使用停流荧光法与标记核苷酸分析驱动蛋白的ATP转换循环

摘要

驱动蛋白的特征是其与微管的相互作用依赖于核苷酸：ATP 转换循环与微管结合循环相偶联。本文中，我们描述了利用荧光标记的核苷酸和停流荧光技术，分析驱动蛋白 ATP 转换循环中各个核苷酸转换步骤动力学的实验方案。

摘要

驱动蛋白超家族是一类与微管相关的运动蛋白，它们均具有一个特征性的马达结构域，该结构域既能水解ATP，又能结合微管。在驱动蛋白超家族中，不同成员在ATP周转速率以及与微管相互作用的方式上存在差异。这些差异使特定的驱动蛋白适应于多种功能，例如货物运输、微管滑动、微管去聚合以及微管稳定。要理解驱动蛋白的作用机制，关键在于阐明ATP周转的化学循环如何与微管相互作用的机械循环相偶联。为了剖析ATP周转循环，一种方法是利用荧光标记的核苷酸来可视化循环中的各个步骤。确定ATP周转循环中每一步核苷酸转换的动力学参数，有助于识别整个循环中的限速步骤。对于驱动蛋白而言，了解其在无微管存在情况下的限速步骤尤为重要，因为当驱动蛋白与微管相互作用时，该步骤通常会被加速数千倍。通过将无微管条件下的循环过程与有微管条件下的过程进行比较，才能全面理解驱动蛋白的ATP周转循环。然而，各个核苷酸转换步骤的动力学过程通常极为迅速，尤其在存在微管的情况下，手动混合反应物难以观测。此时可采用快速混合装置（例如停流式荧光分光光度计），该设备能够以毫秒级的时间尺度观测动力学变化，从而监测此类快速转换过程。本文中，我们描述了结合使用停流式快速混合技术和荧光标记核苷酸来解析驱动蛋白ATP周转循环的实验方案。

引言

驱动蛋白是一类蛋白质超家族，其特征是具有一个高度保守的马达结构域¹。驱动蛋白的马达结构域以依赖核苷酸的方式与微管相互作用。驱动蛋白家族成员具有多种功能，包括沿微管定向运输 cargo 的移位型驱动蛋白，以及调节微管动态的非移位型微管末端结合驱动蛋白^2,3。

驱动蛋白利用腺苷-5’-三磷酸（ATP）的转化来调控其与微管细胞骨架的相互作用^4-6。驱动蛋白马达结构域的构象及其对微管的亲和力取决于其结合的核苷酸状态：可结合ATP、ADP、ADP·Pi或不结合任何核苷酸（图1）。要理解驱动蛋白的分子机制，必须阐明ATP转化与微管相互作用之间的关系。因此，驱动蛋白研究领域的一个主要目标是表征不同核苷酸状态的功能特性，以及在有或无微管存在条件下各状态之间转换的动力学过程。

图1. 驱动蛋白最简单的ATP转换循环包含四种可能状态：无核苷酸状态（Φ）、ATP结合状态、ADP·P_i结合态和ADP结合态。 每个四种转变均由一个正向和一个逆向速率常数表征（k_x 和 k_-x 分别）。

