啮齿类动物胸腺切除术是免疫学研究中一种有价值的技术。本文介绍了一种通过小切口胸骨切开术，结合无创插管和正压通气，在成年大鼠中实施完全胸腺切除的实验方案，以最大限度地减少围手术期的发病率和死亡率。
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摘要
摘要
新生啮齿类动物的胸腺切除术是一种成熟且可靠的免疫学研究方法。然而，在成年大鼠中，由于胸膜破裂可能导致出血和气胸等并发症，从而造成较高的死亡率。本方案介绍了一种采用小型胸骨切开术和气管插管的简单大鼠胸腺切除方法。插管操作通过一种无创且易于重复的方法完成，可实现正压通气以预防气胸，并建立可控气道，为精细的胸腺解剖提供充足时间，从而最大限度减少胸膜损伤。1.5 cm的胸骨切口可减少与纵隔血管及胸膜的接触，同时仍能充分暴露胸腺。暴露纵隔后，在放大条件下通过钝性分离法切除胸腺。随后通过缝合气管前肌封闭胸膜腔，再使用外科胶水加固密封。胸腔的关闭依次通过缝合胸骨和皮肤完成。所有胸腺切除均经纵隔组织免疫组化（IHC）染色证实为完全切除，并通过流式细胞术确认未成熟T细胞的缺失，该手术的存活率达到96%。当需要为无胸腺成年大鼠进行后续免疫学研究时，若要求实现完全胸腺切除并尽量减少并发症，本方法尤为适用。
引言
自20世纪60年代初以来，胸腺在中枢免疫耐受形成中的关键作用已被公认。啮齿类动物胸腺切除术已被证明是明确胸腺在淋巴细胞分化、自身耐受以及同种异体移植和肿瘤转移背景下免疫耐受中作用的重要手段。切除大鼠胸腺可实现T细胞耗竭相关研究，或在没有内源性初始T细胞重新出现的情况下进行特定T细胞群体的过继转移研究。
采用负压吸引技术可对新生啮齿类动物成功实施胸腺切除术，并获得可靠的结果1。在成年大鼠中，该技术相关的死亡率约为20%，且常导致胸腺切除不完全2。为了在成年大鼠中持续实现完全性胸腺切除，需通过胸骨正中切开术暴露纵隔。然而，该手术可能引发气管损伤、出血和气胸等并发症，总体死亡率约为1.5%至6%2-4。
近二十年来，胸腺切除术技术的进步已降低了围手术期并发症，并提高了生存率。采用气管插管以实现正压通气，已减少了气胸的发生率5。既往描述的插管方法包括从开放暴露气管到使用直接声带可视化技术的较微创方法。与插管操作相关的并发症包括气管损伤、声带破裂、意外食管插管，以及因心脏穿刺或上腔静脉撕裂导致的出血。此外，胸腺下叶与胸膜紧邻，可能导致气胸的发生。
本文介绍一种通过2 cm微小皮肤切口进行胸腺切除的技术，该技术采用钝端血管导管和经皮气管透照法进行简单的气管插管。胸腺切除术包括1.5 cm胸骨切开，并采用三层缝合，同时使用外科胶水封闭纵隔，以减少出血和呼吸系统并发症的发生。该方法可实现完全性胸腺切除，术后CD4+和CD8+初始T细胞消失，免疫组化染色未见胸腺组织残留，证实了切除的彻底性。手术时间短，围手术期死亡率极低。
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方案
注意：所有涉及大鼠使用的实验操作均按照杜克大学动物护理与使用委员会批准的方案进行。
1. 气管插管导管的准备
- 使用剪切钳剪断2英寸14G血管导管针的针头端。
- 用尖嘴钳夹紧针管内腔使其闭合。
- 用剪切钳将夹闭部分剪至开放内腔段的边缘，然后将剩余末端两侧边缘以30–45°角斜剪，斜面朝向针缘。
- 将套管底部3–4 mm放入直式滑动接头钳的开口区域，向上拉起，直至末端形成轻微上翘的弧度。
注：这有助于将导管顺利导入气管（图1）。 - 使用细砂纸打磨套管末端的边缘，使其光滑。
