脊髓损伤实验性挫伤模型中的神经干细胞移植

摘要

脊髓损伤是一种导致严重发病率和高死亡率的创伤性疾病。在本研究中，我们详细描述了一种小鼠脊髓损伤的挫伤模型，随后进行神经干细胞移植。

摘要

脊髓损伤是一种严重的临床病症，其特征是出现一系列复杂的神经功能障碍。脊髓损伤的动物模型既可用于研究机体对损伤的生物学反应，也可用于评估潜在的治疗方法。对经手术暴露的脊髓实施挫伤或压迫性损伤，是目前应用最广泛的病理模型。本报告中，采用Infinite Horizon（IH）撞击器设备进行实验性挫伤，该设备可通过设定特定的损伤参数，建立可重复的动物损伤模型。干细胞移植通常被认为是一种可能有效的治疗该致残性疾病的策略。已有大量研究评估了移植多种干细胞的效果。本文中，我们展示了一种改良的脊髓损伤方法，随后在CD1小鼠中经尾静脉注射细胞。简而言之，我们提供了以下操作步骤：i）使用活体示踪剂对细胞进行标记，ii）小鼠的术前护理，iii）实施挫伤性脊髓损伤，以及iv）静脉注射死后来源的神经前体细胞。该挫伤模型可用于评估再生医学策略中干细胞移植的有效性和安全性。

引言

脊髓损伤（SCI）是最常见的高能量创伤所致损伤，常见原因包括机动车事故、跌倒、运动伤害和暴力事件¹。在重度脊髓损伤中，损伤外力会破坏或损害神经组织，导致神经功能突然丧失。创伤性脊髓损伤常发生于10至40岁的青壮年人群，严重影响患者的心理和生理状况，并给社会带来巨大的经济负担²。急性期的治疗手段通常仅限于大剂量皮质类固醇、手术稳定和减压，以期减轻继发性损伤^3-4，但这些方法在脊髓损伤后运动功能恢复中的作用仍存在争议。除了急性期的组织丢失外，创伤本身以及继发性退变机制的激活还会导致髓鞘脱失和多种细胞类型的死亡^5-6。功能恢复的程度通常与损伤部位残留的白质范围密切相关⁷。

脊髓损伤（SCI）的动物模型既可用于研究组织对损伤的生物学反应，也可用于测试潜在的治疗方法。此外，一个有价值的人类病理学动物模型不仅需要再现该疾病的部分特征，还必须相较于直接的临床观察和实验具有优势。目前最广泛使用的脊髓损伤模型是通过对手术暴露的脊髓施加挫伤或压迫性损伤来建立的⁸。可控重物下落致挫伤损伤模型的建立是脊髓损伤研究史上的一个重要里程碑。俄亥俄州立大学脊髓研究中心致力于研发一种能够通过计算机精确控制撞击参数、从而对脊髓施加特定程度压迫的装置⁹。该装置最初设计用于大鼠，随后被改进以适用于小鼠¹⁰。此类方法的优势在于可以更深入地研究损....

方案

注意：所有实验程序均经米兰大学评审委员会批准，并符合意大利实验动物使用指南，与1986年11月发布的欧洲共同体指令（86/609/EEC）一致。

1. 移植用细胞的制备

注意：本实验应使用体外培养第5至第9代的神经干细胞；在用于移植标记前，需检测细胞培养物的增殖与分化能力。通过免疫细胞化学法确定其分化程度¹²。

1. 将细胞重悬至浓度为 1 x 10⁶ 细胞/150 μl（移植 1 x 10⁶ 每只小鼠的细胞数）。至少准备 1.2 x 10⁶ 每只小鼠所需的细胞数量，因为注射器装液需要过量的细胞。
2. 用神经干细胞培养基洗涤细胞3次 ¹³ 在10 ml锥形离心管中。每次洗涤步骤中，通过离心沉淀细胞（500 × g，5 min，室温）。
3. 在最后一次离心前对细胞进行计数。
4. 离心细胞（500 × g，5 分钟），然后小心吸去上清液，注意不要吸走细胞，但残留上清液体积不超过 25 μl。
5. 通过向细胞沉淀中加入1 ml稀释液C，制备2倍浓度的细胞悬液，并用移液器轻轻吹打重悬。
6. 染色前立即配制2倍染料溶液（4 × 10^–6 将4 µl PKH26乙醇染料溶液加入1 ml....