为了理解ATP周转的化学循环如何与微管相互作用的机械循环相偶联，必须首先确定在无微管存在时ATP周转循环中哪一步是限速步骤，然后确定微管的存在如何改变该循环。最简单的ATP周转循环包含四个独立的化学步骤：（1）ATP结合到空位点（Φ表示空位点， 即， 无核苷酸结合的驱动蛋白；(2) ATP 水解；(3) 磷酸根解离；(4) ADP 解离图1。限速步骤决定了整个ATP turnover循环的速率常数。因此，要确定哪个步骤为限速步骤，必须测量并比较各个单独的反应步骤与整个循环的速率常数。本文未描述测定整体ATP turnover循环速率常数的方法，相关内容可参见文献7。本文介绍的是如何测定各个独立化学步骤的速率常数。目前已有多种方法可用于研究核苷酸水解蛋白在turnover循环中各个独立的反应步骤。本文所描述的方法利用了以荧光染料甲基蒽氨酸（methylanthraniloyl，通常简称为mant）标记的核苷酸的特性，这类核苷酸在与蛋白质结合时会表现出荧光强度的变化。⁸. 由于甲硫氨酰基（mant）基团体积较小，因此被采用，当其与核糖相连时图2A），通常对核苷酸结合或水解的动力学几乎没有或完全没有影响^9-12在此，我们介绍使用荧光标记的 mant 核苷酸结合停流荧光技术的实验方案，以观察驱动蛋白 ATP 转运循环中核苷酸的结合与解离过程。

方案

1. 测定Mant标记核苷酸结合后荧光强度的变化。

1. 在适当的反应缓冲液中加入1 μM的mant标记核苷酸和1 μM的驱动蛋白（终浓度）。通常使用有利于微管生长和稳定的缓冲液（见讨论部分）。常用的缓冲液包含80 mM哌嗪-双(2-乙磺酸)（PIPES）pH 6.9、1 mM MgCl₂和1 mM乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸（EGTA）。
   注意：所有方案中所述的驱动蛋白浓度均指核苷酸结合位点（即，马达结构域）的浓度。不同的驱动蛋白可表现为单体、二聚体或四聚体，因此每分子可能含有一个以上的核苷酸结合位点。
2. 孵育一段时间（1–3 分钟）后，使用标准荧光分光光度计测量mant标记核苷酸-驱动蛋白复合物的发射光谱。激发波长设为365 nm，以1 nm为增量，测量400–500 nm范围内的发射光。
3. 在与步骤1.1中相同的反应缓冲液中配制1 mM的mant标记核苷酸溶液。
4. 按照前述方法（见步骤1.2），测量仅含mant核苷酸样品的发射光谱。
5. 通过除以溶液中mant核苷酸光谱在最大荧光强度波长处的信号值，对光谱进行归一化处理（即，不含驱动蛋白的条件下）。
6. 绘制归一化后的光谱（例如，图2B），以观察mantATP结合态和/或mantADP结合态驱动蛋白与溶液中mant核苷酸之间的荧光强度差异。