- 将钝化的器械重新插入血管导管管路中，确保管路略短于钝化后的针头。
2. 术前操作步骤
- 通过将手术显微镜置于手术区域上方并调节至10倍放大倍数，准备手术场地。
- 在手术区域放置加热垫，并覆盖干净的吸水垫。
- 在手术区域附近设置心率和血氧饱和度监测仪。
- 称量大鼠体重，用于按体重计算药物剂量（例如，术后镇痛药、抗生素或淋巴细胞耗竭抗体）。
注意：成年大鼠的典型体重范围为350 - 450 g。 - 使用连接至含有活性炭的废气麻醉气体回收系统的诱导室，以3%异氟烷-O2（3 L/min）的气化形式对大鼠进行麻醉。给予5分钟诱导时间，以达到气管插管所需的深度麻醉状态。
- 在进行插管和手术之前，皮下注射卡洛芬或美洛昔康（4.4 mg/kg）给大鼠。
- 在插管前，使用电动剪毛器剃除麻醉后大鼠的颈部和胸部毛发。
3. 插管
- 通过在气管插管导管末端涂抹少量润滑剂（例如，K-Y 凝胶）来准备插管装置。打开呼吸机，使异氟烷气体开始流经连接管。
- 将大鼠转移至插管装置，并用其上门齿将其悬挂在金属杆上（图 2A）。
注意：某些插管装置可在线购买。此处展示的模型为自制，使用丁烷喷灯将亚克力板围绕一段 2 英寸 × 4 英寸的腰椎部件进行塑形，并用氯仿加固。为防止亚克力板碎裂或开裂，先在侧面贴上遮蔽胶带，再钻孔以固定金属杆（或金属丝）。 - 将一个柔性的高强度光源置于大鼠颈部腹侧面 1 - 2 cm 处，对颈部进行透照（图 2B）。
- 使用一对学生标准型镊子，轻轻将舌头向上并朝向底侧牙齿方向牵拉。用一只手的拇指和食指夹住舌头，同时将镊子一侧的扁平内面贴在舌头下端。向腹侧按压以暴露会厌和喉部开口（图 2C）。
- 观察声带，并将气管插管导管前端向上弯曲且钝化的末端向前引导，经开放的声门进入气管，直至套管座接触上门齿。
- 取出金属导丝，并将麻醉气体管路连接至套管接口，开始使用异氟烷进行通气。
注意：输送至呼吸机的典型氧气流速为 3 L/min，异氟烷浓度为 3%。- 将呼吸机设置为容量控制通气模式，呼吸频率为 60 次/分钟，达到约 12 - 14 mmHg 的气道压力。呼气末正压（PEEP）设为 3 cm H2O。
- 观察双侧胸壁随呼吸机同步扩张，以确认气管内导管位置正确。
- 根据兽医建议，在大鼠眼睛上涂抹眼膏，以防止麻醉期间角膜干燥。
- 在大鼠眼睛上涂抹兽医专用眼膏，以防止麻醉期间角膜干燥。
- 使用一条布质胶带将气管内导管固定于大鼠头部，并确保气管内导管与麻醉气体输入管路之间连接牢固。
- 将血氧饱和度和心率监测仪连接至大鼠足部并开始监测。通过确认大鼠对足趾夹捏无反应，判断其已达到适当的麻醉深度。
4. 开胸术与胸腺切除术
- 整个操作过程中均应遵循标准的无菌技术。
- 清洁工作区域和手术台，并用70%乙醇溶液进行消毒。
- 操作过程中佩戴无菌外科手套，所有使用器械和材料均需经高压灭菌处理。
- 用聚维酮碘涂抹整个胸部区域，待其自然干燥后，再用浸有70%乙醇的纱布擦拭皮肤表面。用透明塑料膜覆盖大鼠身体，在手术区域对应位置剪开一小孔以暴露无菌手术野。
- 确定胸上部的胸骨上切迹位置。从胸骨上切迹上方2–3 mm处开始，沿胸骨中线向下做一条长约2 cm的正中切口，使用钝头Shea剪刀完成。
- 从胸骨上切迹开始，再次使用钝头Shea剪刀进行长约1.5 cm 的胸骨正中劈开术。操作时保持剪刀底端紧贴胸骨下方，缓慢推进。
