脊髓损伤实验性挫伤模型中的神经干细胞移植

摘要

脊髓损伤是一种导致严重发病率和高死亡率的创伤性疾病。在本研究中，我们详细描述了一种小鼠脊髓损伤的挫伤模型，随后进行神经干细胞移植。

摘要

脊髓损伤是一种严重的临床病症，其特征是出现一系列复杂的神经功能障碍。脊髓损伤的动物模型既可用于研究机体对损伤的生物学反应，也可用于评估潜在的治疗方法。对经手术暴露的脊髓实施挫伤或压迫性损伤，是目前应用最广泛的病理模型。本报告中，采用Infinite Horizon（IH）撞击器设备进行实验性挫伤，该设备可通过设定特定的损伤参数，建立可重复的动物损伤模型。干细胞移植通常被认为是一种可能有效的治疗该致残性疾病的策略。已有大量研究评估了移植多种干细胞的效果。本文中，我们展示了一种改良的脊髓损伤方法，随后在CD1小鼠中经尾静脉注射细胞。简而言之，我们提供了以下操作步骤：i）使用活体示踪剂对细胞进行标记，ii）小鼠的术前护理，iii）实施挫伤性脊髓损伤，以及iv）静脉注射死后来源的神经前体细胞。该挫伤模型可用于评估再生医学策略中干细胞移植的有效性和安全性。

引言

脊髓损伤（SCI）是最常见的高能量创伤所致损伤，常见原因包括机动车事故、跌倒、运动伤害和暴力事件¹。在重度脊髓损伤中，损伤外力会破坏或损害神经组织，导致神经功能突然丧失。创伤性脊髓损伤常发生于10至40岁的青壮年人群，严重影响患者的心理和生理状况，并给社会带来巨大的经济负担²。急性期的治疗手段通常仅限于大剂量皮质类固醇、手术稳定和减压，以期减轻继发性损伤^3-4，但这些方法在脊髓损伤后运动功能恢复中的作用仍存在争议。除了急性期的组织丢失外，创伤本身以及继发性退变机制的激活还会导致髓鞘脱失和多种细胞类型的死亡^5-6。功能恢复的程度通常与损伤部位残留的白质范围密切相关⁷。

脊髓损伤（SCI）的动物模型既可用于研究组织对损伤的生物学反应，也可用于测试潜在的治疗方法。此外，一个有价值的人类病理学动物模型不仅需要再现该疾病的部分特征，还必须相较于直接的临床观察和实验具有优势。目前最广泛使用的脊髓损伤模型是通过对手术暴露的脊髓施加挫伤或压迫性损伤来建立的⁸。可控重物下落致挫伤损伤模型的建立是脊髓损伤研究史上的一个重要里程碑。俄亥俄州立大学脊髓研究中心致力于研发一种能够通过计算机精确控制撞击参数、从而对脊髓施加特定程度压迫的装置⁹。该装置最初设计用于大鼠，随后被改进以适用于小鼠¹⁰。此类方法的优势在于可以更深入地研究损伤的生物力学特性，并能更全面地定义损伤参数，从而获得可重复的实验模型，进而更精确地评估所测试治疗手段对功能恢复过程的影响。

许多研究已评估了多种干细胞在脊髓损伤（SCI）模型中的移植效果¹¹。我们近期从死亡数小时后的小鼠供体的脑室下区（Sub-Ventricular Zone, SVZ）分离出成体神经干细胞^12-13。该方法获得了一群被称为死后神经前体细胞（post mortem neural precursors, PM-NPCs）的神经干细胞，在用于治疗SCI的再生医学策略中显示出优势。本文将展示：i）使用活体示踪剂PKH26进行细胞标记的实验方案，ii）实施创伤性SCI的手术操作步骤，以及iii）标记细胞的静脉内（i.v.）给药方法。此外，本研究还证明，移植的细胞能够迁移至脊髓损伤部位，并主要分化为微管相关蛋白（microtubule associated protein, MAP）2阳性的细胞。同时，这种分化伴随着后肢功能稳定恢复的促进作用。