2. mantATP 结合与解离速率常数的测定

1. 将浓度最高为 20 μM 的驱动蛋白（见讨论部分）溶液与任何合适的 Mg²⁺无缓冲液例如， 80 mM PIPES（pH 6.9），1 mM EGTA，0.1% Tween 20，加入1 mM（终浓度）乙二胺四乙酸（EDTA）和1 mM（终浓度）二硫苏糖醇（DTT）。   注意：建议在缓冲液中添加Tween20，以减少或防止在缓冲液置换所用柱子（步骤2.3和3.3）中驱动蛋白的损失
2. 在25 °C下孵育溶液15分钟。
3. 使用重力流 G-25 Sephadex 凝胶过滤柱，按照制造商说明书将游离核苷酸和 EDTA 与驱动蛋白分离（参见材料列表）。
   1. 用至少3个柱体积的适当Mg缓冲液平衡色谱柱²⁺无缓冲液（参见步骤 2.1）。将含有驱动蛋白的溶液上样至柱中。 在空收集管中加入适量100 mM氯化镁溶液，使收集驱动蛋白溶液后，氯化镁的终浓度为1 mM。  立即加入氯化镁有助于稳定无核苷酸的驱动蛋白。
   2. 使用洗脱液洗脱驱动蛋白 适量的 Mg²⁺无核苷酸缓冲液。驱动蛋白在无核苷酸状态下不稳定，因此操作需迅速。将无核苷酸的驱动蛋白置于冰上保存，并在1-2小时内使用。
4. 在制备无核苷酸的驱动蛋白期间或之前，使用与无核苷酸驱动蛋白终溶液相同的反应缓冲液配制mantATP浓度梯度。根据可获得的驱动蛋白浓度确定所需mantATP的浓度范围，通常浓度梯度为0.1至50 μM（参见步骤2.5及讨论部分）。
5. 制备一系列无核苷酸的驱动蛋白浓度。针对每个 mantATP 浓度（步骤 2.4），应配制相应浓度的无核苷酸驱动蛋白，使 mant 标记的核苷酸相对于驱动蛋白的核苷酸结合位点过量 5 至 10 倍（摩尔比）。
6. 将停流荧光仪的激发波长设置为 365 nm，并收集发射光 >400 nm，使用长通滤光片。
7. 从最低浓度的mantATP开始，将mantATP与适当浓度的无核苷酸kinesin按1:1比例混合 v/v 使用停流荧光光度计测定比率（图3A 和 3B 插图）。注意：混合后反应物被稀释50%。请记录混合前和混合后的核苷酸浓度（即， 3.0/1.5 μM）以避免混淆。
8. 将每个 mantATP 浓度下测得的荧光强度变化拟合为指数函数与一条具有恒定负斜率的直线，以校正 mant 基团的光漂白效应（即， 荧光 = A₀指数函数（exp）k_观察.t)+(m.t+c)，其中 A₀ 是振幅， k_观察 是速率常数，t 是时间，参见 图3B 以及讨论）。根据这些拟合结果确定一个速率常数（k_观察) 在每种 mantATP 浓度下 k_观察 是结合与解离速率常数的卷积图1, k₁ 和 k_-1).
9. 通过作图解析缔合与解离速率常数 k_观察 对 mantATP 浓度作图例如，图3C）。将这些数据拟合为线性函数（即，k_观察 = k₁[mantATP] + k_-1) 以获得斜率和 y 轴截距。斜率代表 mantATP 结合的速率常数（图1, k₁）及其单位 M^-1s^-1. 截距代表解离速率常数（图1, k_-1) 单位为 s^-1 （参见讨论）。注意：该方法也可用于测定ADP结合与解离速率常数（图1, k_-4 和 k₄使用 mantADP 作为核苷酸。

3. mantADP 解离速率常数的测定

1. 向含有2 μM 驱动蛋白的适宜反应缓冲液中例如， 80 mM PIPES pH 6.9, 1 mM MgCl₂₂，1 mM EGTA，0.1% Tween20），加入50 μM mantADP（终浓度）。
2. 25℃孵育 ^o30 分钟，C
3. 使用 G-25 Sephadex 柱（参见材料列表），按照制造商说明通过缓冲液置换将驱动蛋白置换至选定的反应缓冲液中，以去除多余的 mantADP 及其他游离核苷酸。此时，驱动蛋白马达结构域应已结合 mantADP。
4. 将停流荧光仪的激发波长设置为 365 nm，并收集发射光 >400 nm，使用长通滤光片。
5. 将 mantADP·驱动蛋白复合物（约 1 μM）与 50 倍或更高摩尔过量的未标记 ATP 按 1:1 体积比混合 v/v 使用停流荧光仪测定比率（图 4A 和 4B 插图).
6. 将随时间观察到的荧光强度下降拟合为单指数函数与一条恒定负斜率直线的叠加，以校正mant基团的光漂白效应（即， 荧光 = A₀.exp(k_观察.t)+(m.t+c)，其中 A₀ 是振幅， k_观察 是速率常数，t 是时间，参见 图4B 以及讨论）。 k_观察 由此拟合确定的是ADP解离的速率常数（图1, k₄) 单位为 s^-1 （参见讨论部分）。