结果

移植细胞的总数为 1 × 10⁶ 个细胞，分三次连续注射至尾静脉。每次注射 3.3 × 10⁵ 个细胞，溶于 50 µl 磷酸盐缓冲液（PBS）中。第一次注射在损伤后 30 分钟内进行，第二次在 6 小时后，最后一次在损伤后 18 小时。选择脊髓损伤后 18 小时作为注射 PM-NPCs 的时间上限，是基于此时血脑屏障通透性最佳 ¹⁴。为了评估干细胞注射的效果，建议设置阳性对照组（行椎板切除术但不注射 PBS 的动物，n = 14）和阴性对照组（注射 PBS 的动物，n = 14）。

PM-NPCs 改善后肢功能恢复，迁移至损伤部位并分化为 MAP-2 阳性细胞

T9挫伤导致小鼠后肢功能短暂丧失，随后逐渐恢复（图1）。在2-3周内，经PBS处理的损伤小鼠后肢功能改善至BMS评分3分（对应足底放置，可伴有或不伴有体重支撑，或偶尔、频繁或持续的背侧踏步，但无足底踏步¹⁸）。而在.......

讨论

本文介绍了一种使用 Infinite Horizon 冲击器在 70 kdyne（重度）力作用下，获得可重复的创伤性脊髓损伤模型的方法。若采用更大的力模式（80 kdyne），虽然可造成更严重的损伤，但不幸的是会伴随较高的小鼠死亡率。为避免这一问题，我们通常选择中等力度（70 kdyne），该力度可产生可重复的病灶，功能呈渐进性恢复，且死亡率较低。为实现这种稳定的损伤，必须特别注意将动物正确固定在冲击器平台上；具体而言，脊髓必须位于冲击器探针的正中央，且冲击器的两个臂必须相互平行。此外，在使用冲击器镊子夹紧动物时也需格外小心，以免椎骨被压碎，或镊子尖端损伤脊髓。椎板切除术后动物的体位摆放至关重要，此过程中的动物操作也非常关键。对椎板切除术本身也必须给予特别关注，该操作应始终在相同部位进行，并保持相同的切除范围。在实施椎板切除术过程中，另一需要关注的方法学问题是：使用显微剪刀、咬骨钳或镊子切割骨骼、暴露脊髓、清除残留的侧方骨突和骨碎片以及剥离骨膜时，应尽量降低损伤脊髓的风险。使用尖端朝上的显微剪刀和咬骨钳可降低出现上述问题的风险。

该方法的一个重要局限性是动物在损伤后极易发.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PKH26GL-1KT	Sigma	091M0973
无限视野（IH）撞击装置	Precision Systems and Instrumentation, LLC	型号 0400，序列号 0171
庆大霉素 10 mg/ml	Euroclone	ECM0011B	1 mg/ml，无菌生理盐水溶液中
异氟烷-Vet 250 ml	Merial	B142J12A
Blefarolin POM OFT 10 g
载玻片加热板	2 生物仪器	HB101-sm-402
手术刀，10号	Lance Paragon	26920
小型格雷夫镊	2 生物仪器	11023-14
压痕测试	Medicon Instruments	07 60 07
微型剪刀	2 生物仪器	15000-00
可吸收缝合线（4/0）	Safil Quick	C0046203
止血钳	2 生物仪器	13014-14
Reflex 7 伤口缝合钉施加器	2 生物仪器	12031-07
7 mm 反射性伤口夹	2 生物仪器	12032-07
NGS	Euroclone	ECS0200D
Triton X-100	默克密理博	1086431000
抗微管相关蛋白  （微管相关蛋白）2	默克密理博	AB5622
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008
FluorSave 试剂	Calbiochem	345789
神经干细胞培养基			DMEM-F12 培养基（Euroclone），含 2 mm L-谷氨酰胺（Euroclone）、0.6% 葡萄糖（Sigma-Aldrich）、9.6 gm/ml 腐胺（Sigma-Aldrich）、6.3 ng/ml 孕酮（Sigma-Aldrich）、5.2 ng/ml 硒酸钠（Sigma-Aldrich）、0.025 mg/ml 胰岛素（Sigma-Aldrich）、0.1 mg/ml 转铁蛋白（Sigma-Aldrich）和 2 μg/ml 肝素（钠盐，II 型；Sigma-Aldrich），bFGF（人重组，10 ng/ml；Life Technologies）和 EGF（人重组，20 ng/ml；Life Technologies）
DMEM-F12	Euroclone	ASM5002
L-谷氨酰胺	Euroclone	ECB3000D
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270-100G
腐胺	Sigma-Aldrich	P5780-25G
孕酮	Sigma-Aldrich	P6149-1MG
亚硒酸钠	Sigma-Aldrich	S9133-1MG
转铁蛋白	Sigma-Aldrich	T 5391
胰岛素	Sigma-Aldrich	I1882
肝素钠盐	Sigma-Aldrich	H0200000
bFGF	Life Technology	PHG0024
h-EGF	Life Technology	PHG6045
注射器 0.33 cc 29 G	Terumo	MYJECTOR
布托啡诺	Schering Plough SpA	TEMGESIC
眼用凝胶	Bausch && 罗姆	LIPOSIC