方案

注意：所有实验程序均经米兰大学评审委员会批准，并符合意大利实验动物使用指南，与1986年11月发布的欧洲共同体指令（86/609/EEC）一致。

1. 移植用细胞的制备

注意：本实验应使用体外培养第5至第9代的神经干细胞；在用于移植标记前，需检测细胞培养物的增殖与分化能力。通过免疫细胞化学法确定其分化程度¹²。

1. 将细胞重悬至浓度为 1 x 10⁶ 细胞/150 μl（移植 1 x 10⁶ 每只小鼠的细胞数）。至少准备 1.2 x 10⁶ 每只小鼠所需的细胞数量，因为注射器装液需要过量的细胞。
2. 用神经干细胞培养基洗涤细胞3次 ¹³ 在10 ml锥形离心管中。每次洗涤步骤中，通过离心沉淀细胞（500 × g，5 min，室温）。
3. 在最后一次离心前对细胞进行计数。
4. 离心细胞（500 × g，5 分钟），然后小心吸去上清液，注意不要吸走细胞，但残留上清液体积不超过 25 μl。
5. 通过向细胞沉淀中加入1 ml稀释液C，制备2倍浓度的细胞悬液，并用移液器轻轻吹打重悬。
6. 染色前立即配制2倍染料溶液（4 × 10^–6 将4 µl PKH26乙醇染料溶液加入1 ml稀释液C中，混匀，充分分散。
7. 迅速将1 ml的2x细胞悬液加入1 ml的2x染料溶液中，并立即用移液器混匀样品（最终细胞密度为1.2 × 10⁷ 细胞/毫升 和 2 × 10^–6 M PKH26)
8. 将细胞/染料悬浮液孵育1-5分钟。
9. 通过加入等体积（2 ml）含1% BSA的HBSS溶液终止染色，孵育1分钟。
10. 离心细胞（500 × g，10 分钟），小心移除上清液。
11. 将细胞沉淀重悬于10 ml HBSS中，离心（500 × g，5分钟）。
12. 用10 ml完全培养基再洗涤细胞沉淀2次，以确保去除未结合的染料。
13. 将细胞沉淀重悬于10 ml完全培养基中，用于评估细胞回收率、细胞活力和荧光强度。若需用于移植，则将细胞洗涤后重悬于无菌生理溶液中，浓度为3.3 x 10⁵ 细胞/50 μl

2. 手术准备

1. 清洁并灭菌手术器械。
2. 使用无菌剂擦拭手术区域以做好准备，并设置 IH 撞击器设备。
3. 准备麻醉设备：活性气体清除系统配 VetScav 滤器称重装置、持续气流诱导室、氧气发生器、小鼠低流量 O₂ 计。清洁手术过程中使用的诱导室和面罩。
4. 使用 2.5% (v/v) 异氟烷与氧气（1 L/min）对动物进行麻醉，在气体诱导开始后等待 5 分钟，以确保药物起效。检查胡须是否抽动，或捏足垫时是否有缓慢的后肢回缩反应。手术期间，将异氟烷浓度降低至 2.0% (v/v) 异氟烷与氧气（1 L/min）。

3. 小鼠手术与移植前的准备

1. 将雄性成年CD1小鼠（25–30 g）在标准条件下（22 ± 2 °C，65%湿度，人工光照时间为上午08:00至晚上08:00）饲养至少3天后再进行实验。
   注意：从手术准备到缝合的整个过程大约需要40分钟。
   1. 使用防水彩色墨水标记小鼠尾巴，以识别个体。
2. 使用电动剪毛器将小鼠背部从颈部约T2水平至腰部区域的毛发剪除。
3. 用碘溶液和乙醇（70%溶于无菌水中）对准备区域进行消毒。
4. 通过皮下注射（s.c.）给予动物200 μl庆大霉素（1 mg/ml溶于无菌生理盐水中）。
5. 在动物双眼涂抹眼用润滑剂以防止干燥，并皮下注射布托啡诺（0.03 mg/kg）以缓解疼痛。

