后剪成较短的片段——3 cm（用于槽式装置和旋转反应器）和4 cm（用于细胞培养插件）。
  2. 使用精细镊子将单个纤维条浸入蒸馏水中，随后取出。
  3. 用拇指和食指捏住纤维条两端，手动扭转至其呈现线状结构。
  4. 将呈线状的支架短暂浸入蒸馏水中，然后置于洁净、无纤维的卡片上晾干。
  5. 干燥后，将支架单独放入洁净的微量离心管中，并加入1 ml 50% v/v乙醇水溶液。盖紧管盖，静置24小时。
    注意：以下步骤需在层流条件下操作：
  6. 将微量离心管放入层流柜中，吸除50% v/v乙醇溶液，替换为1 ml 70% v/v乙醇水溶液，盖紧管盖，静置24小时。
  7. 依次用90%和100% v/v乙醇水溶液（每次1 ml）重复上述步骤。
  8. 用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗支架两次，每次24小时 （每次1 ml，共两次）。
  9. 吸除PBS，替换为1 ml细胞培养基。注意：支架在孵育24小时后即可使用。

2 . 测定支架表面积和细胞数量

  1. 使用光学显微镜和成像软件，沿电纺纱线的长度方向测量其直径，以确定平均值。
  2. 假设纱线为圆柱形杆状结构，并使用以下公式估算其表面积：
  3. 其中 A = 表面积，r = 半径，h = 长度
    注意：计算得到的表面积为 18,902,800 µm2。此外，应注意的是，实际表面积将大于该计算值，因为纱线由数百根细纤维组成，这会增加总表面积。因此，更多的细胞能够附着在支架表面。然而，这并不影响各测试组之间的直接比较。
  4. 通过以下方法确定可附着在暴露支架表面的最大细胞数量：
    注意：使用光学显微镜和成像软件测得人源间充质干细胞的直径为 20 µm（假设细胞呈圆形），因此在本例中，细胞数量 = 60,200。

3. 支架设置——细胞培养小室（图1A）

  1. 在层流条件下，打开无菌的6孔细胞培养插件，将带齿的较窄环与较宽的环状主体分开。
  2. 取带齿端朝上的环，将一块4 cm的支架覆盖在环的中心位置，确保其两侧均有重叠。取环状主体，将其对准带齿环和支架并向下按压，确保支架保持原位，并位于细胞培养插件的中央。
  3. 将带有支架的细胞培养插件放入6孔低吸附培养板的孔中。
  4. 向支架中加入10 ml培养基。

4. 支架设置——槽式装置（图1B）

  1. 在层流条件下，将聚四氟乙烯（PTFE）槽放入各自的培养皿中，并向槽内加入 10 ml 培养基。
  2. 用镊子将一块 3 cm 的支架放入槽中，确保其长度方向与槽的长边平行。

5. 支架设置——生物反应器容器（图1C）

  1. 在层流条件下，通过生物反应器容器的主端口加入 10 ml 无菌 PBS，静置 10 分钟。
  2. 移除 PBS，并替换为 8 ml 培养基。
  3. 使用镊子，通过主端口将一块 3 cm 的支架插入容器中。
  4. 封闭主端口。

6. 细胞计数

  1. 按照生产商提供的操作规程，培养来源于骨髓的人类间充质干细胞（hMSC），在收获前传代至第4代。
  2. 吸除含有来源于骨髓的人类间充质干细胞（hMSC，第4代，80%融合度）的75 cm2培养瓶中的培养基。
  3. 用10 ml无菌PBS洗涤细胞，然后吸除PBS。
  4. 加入3 ml胰蛋白酶，将培养瓶置于37 °C、5% CO2条件下孵育，直至细胞从培养瓶表面脱落。
  5. 加入7 ml培养基以终止酶反应，并将全部液体（共10 ml）转移至离心管中。
  6. 通过反复吹打数次重新悬浮细胞，使细胞在培养基中均匀分散，并减少细胞团块的形成（使用10 ml移液器）。
  7. 取20 µl细胞悬液，转移至血细胞计数板。
  8. 将血细胞计数板置于光学显微镜下，使用10倍物镜进行观察和成像。
  9. 调节焦距使网格线清晰，计数网格四个角上每个4×4小方格内的细胞数量，包括位于方格内部的细胞以及接触右侧或下侧边界线的细胞。每组4×4方格均需计数（每个网格计数4次）。
  10. 重复细胞重悬和计数步骤三次（步骤6.6–6.9）。
  11. 计算平均细胞数，并确定细胞重悬所需的培养基体积（细胞浓度为60,200个细胞/200 µl）。例如，先根据血细胞计数板读数计算平均细胞数，再计算三次独立计数的总体平均细胞数。将该数值乘以1×104，得到每毫升的细胞数，再乘以细胞悬液的总体积，得到总细胞数。使用以下公式计算重悬所需的培养基体积：
  12. 将细胞悬液在241 x g条件下离心5分钟。

