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利用无标记生物传感器技术检测乳腺癌中的人类白细胞抗原生物标志物

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DOI：

10.3791/52159

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2015年3月24日

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1Experimmune, A Center for Immunotherapeutic Development, Department of Immunotherapeutics and Biotechnology, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Resonant Sensors Incorporated, 3University of Texas Arlington

本文内容

摘要

完整的I类HLA/肽复合物由癌细胞释放，可能成为一种重要的癌症生物标志物。利用无标记传感器技术和模拟T细胞受体的单克隆抗体，本研究展示了在MDA-MB-231细胞上清液、添加了目标物的人血清以及患者血浆中检测释放的MIF/HLA-A*02:01复合物的方法，从而为开发一种新型癌症诊断平台提供了可能。

摘要

根据美国癌症协会的数据，每年将有超过20万名女性被诊断为侵袭性乳腺癌，其中约4万人将死于该疾病。人类白细胞抗原（HLA）I类分子可呈递来自细胞蛋白经蛋白酶体降解产生的肽段，并将这些片段展示于细胞表面，供循环中的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）识别。针对乳腺癌特异性肽段/HLA-A*02:01复合物（例如来源于巨噬细胞移动抑制因子（MIF19-27）和NY-ESO-1157-165）的T细胞受体模拟（TCRm）单克隆抗体（mAbs）的开发，使得在缺乏有效抗肿瘤CTL应答的情况下仍可实现对乳腺癌细胞的检测与清除。完整的I类HLA/肽复合物可由乳腺癌细胞释放，可能作为重要的癌症生物标志物。本研究展示了一种突破性的癌症诊断生物标志物筛选系统，该系统结合T细胞受体模拟单克隆抗体与一种新型无标记生物传感器，利用导模共振（GMR）传感技术实现检测。研究证实了该系统可在MDA-MB-231细胞上清液、添加了目标物的人血清以及患者血浆中检测到释放的MIF/HLA-A*02:01复合物。本工作的潜在影响在于通过为靶向免疫疗法开发配套的疾病诊断工具，推动个体化医学的革新。

引言

Ⅰ类人类白细胞抗原（HLA）可结合由细胞内蛋白质组经蛋白酶体降解产生的8-11个氨基酸长度的肽段，并将这些肽段呈递至所有有核细胞的细胞表面1,2。HLA复合物是“自然的生物标志物”，向循环中的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）提示每个细胞的健康状态（图1）。当CTL识别出与疾病相关的肽段时，即可清除异常细胞。因此，适应性免疫应答在清除病毒感染和肿瘤方面具有高度有效性。然而，免疫系统施加的选择压力常常促使能够逃逸有效CTL应答的病毒或肿瘤被筛选出来。识别特定肽/HLA-A*02:01复合物（例如来源于乳腺癌相关蛋白的肽段，如巨噬细胞迁移抑制因子（MIF19-27）3 和 NY-ESO-1157-165）的T细胞受体模拟型（TCRm）单克隆抗体（mAbs），可在缺乏有效抗肿瘤CTL应答的情况下实现对乳腺癌细胞的检测与清除4,5。本代表性研究聚焦于HLA-A*0201分子，该分子在高达30%的人群中表达。然而，通过鉴定其他相关的HLA/肽复合物，并继而制备相应的TCRm抗体，可推动靶向免疫疗法及伴随诊断技术的发展，从而将本研究的应用范围扩展至更广泛的人群。

一部分结合于细胞表面的肽/HLA复合物会释放到血浆中。由于肽/HLA复合物群体具有高度复杂性，目前从免疫肽组中挖掘HLA相关生物标志物的方法耗时较长。该过程需要通过亲和纯化从血浆中分离可溶性HLA，再利用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分离与HLA结合的肽段，并通过串联质谱法（MS/MS）进行肽段测序6,7。尽管该方法可用于发现新的治疗靶点，但对于已处于治疗性疫苗或生物制药研发管线中的HLA相关靶点而言，作为伴随诊断工具则显得繁琐不便8-10。针对这些靶点的TCR样抗体（TCRm）为快速开发伴随诊断提供了工具，可用于将患者分层纳入相应的临床试验，并提供更具依据的治疗选择。