- 将小型Alm牵开器插入分离后的胸骨下方，打开牵开器以暴露气管前带状肌（胸骨舌骨肌和胸骨甲状肌）。使用钝头Graefe镊子分离气管前带状肌。 注意：此时应可见气管，且插管导管应在气管内清晰可见。
- 将 小型Alm牵开器的叉臂置于分离后的带状肌和胸骨下方，打开牵开器以暴露胸腺的上部。
- 使用精细的Dumont镊子松解胸腺组织的外侧边缘，暴露下部胸腺叶。
- 轻柔地将胸腺向上牵拉至开放的切口处，注意避免接触上腔静脉、锁骨下血管和颈动脉，同时尽量减少对胸腺与肺之间脆弱胸膜层的损伤。
- 当分离并暴露胸腺血管时，使用显微剪刀将其切断。如需止血，可用棉签轻压血管以实现止血。
- 将下部胸腺叶完全移入切口后，锐性分离其后方附着结构。完整取出胸腺，并仔细检查切除的胸腺组织是否有缺失部分。
注意：胸腔内可能观察到围绕胸腺的小淋巴结，其外观常与胸腺组织难以区分。这些淋巴结呈独立的圆形结构，外观类似胸腺组织，但与胸腺主体不相连。 - 移除Alm牵开器，使用两针间断的5-0 Maxon缝线关闭胸骨舌骨肌和胸骨甲状肌。
- 在缝线上方滴加2滴外科级氰基丙烯酸酯组织粘合剂，以在正压通气条件下封闭纵隔。
注意：此步骤可降低气胸和血肿的发生率。 - 使用两针间断的4-0丝线（带切割针）缝合胸骨。进针时穿过肋间隙，注意引导针头紧贴胸骨下方，避免损伤深层肌肉层。
- 使用连续的4-0尼龙缝线缝合皮肤层。此时停止异氟烷麻醉，以缩短术后麻醉恢复时间。
- 用生理盐水浸湿的纱布清洁切口部位及周围皮肤。
- 在切口处局部滴加数滴布比卡因（0.25%）进行局部麻醉，随后滴加1–2滴氰基丙烯酸胶水封闭切口。
- 继续通气直至大鼠出现自主呼吸迹象并开始活动四肢。拔除气管插管，将大鼠置于带有加热垫的笼中，在密切观察下恢复。
- 术后立即皮下注射布托啡诺（0.01–0.05 mg/kg），之后每8–12小时 重复一次，持续48小时 （通常共5次剂量）。在术后24小时和48小时 ，皮下注射卡洛芬或美洛昔康（4.4 mg/kg）（包括术前剂量在内共3次剂量）。
- 持续监测直至大鼠能在笼内自由活动。一旦出现呼吸困难迹象，应立即重新插管并对胸腔进行再次探查。
- 在动物恢复足够意识以维持胸卧位之前，不得使其无人看管。
- 接受手术的动物在完全恢复前不得与其他动物同笼饲养。
- 术后1周拆除皮肤层缝线。
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结果
该操作在成年Lewis大鼠（n = 26）上进行。平均手术时间为15 ± 3分钟。术中无死亡病例。平均插管时间——从将大鼠放置于插管装置至建立通气——为45 ± 5秒。24只大鼠术后完全恢复，至术后第14天（POD 14）未见呼吸困难或出血迹象。1只大鼠在POD 4出现呼吸困难，接受再次手术以探查纵隔。术中发现该大鼠存在肺叶塌陷。在肺组织重新扩张后，于正压通气条件下使用外科胶水重新封闭纵隔，随后关闭胸腔。该大鼠恢复良好，未再出现呼吸异常。另1只大鼠于POD 7因不明原因死亡。
胸腺切除术后，检查纵隔内是否有残留胸腺组织，并对切除的胸腺组织进行肉眼观察以确认是否存在缺损区域，随后进行组织学检查。在尸检时，采用苏木精-伊红（H&E）染色法检查胸部组织。随后进行细胞角蛋白的免疫组织化学（IHC）染色，以区分残留胸腺组织与胸部淋巴结（LN），尤其关注H&E染色中细胞核着色较强的区域，因为这在胸腺组织中属正常表现。细胞角蛋白染色使用兔全型抗细胞角蛋白抗体作为一抗，随后使用生物素标记的山羊抗兔IgG及Vectastain Elite ABC试剂盒。染色切片在显微镜评估前用苏木精...