4. 椎板切除术

1. 将小鼠置于载物片加热器上，以避免手术过程中出现低体温。将动物背侧朝上放置。
2. 在感兴趣区域（T7至T12）做一纵向切口。
3. 用标准镊子夹住皮肤和浅层脂肪垫（通常位于第5个^th 和 6^th 胸部背突
4. 将容器下方的步骤计为 T6，然后移至 T7。
5. 在小鼠腹侧下方放置一个小的支撑物以增加脊柱的弯曲度。用格拉夫镊子固定脊髓以使其 immobilize。
6. 使用手术刀从T7至T10椎体水平双侧切开椎旁肌，直至刀尖接触椎板背面。
7. 使用手术刀从T7至T10处划开交界部位，在T8与T9棘突之间的间隙处停止。用显微剪刀剪开T8-T9和T9-T10之间的组织。
   1. 使用咬骨钳切除T9突起。用显微剪刀小心刮除肌肉层，暴露连接部位。持续操作直至骨组织暴露。
8. 使用镊子去除椎板上的肌肉，并在椎骨之间打开一个小空间。将显微剪刀轻轻插入骨下，剪断两侧椎板，然后用镊子移除该部分。
9. 用镊子移除椎板以暴露脊髓。务必确保不留任何游离或参差不齐的骨碎片；如有残留，使用咬骨钳将其清除。
10. 使用小头镊子去除骨膜以及靠近切口处的任何骨碎片或肌肉。
11. 切除T9背侧突起的上半部分，然后按照IH撞击器设备的操作流程进行。

5. IH撞击器设备操作方案（挫伤）

1. 将小鼠放置在 IH 撞击器装置的稳定平台中央。
2. 使用连接在稳定平台上的双齿镊，通过两个关节定位臂固定动物（左臂用于胸椎，右臂用于颈椎）。
3. 使用前端臂夹住前端椎体（T8）的侧缘。
4. 以相同方式操作后端臂，夹住 T10 椎体。
5. 将稳定平台放入装置中，并将探头（直径 0.75 mm）尽可能靠近脊髓，但不要接触。
6. 在启动撞击前，将探头向上提升整整三圈。
7. 设置撞击器以 60 kdyn 的力和 100 mm/sec 的速度进行撞击，完成挫伤操作。

6. 缝合与术后护理

1. 使用4/0可吸收缝合线缝合切口。覆盖椎板切除部位暴露的脊髓；利用细针缝合切口两端的组织，在脊髓暴露区域的上方和下方立即各缝一针。
2. 使用两到三个Reflex夹闭合皮肤，注意不要夹住下方的肌肉组织。
3. 术后通过皮下注射2 ml生理盐水，为小鼠补充水分，注射部位为下背部。
4. 将小鼠放回预先加热的笼子中，以防止手术恢复期间发生低体温。将笼子置于加热垫上。
5. 在损伤后的急性期密切监测小鼠，每天两次检查膀胱大小、缝合部位及动物体重。 轻轻挤压膀胱（每天两次，持续7天），以预防尿路感染（尿液可能浑浊、带血或含有沉淀物）。
6. 术后每天给予小鼠生理盐水注射（术后前两天，每天2 ml，皮下注射）和抗生素（庆大霉素0.2 ml，皮下注射），持续5天。
7. 术后镇痛处理使用丁丙诺啡（0.1 mg/kg，每天两次），持续3天。

7. 细胞尾静脉注射

注意：以下步骤演示了将细胞注射到尾静脉的操作过程。细胞也可通过使用立体定位仪进行脊髓内移植^15-16，或注入小脑延髓池¹⁷。需要注意的是，该方法还可用于移植其他类型的细胞，例如间充质基质细胞（例如，骨髓间充质干细胞、脂肪来源干细胞、羊水细胞）。此外，在脊髓损伤后，也可通过尾静脉注射纳米颗粒等其他治疗剂。

1. 使用 70% 乙醇和 PBS 在使用前清洁针头。仅用无菌手套操作针头和注射器。
2. 将试管中的细胞重悬，并将 75 μl 细胞悬液装入 0.3 ml 注射器（29 G 针头和 0.33 cc 注射器）中。
3. 确保细胞悬液中无气泡存在。将注射器保持水平位置，以避免细胞沉降。
4. 将小鼠置于加热灯下，以扩张尾部静脉。
5. 抓住小鼠，轻轻将其拉入固定器中，使侧尾静脉呈现为一条细的蓝色线条。
6. 用酒精棉片清洁尾部。一旦观察到静脉，用左手的拇指和中指夹住尾静脉。
7. 将针头以与水平面成 15° 角的方向接近皮肤表面，并确保斜面朝上。
8. 以 0.33 μl/sec 的速度注射 50 μl 细胞悬液。注射完成后，延迟 10 秒再撤出针头。缓慢撤出针头，并注意是否有细胞悬液外流。
9. 在每次加样之间，按照步骤 7.1 清洁注射器。

8. 行为学测试与后肢功能

1. 将小鼠放入开放场地中。
2. 根据Basso小鼠评分法（Basso mouse scale, BMS）¹⁸，利用开放场实验评估挫伤后的运动功能及后肢恢复情况。
   注意：神经功能需从损伤后第3天起定期评估，持续4周¹⁸。