本研究提出了一种用于癌症诊断的突破性生物标志物筛选系统，该系统利用TCRm和一种无标记生物检测系统，可在最少处理步骤下监测生物分子相互作用。该无标记生物检测系统基于一种利用介质波导光栅中发生的导模共振（GMR）效应的方法11-14。当宽带光照射该系统所需检测板上的衍射光栅时，会反射出两个特定波长的光。通过光谱分析仪实时追踪共振波长的偏移，可监测固定化受体与其配体之间的结合相互作用12。入射光的TE（电场矢量垂直于入射面）和TM（磁场矢量垂直于入射面）偏振态会产生独立的共振峰，提供多个数据点，从而有望提高检测准确性11,14。在该无标记检测系统中使用预先致敏抗体的检测板，整个检测流程（含数据分析）运行时间约为45分钟。此外，可在96孔或384孔板格式中同时检测多个患者样本，相较于基于HPLC-MS/MS的方法具有明显优势。

方案

伦理声明：根据经机构审查委员会批准的方案，从 Hendrick 医疗中心获取去标识化的人体组织和血浆样本。

1. 添加生物素化抗体

注意：此步骤的监测为可选操作。如果不进行监测，请参见替代方案。

  1. 获取市售的链霉亲和素衍生物包被板（参见 材料 和 设备表).
  2. 向孔中加入 50 µl 磷酸盐缓冲液（PBS）pH 7.2。
    注意：将 PBS 预孵育在 28 °C，以尽量减少与温度相关的共振漂移。
  3. 打开生物检测扫描仪软件，按照设置向导定义实验流程，包括在板布局中选择空白孔、标准品和样品，设置温度（28 °C）、每分钟扫描次数（1次）以及实验时长（150分钟，以容纳前期准备步骤）。
  4. 将准备好的检测板插入无标记生物检测扫描仪中，并开始第一次扫描。第一次扫描完成后，选择“自参考启动”。基线是实验开始时采集的初始扫描数据集。如果这是对该特定检测板进行的首次读数，请让扫描仪运行一段时间，以平衡温度并消除基线漂移。参见 图2 基线信号截图，随后添加样品。
  5. 基线稳定后，或至少完成5次扫描后，暂停读数并弹出酶标板。
  6. 弃去 PBS，将除对照孔外的各孔中加入 50 µl RL21A 生物素化抗体（用 pH 7.2 的 PBS 配制，浓度为 10 µg/ml）；对照孔中加入 50 µl PBS。
  7. 将培养板重新插入生物检测扫描仪，继续读数直至达到饱和，约需1.5小时。
  8. 暂停读取并弹出酶标板。
  9. 用 200 µl/孔含 0.05% Tween 20 的磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤平板 3 次，随后用 200 µl/孔 pH 7.2 的 PBS 洗涤 3 次。重复用 PBS 洗涤一次。下一步操作前，将平板倒置在纸巾上轻拍，去除多余的 PBS。
    注意：此步骤可在自动洗板机上进行，或通过将液体倾倒至水槽中，并用移液器更换PBST，每孔加入200 µl，洗涤3次。
  10. 向所有有活性的孔中加入 50 µl PBS（pH 7.2）。
  11. 将平板重新插入生物检测扫描仪，继续读取以监测洗涤后的共振信号。
  12. 停止读取并弹出酶标板。

步骤1的替代方案：

  1. 向所有孔中加入50 µl RL21A生物素化抗体（浓度为[10 µg/ml PBS]）。
  2. 室温孵育1.5小时，或4 °C过夜孵育。
  3. 用200 µl/孔PBST洗涤平板3次，随后用200 µl/孔PBS冲洗3次，操作同步骤1.9。