结果

当mant标记的核苷酸与驱动蛋白结合时，通常会观察到mant基团荧光强度的增加。然而，这种信号变化的幅度取决于具体的驱动蛋白类型。因此，在进行动力学测定之前，进行平衡测量以确认荧光强度变化的存在及其幅度是十分有益的。mantATP和mantADP在溶液中以及与驱动蛋白-13家族成员MCAK形成复合物时的代表性荧光光谱如图2B所示。这些数据突出了mantATP和mantADP在结合MCAK后均表现出荧光强度的增强。利用mant核苷酸结合驱动蛋白时荧光强度的变化，可监测ATP和ADP的结合与解离过程（见第2和第3节）。对于MCAK而言，mantATP·驱动蛋白复合物与mantADP·驱动蛋白复合物之间的荧光强度存在差异⁹。

图 3A 展示了将mantATP与无核苷酸的驱动蛋白混合后发生的反应。图中显示了mantATP与驱动蛋白-13家族成员MCAK结合后荧光强度增加的代表性数据。 图3B如图所示类型的数据 图3B 在一系列 mantATP 浓度下收集数据。作速率常数（k_观察) 与 mantATP 浓度的关系如图所示 图3C. 将这些数据拟合为线性函数（即，k_观察 = k₁[mantATP] + k_-1) 可实现对参与该过程的速率常数进行解卷积分析 k_观察 （步骤 2.8）。因此，可确定 mantATP 的结合速率常数和解离速率常数图1, k₁ 和 k_-1 分别）。

图4A 描述了将 mantADP·驱动蛋白与过量未标记 ATP 混合后发生的反应。 图4B 中的数据显示了 mantADP 从驱动蛋白-13（MCAK）解离时观察到的荧光强度下降。通过将该数据拟合至指数函数（步骤 3.6），可直接确定 mantADP 解离的速率常数。

图 2. 使用荧光染料甲基蒽酰胺（methylanthraniloyl, mant）标记的核苷酸来分离ATP转化循环中的各个独立步骤。（A） mantATP的结构，显示mant荧光基团连接在核糖的2’或3’位点。（B） 溶液中mantATP和mantADP（mAXP）以及与驱动蛋白MCAK结合状态下的mantATP和mantADP（mATP+MCAK和mADP+MCAK）的归一化荧光光谱。mantATP光谱以溶液中mantATP的最大荧光强度为基准进行归一化，mantADP光谱以溶液中mantADP的最大荧光强度（_max）为基准进行归一化。与MCAK混合后的mant核苷酸光谱在混合后1 min采集。试剂浓度和荧光仪设置同实验方案步骤1.1和1.2中所述。

图3. mantATP结合速率常数的测定。(A) 示意图显示了停流混合后发生的反应：mantATP（mATP）与无核苷酸的驱动蛋白结合。mant基团在与蛋白质结合后荧光强度增加。(B) 将mantATP（25 µM）与MCAK（5 µM，无核苷酸状态）混合后观察到的荧光信号变化（黑色）。该数据拟合为单指数函数加上一条恒定负斜率的直线（红色虚线），后者用于校正mant荧光团的光漂白（见讨论部分）。插图： 停流荧光仪混合前注射器中的内容物。(C) 将不同浓度的mantATP与无核苷酸MCAK反应所测得的表观速率常数（k_obs）对mantATP浓度作图。该图在低浓度区呈线性关系，其斜率即为结合速率常数（图1，k₁），单位为 M^-1 s^-1，y轴截距为解离速率常数（图1，k_-1），单位为 s^-1。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 4. mantADP 解离速率常数的测定。 (A) 停流法混合后发生的反应示意图：预先加载 mantADP 的驱动蛋白被稀释至过量的未标记 ATP 中。解离的 mantADP 被未标记的 ATP 取代，从而防止 mantADP 重新结合（见讨论部分）。mant 基团在从蛋白质上解离后荧光强度降低。(B) 观察到的 mantADP 从驱动蛋白 MCAK 解离时荧光信号的下降。荧光信号（黑色）拟合为单指数衰减曲线叠加一条恒定负斜率直线，以校正 mant 基团的光漂白效应（见讨论部分）。所测定的速率常数即为 mantADP 的解离速率常数（图 1，k₄）。插图：停流荧光仪混合前注射器中的内容物。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文介绍了观察和分析驱动蛋白（kinesin）核苷酸状态转变动力学的实验方案。这些方案结合了快速混合停流法（stopped-flow）与荧光标记核苷酸技术。此类方法已被广泛用于研究多种驱动蛋白的核苷酸结合与解离过程^9-11,13-16。本文所述方法无法直接观察磷酸根的释放（图1，步骤3）。然而，可通过使用磷酸感应蛋白将磷酸生成与荧光强度变化偶联，从而利用停流荧光法检测该转变过程¹⁷。本方案采用小分子荧光标记物甲基蒽啉酰基（methylanthraniloyl, mant）标记的核苷酸，该标记物在与蛋白质结合后通常表现出荧光强度增强。此外，当mant标记物连接于核糖的2’或3’位时，通常对核苷酸的结合、解离或水解过程影响极小甚至无影响^9-12。mant标记的核苷酸可从商业渠道便捷获取（参见材料清单），并以2’与3’异构体混合物形式提供，因为在纯化为单一异构体后会迅速重新达到平衡⁸。mant标记核苷酸是优良的报告分子，可用于观测核苷酸结合与解离的动力学过程。