7. 细胞接种

  1. 从离心管中吸出培养基，保留细胞沉淀，并加入计算好的培养基体积。
  2. 重悬细胞与培养基，使其混合均匀。
  3. 使用P200 Gilson移液器，沿支架长度方向并在液面以下缓慢将200 µl细胞悬液滴加到每个支架上。静置20分钟，勿扰动。
  4. 对于生物反应器容器，通过主端口加入200 µl细胞悬液，再通过注射端口补加剩余的2 ml培养基，使总体积达到10 ml。

8. 实验开始

  1. 将生物反应器容器转移至 RCCS-4DQ 生物反应器中，并设置转速为 9 rpm。
  2. 将含有细胞培养插件和储液槽的培养板转移至摇板机上，并设置转速为 30 rpm。
  3. 将含有细胞培养插件和储液槽的培养板转移至设定为 37 °C、5% CO2 的细胞培养箱搁板上（静态培养）。

9. DNA 检测

  1. 按照制造商说明书配制溶液——裂解缓冲液、1× TE 缓冲液、DNA 标准品和细胞 DNA 工作液。
  2. 4 小时后，将样品从培养箱中取出，并置于层流罩下。
  3. 从所有样品中移除培养基组分，并转移至单独标记的离心管中。以 241 × g 离心，弃去上清液，加入 3 ml 裂解缓冲液。重悬沉淀，以充分分散细胞沉淀。
  4. 使用镊子取出支架，放入含有 3 ml 裂解缓冲液的离心管中（对于生物反应器容器内的支架，在吸除培养基前先取出支架）。对于置于细胞培养插件中的支架，首先使用手术刀在靠近插件边缘处切割，将支架释放。
  5. 向每个支架容器中加入 3 ml 裂解缓冲液，并刮取表面（对于生物反应器容器需剧烈震荡）。收集裂解缓冲液，并转移至单独标记的离心管中。
  6. 将每支离心管涡旋振荡约 1 分钟，以确保细胞与缓冲液充分混匀，并促进细胞膜裂解。
  7. 在黑色 96 孔板中，为每个样品组分（支架、培养基和孔壁）分别加入 100 µl 裂解缓冲液（设重复孔）。
  8. 在避光条件下，向所有含裂解缓冲液的孔中加入 100 µl 细胞 DNA 溶液，并轻轻混匀。
  9. 设置不含 DNA 的裂解缓冲液孔和仅含细胞 DNA 溶液孔，作为 96 孔板的阴性对照和阳性对照。
  10. 使用荧光酶标仪，以 485 nm 激发波长和 520 nm 发射波长测定各孔的荧光吸光度。
  11. 根据制造商说明书提供的 DNA 标准品绘制的标准曲线，对所得数据进行比对分析。

10. 扫描电子显微镜（SEM）固定

  1. 在层流条件下执行以下步骤：4 小时后，将所有支架从其容器中取出，并放入新的 6 孔板中（分别置于不同孔内）。
  2. 用 PBS 清洗支架两次。
  3. 在开放实验台面上执行以下步骤：向每个孔中加入 2 ml 的 1.5% v/v 戊二醛 PBS 溶液，确保支架完全被覆盖。
  4. 将板置于 4 °C 下静置至少 30 分钟 以固定细胞。
  5. 移除固定液，并用 PBS 将支架清洗两次。
  6. 使用蒸馏水中逐步增加浓度的乙醇对支架进行脱水处理，依次为 50% v/v、70% v/v 和 90% v/v。每种浓度下，将支架完全浸入溶液（2 ml）中，静置 3 分钟。弃去溶液后重复一次。
  7. 用 100% 乙醇脱水：将支架完全浸入溶液（2 ml）中，静置 5 分钟。弃去溶液后重复一次。
  8. 在通风橱内使用六甲基二硅氮烷（HMDS）对支架进行化学干燥：将支架浸入 HMDS（2 ml）中，静置 5 分钟。移除 HMDS 后重复一次。
  9. 移除 HMDS 并让支架自然干燥。将支架安装在市售的扫描电镜样品台（本实验中使用带导电碳胶的不锈钢样品台）上。
  10. 为便于在扫描电镜中观察，使用金溅射镀膜仪对样品镀膜 2 分钟 ，以确保形成均匀且薄层的覆盖。
  11. 将样品放入扫描电镜中，使用 5 KeV 电子束观察接种细胞的支架。