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讨论
本完全胸腺切除方案采用微创方法，通过三层缝合切口并使用手术胶水，旨在最大限度减少并发症。通过幼稚T细胞的缺失以及纵隔淋巴组织的细胞角蛋白免疫组化染色，证实了胸腺的完全切除。
成年大鼠胸腺切除术因围手术期并发症导致死亡率在1.5%至20%之间，其中大多数并发症归因于胸腺下叶与胸膜、心脏及主要纵隔血管的密切解剖关系2-4。开放性气管插管技术（即穿刺气管）的死亡率约为6%2。Na及其同事曾报道使用无创气管插管技术，但未报告存活率5。本方法采用经皮气管透照技术，并使用如本文所述制备的导管，可清晰显示声带，从而实现稳定成功的插管。该方法无需使用高级设备，有别于其他已报道的无创插管技术2,5-8。我们通过钝化血管导管针头末端并在其尖端形成向上弯曲的结构，有助于避免误入食管插管，同时最小化气管损伤。此方法是对先前描述的使用改良血管导管进行插管技术的改进9。
我们发现，尽量缩小胸骨切口可减少与纵隔主要血管的接触，...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目AI101263（T.V.B.）以及哈特韦尔基金会资助项目（M.L.M.）支持。M.L.M. 是杜克综合癌症中心成员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2 英寸 14 G 血管导管 | |||
| 手术显微镜 | Zeiss | ||
| 加热垫 | |||
| 带足部传感器的啮齿类动物心率和血氧监测仪 | Harvard Apparatus | ST1 72-8010, ST1 72-8098（大鼠足部传感器） | |
| 插管装置（顶部带金属杆的塑料装置） | 见 图 2 | ||
| 小动物麻醉系统，含诱导箱、异氟烷储罐和 O2 储罐 | Harvard Apparatus | ST1 72-6420 | |
| 带管路的小动物呼吸机 | CWE | 12-02000（呼吸机）和 12-04000（小鼠/大鼠外置阀组件） | |
| 高强度光纤照明系统 | Dolan Jenner | EEG 2823M | |
| 标准型学生用镊子 | Fine Science Tools | 91100-16 | |
| 精细直剪 | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| 钝头 Shea 剪 | Fine Science Tools | 14105-12 | |
| 小型 Alm 牵开器（用于胸骨） | Fine Science Tools | 17008-07 | |
| 钝头 Graefe 镊 | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| 精细 Dumont 镊 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| 5-0 Maxon 缝合线 | Ethicon | ||
| 4-0 丝线缝合线（带切割针） | Ethicon | ||
| 6-0 尼龙缝合线 | Ethicon | ||
| 氰基丙烯酸酯胶（Endermil） | |||
| 润滑凝胶 | Akorn Animal Health | NDC 17478-162-35 |
参考文献
- Hard, G. C. Thymectomy in the neonatal rat. Lab. Anim. 9 (2), 105-110 (1975).
- Kobayashi, E., et al. A technique for complete thymectomy in adult rats. J. Immunol. Methods. 1759 (94), 0-3 (1994).
- Delrivière, L., Gibbs, P., Kobayashi, E., Kamada, N., Gianello, P. New technique of complete thymectomy in adult rats without tracheal intubation. Microsurgery. 18 (1), 6-8 (1998).
- Walker, K. G., Jacques, B. C., Tweedle, J. R., Bradley, J. A. A simpler technique for open thymectomy in adult rats. J. Immunol. Methods. 175 (1), 141(1994).
- Na, N., Zhao, D., Huang, Z., Hong, L. An improved method for rat intubation and thymectomy. Chin. Med. J. (Engl). 124 (17), 2723-2727 (2011).
- Kastl, S., et al. Simplification of rat intubation on inclined metal plate). Adv. Physiol. Educ. 28 (1-4), 29-34 (2004).
- Weksler, B., Ng, B., Lenert, J., Burt, M. A simplified method for endotracheal intubation in the rat. J. Appl. Physiol. 76 (4), 1823-1825 (1994).
- Jou, I. M., et al. Simplified rat intubation using a new oropharyngeal intubation wedge. J. Appl. Physiol. 89 (5), 1766-1770 (2000).
- Rivard, A. L., et al. Rat intubation and ventilation for surgical research. J. Invest. Surg. 19 (4), 267-274 (2006).
- Zhao, D., et al. A model of isolated, vascular whole thymus transplantation in nude rats. Transplant Proc. 44 (5), 1394-1398 (2012).
- AbuAttieh, M., et al. Affinity maturation of antibodies requires integrity of the adult thymus. Eur. J. Immunol. 42 (2), 500-510 (2012).
- Reeves, J. P., Reeves, P. A., Chin, L. T. Survival surgery: removal of the spleen or thymus. Curr. Protoc. Immunol. 1 (Unit 1.10), (2001).
- Siemionow, M., Izycki, D., Ozer, K., Ozmen, S., Klimczak, A. Role of thymus in operational tolerance induction in limb allograft transplant model. Transplantation. 81 (11), 1568-1576 (2006).
- Satoh, E., et al. Immunosuppressive effect of long-term drainage of thoracic duct on immunological memory in adult thymectomized rats. Transplant. Proc. 37 (4), 1947-1948 (2005).
- Groen, H., Klatter, F., Pater, J., Nieuwenhuis, P., Rozing, J. Temporary, but Essential Requirement of CD8+ T Cells Early in the Pathogenesis of Diabetes in BB Rats as Revealed by Thymectomy and CD8 Depletion. Clin. Dev. Immunol. 10 (2-4), 141-151 (2003).
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