9. 灌注

1. 实验周期结束后，通过腹腔注射戊巴比妥钠（65 mg/kg）麻醉动物。使用脚趾夹捏法评估麻醉深度，待小鼠对有害刺激无反应后方可继续操作。
2. 将动物仰卧位固定于手术板上。
3. 在肋骨下方切开皮肤和腹壁，分离膈肌与肝脏。
4. 用剪刀剪开膈肌以暴露胸膜腔。
5. 沿肋骨两侧剪开至锁骨处。
6. 用止血钳夹住剑突软骨，并将止血钳置于动物头部上方。
7. 用镊子夹住心脏底部三分之一处，横向固定心脏，将针头插入左心室。
8. 用止血钳夹住心脏，以固定针头并防止液体泄漏。
9. 用剪刀剪开右心房。
10. 使 PBS 以 18 ml/min 的流速泵入动物体内。在整个缓冲液灌注期间（3–4 分钟，约 70 ml PBS）保持此压力。持续灌注至心脏组织完全洗净为止。
11. 转动三通阀，使固定液（4% 甲醛溶于蒸馏水，4%PFA）经泵流入动物体内。让 4%PFA 灌注约 8–10 分钟（300 ml），逐步增加压力至最高 30 ml/min。肝脏变硬是灌注成功的最佳标志。

10. 组织采集与处理、组织学与免疫组织化学

1. 从 T5 至 L1 节段解剖分离脊髓组织，随后将组织置于 6 ml 4% 多聚甲醛（PFA）中，4 °C 过夜固定。
2. 将相同组织置于含 30% 蔗糖的溶液中，4 °C 条件下孵育 72 小时，以进行冷冻保护，防止冷冻过程中冰晶形成。
3. 使用干冰快速冷冻脊髓组织，并于 -80 °C 保存。
4. 使用冷冻切片机将组织切成 15 µm 厚的切片，直接收集至载玻片上，用于后续免疫细胞化学实验。
5. 每张载玻片用 200 μl PBS 冲洗（每次 5 分钟，共 3 次，室温）。
6. 每张载玻片加入 200 μl 含 10% 正常山羊血清（NGS）和 0.2% Triton X-100 的 PBS 溶液，室温孵育 1 小时，以透化细胞。
7. 每张载玻片用 200 μl PBS 冲洗（每次 5 分钟，共 3 次，室温）。
8. 每张载玻片加入 200 μl 封闭液（含 5% NGS 和 0.1% Triton X-100 的 PBS）封闭非特异性结合位点，室温孵育 30 分钟。
9. 每张载玻片加入 200 μl 一抗溶液（用含 5% NGS 和 0.1% Triton X-100 的 PBS 稀释抗体），4 °C 过夜孵育。
10. 每张载玻片用 200 μl PBS 洗涤（每次 5 分钟，共 3 次 ，室温）。
11. 加入合适的二抗，室温孵育 2 小时。
12. 每张载玻片用 200 μl PBS 洗涤（每次 5 分钟，共 3 次 ，室温）。
13. 每张载玻片加入 200 μl 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液（终浓度 1 µg/ml），室温孵育 10 分钟，对细胞核进行染色。
14. 使用 FluorSave 封片试剂封片，并通过共聚焦显微镜进行观察分析。
    注意：在对照实验中，应省略一抗，替换为同亚型无关 IgG 的等浓度溶液。本实验使用了微管相关蛋白 2（Microtubule-Associated Protein 2）一抗。

结果

移植细胞的总数为 1 × 10⁶ 个细胞，分三次连续通过尾静脉注射给予。每次注射 3.3 × 10⁵ 个细胞，溶于 50 µl 磷酸盐缓冲液（PBS）中。第一次注射在损伤后 30 分钟内进行，第二次在 6 小时后，最后一次在损伤后 18 小时。选择脊髓损伤后 18 小时作为给予 PM-NPCs 的时间上限，是基于此时血脑屏障通透性最佳 ¹⁴。为了评估干细胞注射的效果，建议设置阳性对照组（行椎板切除术但不注射 PBS 的动物，n = 14）和阴性对照组（注射 PBS 的动物，n = 14）。