2. 添加分析物

  1. 吸去 PBS，并向每孔加入 50 µl 适当的检测缓冲液。本实验中使用市售正常人血清，以 PBS 按 1:20 比例稀释。
  2. 打开生物检测扫描仪软件，按照设置向导定义实验程序。
  3. 将微孔板插入生物检测扫描仪，开始基线读数。若为该特定微孔板的首次读数，应让扫描仪运行以平衡温度并消除基线漂移。
  4. 待基线稳定后，或至少完成 5 次扫描后，暂停读数并弹出微孔板。
  5. 从各孔中移除检测缓冲液。
  6. 在对照孔中加入含相关（FLSL）或无关（SLLV、YLEV 或 KVL）肽段的 HLA A*02:01 单体，浓度范围为 [0.625–10 µg/ml]，溶于检测缓冲液中。向微孔板的对照孔加入 50 µl 标准品。
  7. 向微孔板的样品孔中加入 50 µl 检测缓冲液中的待测物。本实验中使用含添加物的市售人血清。
  8. 将微孔板重新插入生物检测扫描仪，继续读数直至达到饱和，约需 30–60 分钟。
  9. 暂停读数并弹出微孔板。
  10. 用 200 µl/孔 PBST 洗涤微孔板 3 次，随后用 200 µl/孔 PBS 冲洗 3 次，步骤同第 1.9 步。
  11. 向所有活性孔中加入 50 µl 检测缓冲液。
  12. 将微孔板重新插入生物检测扫描仪，继续读数以监测洗涤后的共振信号。
  13. 停止读数并弹出微孔板。
    注意：检测缓冲液可根据实验目的选用 PBS、组织培养基或以 PBS 按 1:20 稀释的人血清。

3. 数据分析

  1. 使用生物检测扫描仪软件进行分析，或将原始数据文件导出至常用的统计分析软件。生物检测扫描仪软件会根据实验设置过程中提供的板布局自动生成结合曲线。
    注意：如果未使用生物检测扫描仪软件进行分析，请遵循步骤 3.2–3.4。
  2. 从每个后续数据点中减去基线值和阴性对照值。
  3. 计算每个时间点重复孔的均值和标准差。
  4. 绘制结合曲线图，或选择终点数据用于柱状图。

结果

采用已明确表征的TCRm RL21A进行了一组代表性实验，RL21A是一种小鼠IgG2a单克隆抗体，可特异性识别在HLA-A*02:01分子背景下呈递的肽段（MIF19-27 或 FLSL）3。本实验使用相应的肽段/HLA单体以及无关的HLA单体15来演示所述操作流程。图3展示了该检测的实验设计。

RL21A 特异性识别 FLSL/HLA 单体，与其他肽段/HLA 复合物的交叉反应性极低3。这种特异性在无标记生物检测系统中得以重现（图4）。通过在固定的 FLSL/HLA 单体上滴定 RL21A 抗体，确定该无标记生物检测系统在此实验中的灵敏度处于低纳摩尔范围（图5）。尽管血清样本中的背景信号显著升高，但在加标的人血清中仍可特异性检测到 FLSL/HLA 单体（图6），且这些样本中可清晰观察到浓度梯度。最后，如本研究所示，来源于 MDA-MB-231 细胞系的上清液（此前已证实其可呈递 FLSL/HLA-A*02:01 分子）中含有可溶性 FLSL 单体（图7）。后续添加 FLSL/HLA 单体可增强 RL21A 上的信号（图7）。由于系统的高灵敏度，孔间差异可能导致包括负共振偏移在内的信号波动，这在 图4 和 图5 的标准差中有所体现。通过将所有样本及生物检测仪平板读数器预先在略高于室温的条件下（即 28 °C）孵育，可显著降低此类变异。

在图8中，简言之，将96孔聚苯乙烯板在室温下用[10 µg/ml]的RL21A包被2小时，用PBST洗涤后，以0.5%低脂牛奶封闭，再用PBST洗涤，随后加入用PBS按1:10稀释的正常人血清中系列稀释的FLSL HLA单体，或用PBS按1:10稀释的患者血浆，在室温下孵育2小时，以生成标准曲线。用PBST洗涤平板后，加入兔抗人β2微球蛋白抗体[1:5,000]，在室温下孵育1小时以检测完整的HLA，再用PBST洗涤。随后，平板与羊抗兔IgG抗体[1:10,000]在室温下孵育30分钟，并用PBST洗涤。显色检测采用ABTS（2,2’-联氮双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]二铵盐）底物，孵育15分钟，在酶标仪上于405 nm处读取吸光度。在三个患者样本中检测到了FLSL/HLA。