使用荧光标记的核苷酸意味着所描述检测方法的读数是荧光强度的实时变化。这使得这些检测方法非常适合停流荧光技术，后者能够实现试剂的快速混合，并实时观察后续反应相关的荧光变化。将停流作为混合技术、荧光作为检测方法相结合，可构建一个相对节省样品的系统。例如，获取图3C所示数据需要0.8 - 1.0 mg纯化的驱动蛋白-13（kinesin-13）MCAK，而获取图4B所示数据则需要约0.3 mg纯化的驱动蛋白-13（kinesin-13）MCAK。使用mant作为荧光基团的一个缺点是其容易发生光漂白。可通过在停流仪中将mant标记的核苷酸溶液与反应缓冲液混合（不加入驱动蛋白），在脱离驱动蛋白反应动力学的情况下单独观察这一现象。随着mant基团被漂白，可观察到荧光强度缓慢下降。在本方案所用的时间尺度范围内，mant基团的光漂白过程可用线性函数很好地描述。因此，校正光漂白数据的一种简单方法是采用基线为线性函数（即，m·t + c）的指数函数进行拟合，而不是使用更常见的由单参数描述的平坦基线。

mantATP 结合

在测定mantATP结合与解离的速率常数时（第2节），由于在无微管存在的情况下，ADP仍与驱动蛋白的核苷酸结合位点保持结合，因此必须将其去除。这使得mantATP的结合与解离过程（图1，步骤1）能够独立于ADP的解离而被单独观察。为此，需将驱动蛋白与至少50倍于核苷酸结合位点摩尔数的EDTA共同孵育（步骤2.1）。EDTA会螯合Mg²⁺离子，导致Mg²⁺从核苷酸结合口袋中解离，从而促使核苷酸释放¹¹。因此，在执行步骤2.1 至 2.3时，至关重要的是使用无Mg²⁺的缓冲液。随后通过缓冲液置换将不含核苷酸的驱动蛋白蛋白分离，以去除游离核苷酸和EDTA。为实现这一分离，使用一次性重力流凝胶过滤柱即可，该方法简便且快速（参见材料列表）。mantATP与无核苷酸驱动蛋白的相互作用在一系列不同mantATP浓度下进行（步骤2.4），以便解卷积出结合与解离的速率常数（步骤2.8）。此类实验背后的理论已在参考文献18中得到充分阐述。在进行这些实验时，应从最低浓度的mantATP开始，从而避免在不同浓度之间更换样品时需要洗涤步骤。随着mantATP浓度的增加，可能需要调整停流荧光仪的灵敏度。 mantATP的浓度必须始终至少为驱动蛋白核苷酸结合位点浓度的5倍以上，以维持假一级反应条件。然而，随着mantATP浓度的升高，由于结合到驱动蛋白上的核苷酸比例下降，信号变化可能变得微弱。因此，对于每一个新的mantATP浓度，也相应提高驱动蛋白的浓度，使mantATP的浓度从不超过核苷酸结合位点浓度的10倍摩尔过量（步骤2.6）。