PM-NPCs 改善后肢功能恢复，迁移至损伤部位并分化为 MAP-2 阳性细胞

T9 挫伤导致小鼠后肢功能短暂丧失，随后逐渐恢复（图1）。在2-3周内，经PBS处理的损伤小鼠后肢功能有所改善，BMS评分达到3分（对应足底放置，可伴有或不伴有体重支撑，或偶尔、频繁或持续的背侧踏步，但无足底踏步¹⁸

讨论

本文介绍了一种使用 Infinite Horizon 冲击器在 70 kdyne（重度）力作用下，获得可重复的创伤性脊髓损伤模型的方法。若采用更大的力模式（80 kdyne），虽然可造成更严重的损伤，但不幸的是会伴随较高的小鼠死亡率。为避免这一问题，我们通常选择中等力度（70 kdyne），该力度可产生可重复的病灶，功能呈渐进性恢复，且死亡率较低。为实现这种稳定的损伤，必须特别注意将动物正确固定在冲击器平台上；具体而言，脊髓必须位于冲击器探针的正中央，且冲击器的两个臂必须相互平行。此外，在使用冲击器镊子夹紧动物时也需格外小心，以免椎骨被压碎，或镊子尖端损伤脊髓。椎板切除术后动物的体位摆放至关重要，此过程中的动物操作也非常关键。对椎板切除术本身也必须给予特别关注，该操作应始终在相同部位进行，并保持相同的切除范围。在实施椎板切除术过程中，另一需要关注的方法学问题是：使用显微剪刀、咬骨钳或镊子切割骨骼、暴露脊髓、清除残留的侧方骨突和骨碎片以及剥离骨膜时，应尽量降低损伤脊髓的风险。使用尖端朝上的显微剪刀和咬骨钳可降低出现上述问题的风险。

该方法的一个重要局限性是动物在损伤后极易发...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PKH26GL-1KT	Sigma	091M0973
无限视野（IH）撞击装置	Precision Systems and Instrumentation, LLC	型号 0400，序列号 0171
庆大霉素 10 mg/ml	Euroclone	ECM0011B	1 mg/ml，无菌生理盐水溶液中
异氟烷-Vet 250 ml	Merial	B142J12A
Blefarolin POM OFT 10 g
载玻片加热板	2 生物仪器	HB101-sm-402
手术刀，10号	Lance Paragon	26920
小型格雷夫镊	2 生物仪器	11023-14
压痕测试	Medicon Instruments	07 60 07
微型剪刀	2 生物仪器	15000-00
可吸收缝合线（4/0）	Safil Quick	C0046203
止血钳	2 生物仪器	13014-14
Reflex 7 伤口缝合钉施加器	2 生物仪器	12031-07
7 mm 反射性伤口夹	2 生物仪器	12032-07
NGS	Euroclone	ECS0200D
Triton X-100	默克密理博	1086431000
抗微管相关蛋白  （微管相关蛋白）2	默克密理博	AB5622
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008
FluorSave 试剂	Calbiochem	345789
神经干细胞培养基			DMEM-F12 培养基（Euroclone），含 2 mm L-谷氨酰胺（Euroclone）、0.6% 葡萄糖（Sigma-Aldrich）、9.6 gm/ml 腐胺（Sigma-Aldrich）、6.3 ng/ml 孕酮（Sigma-Aldrich）、5.2 ng/ml 硒酸钠（Sigma-Aldrich）、0.025 mg/ml 胰岛素（Sigma-Aldrich）、0.1 mg/ml 转铁蛋白（Sigma-Aldrich）和 2 μg/ml 肝素（钠盐，II 型；Sigma-Aldrich），bFGF（人重组，10 ng/ml；Life Technologies）和 EGF（人重组，20 ng/ml；Life Technologies）
DMEM-F12	Euroclone	ASM5002
L-谷氨酰胺	Euroclone	ECB3000D
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270-100G
腐胺	Sigma-Aldrich	P5780-25G
孕酮	Sigma-Aldrich	P6149-1MG
亚硒酸钠	Sigma-Aldrich	S9133-1MG
转铁蛋白	Sigma-Aldrich	T 5391
胰岛素	Sigma-Aldrich	I1882
肝素钠盐	Sigma-Aldrich	H0200000
bFGF	Life Technology	PHG0024
h-EGF	Life Technology	PHG6045
注射器 0.33 cc 29 G	Terumo	MYJECTOR
布托啡诺	Schering Plough SpA	TEMGESIC
眼用凝胶	Bausch && 罗姆	LIPOSIC