在图8B中，将患者血浆RL.064用PBS按1:20稀释后加入到平板中，并在无标记检测仪上监测60分钟。实现了对患者血清中FLSL/HLA复合物的特异性检测。使用绘图与统计分析软件进行学生t检验（p <0.05）。

在图8C中，组织切片分别使用1 µg/ml的小鼠抗-HLA-A2（BB7.2）作为阳性对照，RL21A、IgG2b和IgG2a作为阴性对照进行染色。染色通过抗小鼠检测试剂盒、DAB（二氨基联苯胺）以及苏木精QS（用于细胞核染色）进行检测，操作按制造商说明进行。RL21A对肿瘤组织的染色证实了FLSL/HLA复合物的呈递。

从正常细胞到癌变细胞的转化示意图；HLA-肽复合物与TCR样抗体相互作用。
图1：人类白细胞抗原I类分子对肿瘤抗原的呈递。 癌变是一种细胞内紊乱过程。HLA分子可采样细胞内蛋白质，并在细胞表面揭示与癌症相关的改变。细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和TCR样抗体（TCRm）能够通过识别仅存在于癌细胞上的HLA-肽复合物来特异性识别癌细胞。

光谱分析中显示共振位移随时间变化的静态平衡图，样品添加。
图 2：生物测定扫描仪软件中数据采集的截图。生物测定扫描仪软件。 数据采集示例，显示初始基线扫描，随后向包被有 10 µg/ml FLSL/HLA 复合物的微孔板中加入 RL21A 抗体。抗体浓度如图所示。每条曲线代表一个随时间监测的独立孔。

HLA-多肽检测示意图，显示TCRm抗体结合用于蛋白质相互作用分析。
图3：检测模式。 抗体固定于检测板的衍射光栅表面，捕获溶液中相应的多肽/HLA复合物的示意图。

共振位移条形图；10分钟和35分钟后的蛋白质相互作用分析；统计结果。
图4：RL21A对FLSL/HLA复合物的特异性。 展示生物素标记的RL21A TCRm对其相应HLA单体（FLSL）的特异性，相较于无关HLA单体（YLEV、SLLV和KVL）。将生物素标记的RL21A TCRm [10 µg/ml] 固定在链霉亲和素包被的检测板表面，使用无标记的相关或无关HLA单体 [10 µg/ml] 在PBS中进行检测。RL21A特异性识别FLSL/HLA复合物。采用图形与统计分析软件进行双因素方差分析（p <0.001）。

共振偏移曲线；多项式拟合公式，科学图表，纳摩尔浓度。
图5：RL21A 对其同源肽/HLA 复合物的结合灵敏度。展示 RL21A 对 FLSL/HLA 复合物的检测限和结合灵敏度。将生物素标记的 HLA 单体 FLSL [10 µg/ml] 固定在检测板表面，并在 PBS 中按所示浓度梯度加入未标记的 RL21A。该系统的检测范围处于低纳摩尔水平。

显示不同浓度下共振偏移（pm）的柱状图；含显著性标记的实验数据。
图6：在添加了目标物的人血清中检测HLA复合物。 展示在人血清中检测HLA的能力。将生物素标记的RL21A TCRm [10 µg/ml] 固定在亲和素包被的检测板表面。将加入相关HLA单体（FLSL）或无关HLA单体（SLLV）的混合正常人血清用PBS稀释1:20后加入检测板，并在无标记检测仪上监测60分钟。成功实现了在人血清中特异性检测FLSL/HLA复合物。通常情况下，与在PBS中纯化的分析物相比，稀释后血清样本的背景信号更高（参见图4）。使用图形与统计分析软件进行双因素方差分析（p <0.0001）。