结果

结果展示了每种实验条件下接种后4小时的细胞分布情况。图2A显示了在此期间已附着于支架表面的细胞百分比。通过使用8.5 pg/细胞的换算因子，将测得的DNA含量转换为细胞数量，从而计算出细胞附着率10。在所有研究的接种条件下，细胞附着率均相对较低，其中以置于细胞培养插件中并在30 rpm条件下振荡的支架附着率最高（30%）（插件振荡组）；而置于细胞培养插件中并保持静态培养的支架附着率最低（15%）（插件静态组）。

在培养基组分中存在大量细胞（图2B），尤其是放置于低吸附培养板中的细胞培养插件（Insert Static）以及旋转培养容器中的细胞比例分别为50%和51%。放置于槽式装置中的支架显示出支架本身所携带的细胞数量有所增加——Trough Shaker组支架中细胞占48%，Trough Static组占50%。

扫描电子显微镜可用于对接种细胞的支架进行直观评估（图3）。代表性图像显示，无论接种方式如何，纤维表面的细胞数量均较为有限。然而，在细胞培养插件中放置并以30 rpm振荡的支架上，细胞数量及细胞聚集体明显更多（Insert Shaker）。

在孔板、聚四氟乙烯槽和生物反应器中培养电纺纱线的细胞培养装置。
图1. 电纺纱线被固定的实验装置；（A）细胞培养插件与低吸附孔板；（B）聚四氟乙烯（PTFE）槽与培养皿；以及（C）生物反应器容器。请点击此处查看该图的高清版本。

细胞接种效率图表；附着于支架的细胞百分比，按不同设置分布，图示分析。
图 2. 使用不同接种装置在 PCL 电纺纱线上接种细胞 4 小时后细胞的位置分布。(A) 显示已附着于 PCL 支架上的细胞百分比（均值 ± 标准差）；(B) 突出显示细胞在三个部分（培养基、孔板和支架）中分布的百分比（n = 4，数据以均值表示）。请点击此处查看该图的高清版本。

扫描电镜显微照片、组织支架、无细胞、摇床、静态、容器、100 µm 比例尺、实验装置。

图3. 不同实验条件下，PCL电纺纱线接种人源间充质干细胞4小时后的代表性扫描电子显微镜图像。（所有图像放大倍数为1,000倍，比例尺 = 130 µm。）请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

由生物聚合物制备的静电纺丝纤维基质常用于支持细胞黏附和增殖，适用于生物材料和/或组织工程应用11,12。在这些情况下，基质通常是较薄的纤维片层，能够轻易覆盖细胞培养板孔的整个底部，从而与接种的细胞完全接触，有助于细胞黏附。然而，如果生物材料支架未能完全覆盖孔板底部，则有很大可能大部分接种的细胞无法持续与支架保持接触，最终无法实现黏附。本研究探讨了多种将细胞接种到未覆盖孔板底部的支架上的不同方法，旨在确定一种可推荐用于未来基于细胞实验的优化技术。

研究了五种不同的实验装置（图1）：使用细胞培养插件将支架（电纺纱线）固定在低吸附孔板中，并分别在静态条件下培养或以30 rpm振荡；将支架置于窄聚四氟乙烯（PTFE）槽中，保持静态或以30 rpm振荡；以及将支架置于以9 rpm旋转的生物反应器容器中。通过DNA检测法测定黏附于电纺纱线上的细胞数量，结果显示所有接种装置的细胞黏附率均较低（图2）；扫描电子显微镜（SEM）图像（图3）进一步证实了这一结果。其中，固定于细胞培养插件中并持续运动的纱线表现出最高的细胞黏附率——达30%或约18,060个细胞。有趣的是，固定于细胞培养插件中但保持静态条件的纱线细胞黏附率最低（15%），这表明引入径向运动对维持细胞与支架的接触具有积极作用。然而，应注意的是，培养基流体的持续循环可能导致SEM图像中观察到的细胞聚集体。摇床设定在其最低转速——30 rpm，这可能是该装置的一个局限性。采用更慢的径向运动可能有助于防止或减少细胞聚集，同时可改善细胞黏附，因为细胞所受的剪切力更小。后续实验应聚焦于优化摇床转速，以提高细胞黏附效率。对于置于槽中的纱线，引入运动并未产生类似趋势，两种条件下细胞黏附率均为18%（约10,836个细胞）；这可能是因为支架在槽中部分漂浮（在置于摇床的槽中已观察到），且未固定于底部。支架的部分漂浮会阻止沉降至槽底的细胞与材料接触并黏附。在该特定装置中，槽被置于培养皿内，并总共加入10 ml培养基。由于槽尺寸较小，大部分培养基位于培养皿中，一旦发生流动，细胞可能从槽中漂移至培养皿，从而完全脱离支架的接触范围。为克服这些局限性，后续实验应在方案中增加一步操作：使用无菌细针将支架两端固定于槽底，以防止其漂浮和移动（特别是暴露于径向运动的支架），从而最终提高黏附于支架上的细胞数量。在旋转容器中的纱线上，有16%的细胞实现了黏附。尽管旋转培养是三维培养中成熟的技术，但在从容器主端口取出支架时出现了问题，可能导致部分松散黏附的细胞丢失。可完全打开的容器可消除此问题；此类容器可购买获得，但价格远高于本研究中使用的 disposable 容器。