mantADP 解离

尽管mantADP的结合与解离速率常数可通过与mantATP相同的方法测定（第2节）。然而，驱动蛋白中ADP的解离可通过预先将核苷酸结合位点负载mantADP（步骤3.1–3.3）直接观察。随后将mantADP·驱动蛋白复合物与过量的未标记ATP混合（步骤3.5）。过量的未标记ATP可防止mantADP重新结合到驱动蛋白上，从而使得解离反应（图1，k₄）能够独立于mantADP的结合反应而被单独观察。在此检测中，未标记ATP的浓度必须至少为核苷酸结合位点摩尔浓度的50倍以上。该检测方法的理论基础在参考文献18中有详细描述。与步骤2.8中所述的外推至y轴的方法相比，这种直接方法可更准确地测定解离速率常数。

微管的包含

所述方法还可用于测定在微管存在条件下核苷酸结合与解离的动力学。在停流混合前，将微管加入含有核苷酸的注射器中：图3B 和 图4B （插图）。在此配置下，驱动蛋白将在同一时间接触核苷酸和微管。使用的是稳定的微管，其微管蛋白聚合物的寿命通过添加稳定剂化学物质（如紫杉醇）或不可水解的GTP类似物（如鸟苷-5'-[(α,β)-亚甲基]三磷酸盐（GMPCPP，见材料列表））而得以延长。可使用两轮GMPCPP介导的微管蛋白聚合来制备微管，这些微管可在液氮中保存数月之久^9,19。使用预先制备的微管可显著降低进行此类检测的实际难度。在检测中加入微管时，重要的是使用适合维持微管稳定性的反应缓冲液。首选缓冲液为PIPES缓冲体系，最常用的缓冲液包含80 mM PIPES（pH 6.9）、1 mM MgCl₂ 和 1 mM EGTA（称为BRB80）^20,21。

所述方法不仅限于驱动蛋白的使用，还可改编并应用于任何核苷酸结合蛋白。例如，类似的方法已被应用于分子马达肌球蛋白家族成员的ATP转化循环^12,22，而使用荧光标记的鸟苷酸则进一步将此类方法扩展至GTP水解蛋白^23,24。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2’/3’-(N-甲基氨基甲酰)腺苷-5’三磷酸盐	Jena Biosciences	# NU-202	mantATP
2’/3’-(N-甲基氨基甲酰基)腺苷-5’-二磷酸	Jena Biosciences	# NU-201	mantADP
Mg-ATP	罗氏	# 10519979001	ATP的二钠盐配制成100 mM的浓度 毫摩尔在100中 mM MgCl2浓度应通过在260处的吸光度进行验证 nm（e = 15,400） M-1cm-1）。溶液分装后于 -20 ℃ 保存 oC.
乙二胺四乙酸（EDTA）	Fisher Scientific	BP120-500	0.5 M 水溶液，pH 8.0。危险：粉末吸入有害。
二硫苏糖醇（DTT）	梅尔福德	MB1015	1 现配现用的 M 储备液，溶于水。危险：粉末吸入或与皮肤接触有害。
NAP-5 柱	GE Healthcare	# 17-0853	G-25 Sephadex 树脂重力流凝胶过滤柱
GMPCPP	Jena Biosciences	# NU-405	GTP的不可水解类似物
停流荧光仪	应用光物理学	SX20	连接了一些管路装置的荧光计，可使试剂在观测比色皿中快速混合，从而实现对约0.1毫秒时间尺度上的反应动力学进行研究。 - 100 秒，需进行监测。