显示MDA-231上清液和SLLV/FLSL加标样品在pm单位下的共振偏移的柱状图，含误差线。
图7：在乳腺癌细胞培养上清液中检测到可溶性HLA复合物。本图展示了在乳腺癌细胞上清液中检测HLA的能力。将生物素化的RL21A TCRm、RL9A TCRm（阴性对照）以及同型对照固定于检测板表面。加入[5 μg/ml]加标和未加标的MDA-231细胞培养上清液，并在无标记检测仪上监测60分钟的结合情况。FLSL和SLLV HLA单体加标样品分别为RL9A和RL21A结合的阳性对照。使用图形与统计分析软件进行单因素方差分析（p <0.0001）。

标准曲线和血浆浓度柱状图，共振偏移图；结合数据；显微镜图像。
图 8：患者样本中 FLSL/HLA 复合物的特异性检测。（A）采用传统的酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测患者血浆中的 FLSL/HLA 特异性复合物。（B）将生物素标记的 RL21A TCRm 或 IgG2a [10 µg/ml] 固定在亲和素检测板上。（C）按照先前描述的方法3对来自患者 RL.064 的乳腺肿瘤组织进行染色，以验证肿瘤细胞呈递 FLSL/HLA 复合物的情况。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文所述方法介绍了一种用于癌症诊断的生物标志物筛选系统，该系统可在96孔或384孔高通量板中快速检测患者血清、血浆、尿液或唾液样本中的可溶性肽/HLA复合物。该检测系统利用T细胞受体模拟单克隆抗体及无标记检测技术，将分析时间缩短至1小时以内，而传统ELISA方法需3.5小时。这种高通量方法可实现对患者进行快速分层，从而加速其进入治疗性癌症疫苗或生物制药的临床试验。目前对这些疾病靶标的检测需要对单个患者样本进行亲和纯化及HPLC-MS/MS分析，过程繁琐且耗时。尽管该方法也可适用于传统ELISA技术，但人们担心诸如抗β2微球蛋白抗体等二抗检测试剂可能改变新生HLA分子的结构，从而抑制其与TCRm的结合，影响检测灵敏度。无标记检测可消除此类担忧。本实验流程亦可调整用于其他无标记检测系统，例如表面等离子共振系统。然而，与本研究所采用的生物检测系统相比，这将显著降低高通量检测能力。

该方案可经过有效修改，用于检测患者血清和血浆中的非HLA生物标志物，但需遵循若干关键步骤。建议监测初始抗体包被过程，以优化固相表面， <200 pm的偏移可能导致后续检测步骤信号偏低。基线读数和洗涤后的读数对于终点分析具有参考价值，因为血清蛋白的丰度可能掩盖低浓度分析物的结合信号。最后，样品温度的变化可能导致孔间差异。建议所有样品预先孵育，并将无标记生物检测单元的温度控制器设定在比室温高2-3 °C。冷藏样品应留出足够时间使其达到工作温度。

该方案未来的改进将包括在板表面进行TCRm的多重化。目前该生物检测系统可支持每个孔内至少8重的点样密度。通过在每个孔中引入4-8种TCRm，可减少每个测试样本的体积，从而实现每位患者获取日益复杂的检测数据。这一能力可进一步为患者提供有关治疗选择的信息。

披露

作者 Debra Wawro Weidanz 和 Robert Magnusson 分别是 Resonant Sensors Incorporated 公司的首席执行官和首席技术官，该公司生产本文所使用的生物检测板读板仪和检测试剂板。 