本研究揭示了在标准细胞培养板孔中接种支架时存在的当前问题，即支架未覆盖孔底全部区域。尽管支架的表面积足以容纳所有细胞附着，但接种已知数量的细胞后，附着到支架上的细胞不足三分之一。这一现象可能对其他基于细胞的检测产生不利影响，尤其是在评估支架作为潜在医疗器械时的生物相容性以及细胞-材料或细胞-细胞行为与相互作用方面。本研究的其他局限性可能包括4小时时间点的选择——尽管该时间已足够确保细胞初始接种（已有研究表明细胞可在三十分钟内牢固附着于基质13,14,15），但仍有必要考察更晚的时间点；前提是细胞在更长时间内不发生增殖，否则将干扰初始细胞数量的准确性。此外，减少培养基体积（本实验中为10 ml）也可能增强细胞与支架之间的接触，从而最终提高细胞附着率。未来的研究还应考虑细胞活力问题，因为细胞接种过程本身可能导致细胞损伤和/或死亡16。细胞DNA检测无法区分活细胞与死细胞，因此采用活/死细胞染色等方法可更准确地反映细胞的存活水平。

本研究强调了尽管接种了已知数量的细胞，但实际附着于支架上的细胞数量问题。对于依赖起始细胞数量的研究而言，研究人员必须准确了解该数量中实际附着到目标基质上的细胞数目。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者谨此感谢医学研究理事会为本研究提供的资助——MRC-DPFS 资助编号 G1000788-98812。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
蒸馏水本单位供应n/a
乙醇Merck1117271000
磷酸盐缓冲液（PBS）Life Technologies70013016
人源间充质干细胞PromoCell GmbHC-12974
间充质干细胞培养基PromoCell GmbHC-28010B使用前预热至 37 °C
补充剂混合液PromoCell GmbHC-39810加入培养基中
抗生素/抗真菌素混合液Sigma-AldrichA5955加入培养基中
胰蛋白酶（0.05%）EDTA（0.02%）Sigma-Aldrich59417C使用前预热至 37 °C
细胞培养瓶（T75）Becton Dickinson Ltd353110
低吸附 6 孔板Costar Corning3471
6 孔 CellCrownsScaffdexC00003S
50 ml 深型培养皿Sterilin124
PTFE 槽本单位自制n/a
一次性 RCCS 培养容器（10 ml）SyntheconD-410
4 通道旋转细胞培养系统生物反应器SyntheconRCCS-4DQ
摇板仪StuartSSM1微型轨道摇床
血细胞计数板Digital BioDHC-F01一次性 C-Chip
离心管Deltalab352096, 42990115 ml 和 50 ml
离心机HettichRotafix 32 A
3 ml 注射器Shield Medicare Ltd3039820
移液管Sterilin40305, 47310, 401255、10 和 25 ml
Gilson 移液器SLSF144801, F144802, F123600, F123601, F123602P2 - P1000
移液器吸头SLSPIP7852, PIP7834, PIP7840
1.5 ml 微量离心管Eppendorf30125.15
曲拉通 X-100Sigma9002-93-1
PicoGreen 检测试剂盒InvitrogenP7589在避光条件下进行检测操作
黑色 96 孔板Greiner Bio One655086
荧光酶标仪BGM LabtechFLUOstar Optima
25% 戊二醛TAAB LaboratoriesG002用 PBS 稀释至 1.5% v/v 浓度
六甲基二硅氮烷（HMDS）Sigma999-97-3
铝制样品台（SEM）Agar ScientificG301
导电胶碳贴片（SEM）Agar ScientificG3347N
金溅射镀膜仪EdwardsS150B
扫描电子显微镜（SEM）Phenom WorldPhenom Pro

参考文献

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