致谢

这些研究部分得到了阿比林发展公司的支持，该公司为Experimmune（位于德克萨斯理工大学健康科学中心的免疫治疗研发中心）以及Resonant Sensors Incorporated提供了实验室空间和薪资支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无标记生物检测 ResoSens 系统Resonant Sensors Incorporated
Avidin 致敏 Bionetic 96 孔板Resonant Sensors Incorporated
ResoVu 软件Resonant Sensors Incorporated
RL21A 生物素化 TCRm 单克隆抗体 PureMHC, LLC
RL9A 生物素化 TCRm 单克隆抗体 PureMHC, LLC
FLSL HLA-A*02:01 单体 Experimmune完整肽序列：FLSELTQQL
SLLV HLA-A*02:01 单体 Experimmune完整肽序列：SLLMWITQV
YLEV HLA-A*02:01 单体 Experimmune完整肽序列：YLEPGPVTV
KVL HLA-A*02:01 单体 Experimmune完整肽序列：KVLEYVIKV
混合正常人血清 ThermoFisherBP2657100
MDA-MB-231 细胞上清液ATCCHTB-26细胞在 IMDM 培养基中添加 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素培养。上清液取自培养 3 天的融合细胞培养物。
伊格尔改良杜尔贝科培养基（IMDM）Life Technologies12440-053
胎牛血清（FBS）Life Technologies10082-147
青霉素/链霉素 Life Technologies15070-63
氢氧化钠ThermoFisher5318-1
磷酸盐缓冲液（PBS）ThermoFisherBP665-1
含 0.05% Tween 20 的磷酸盐缓冲液（PBST）ThermoFisherBP337-500
2,2’-联氮双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]二铵盐（ABTS）ThermoFisher37615
兔抗人 β2 微球蛋白 DakoA0072
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG Jackson Immunoresearch111-035-144
Nunc  微孔板ThermoFisher439454
Synergy 2 微孔板读板仪Biotek
Immpress 试剂盒VectorMP-7402
Immpact DABVectorSK-4105
苏木精 QSVectorH3403
IgG2aMP BioMedicals50328
IgG2bMP BioMedicals50330
抗 HLA-A2（BB7.2）Experimmune
Prism 5Graphpad

参考文献

  1. Shastri, N., Schwab, S., Serwold, T. Producing nature's gene-chips: the generation of peptides for display by MHC class I molecules. Annu Rev Immunol. 20, 463-493 (2002).
  2. Peaper, D. R., Cresswell, P. Regulation of MHC class I assembly and peptide binding. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 343-368 (2008).
  3. Hawkins, O., et al. An HLA-presented fragment of macrophage migration inhibitory factor is a therapeutic target for invasive breast cancer. J Immunol. 186 (11), 6607-6616 (2011).
  4. Verma, B., et al. TCR mimic monoclonal antibody targets a specific peptide/HLA class I complex and significantly impedes tumor growth in vivo using breast cancer models. J Immunol. 184 (4), 2156-2165 (2010).
  5. Verma, B., et al. TCR mimic monoclonal antibodies induce apoptosis of tumor cells via immune effector-independent mechanisms. J Immunol. 186 (5), 3265-3276 (2011).
  6. Bassani-Sternberg, M., et al. Soluble plasma HLA peptidome as a potential source for cancer biomarkers. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18769-18776 (2010).
  7. Hickman, H. D., Yewdell, J. W. Mining the plasma immunopeptidome for cancer peptides as biomarkers and beyond. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18747-18748 (2010).
  8. Neethling, F. A., et al. Assessing vaccine potency using TCRmimic antibodies. Vaccine. 26 (25), 3092-3102 (2008).
  9. Mittendorf, E. A., et al. Clinical trial results of the HER-2/neu (E75) vaccine to prevent breast cancer recurrence in high-risk patients: from. US Military Cancer Institute Clinical Trials Group Study I-01 and I-02. Cancer. 118 (10), 2594-2602 (2012).
  10. Winter, H., Fox, B. A., Ruttinger, D. Future of cancer vaccines. Methods Mol Biol. 1139, 555-564 (2014).
  11. Magnusson, R., Wawro, D., Zimmerman, S., Ding, Y. Resonant photonic biosensors with polarization-based multiparametric discrimination in each channel. Sensors. 11 (2), 1476-1488 (2011).
  12. Kaja, S., et al. Detection of novel biomarkers for ovarian cancer with an optical nanotechnology detection system enabling label-free diagnostics. J Biomed Opt. 17 (8), 081412-081411 (2012).
  13. Magnusson, R., Wang, S. S. New principle for optical filters. Appl. Phys. Lett. 61, 1022-1024 (1992).
  14. Wawro, D., Tibuleac, S., Magnusson, R., Liu, H. Optical fiber endface biosensor based on resonances in dielectric waveguide gratings. Proc. SPIE. 3911, 86-94 (2000).
  15. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).

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乳腺癌生物标志物T细胞受体模拟物导模共振HLA-A*02:01复合物TCRm抗体患者样本分析癌症诊断免疫治疗分层
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