需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

一种用于家禽生产样品中细菌群落定性与定量评估的混合DNA提取方法

14.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/52161

⸱

2014年12月10日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Egg Safety and Quality Research Unit, USDA-Agricultural Research Service, 2Poultry Microbiological Safety and Processing Research Unit, USDA-Agricultural Research Service, 3Department of Biochemistry and Biophysics, Oregon State University, 4College of Public Health, University of Georgia, 5Department of Biological Sciences, Center for Microbial Genetics and Genomics, Northern Arizona University

本文内容

摘要

开发了一种用于环境家禽生产样品的新型半自动化杂交DNA提取方法，并在总细菌群落的定量和定性估计方面，相较于常用的机械和酶法提取方法表现出改进效果。

摘要

DNA 提取方案的有效性在很大程度上取决于所研究样本的类型以及后续分析的类型。考虑到新的细菌群落分析技术（例如，微生物组学、宏基因组学）在农业和环境科学领域正变得越来越普遍，而这些学科中的许多环境样本在物理化学和微生物学特性上具有独特性（例如，家禽生产体系中的粪便和垫料/ bedding 样本），因此需要谨慎选择适当且高效的 DNA 提取方法。为此，我们开发了一种新型的半自动化杂合 DNA 提取方法，专门用于环境家禽生产样本。该方法结合了两种主要类型的 DNA 提取技术：机械法和酶法。在粪便样本“金标准”酶法 DNA 提取流程的起始阶段，增加了一个两步高强度机械均质化步骤（使用专为环境样本配制的珠击破碎法），以增强从样本基质中释放细菌和 DNA 的效果，并提高革兰氏阳性菌群成员的回收率。一旦杂合方法中的酶解步骤启动，后续的纯化过程即通过机器人工作站实现自动化，以提高样本通量并减少样本处理误差。在处理家禽粪便和垫料样本时，与严格的机械法和酶法 DNA 提取方法相比，这种新型杂合方法在定量（采用 16S rRNA qPCR）和定性（采用微生物组学）评估总细菌群落方面均表现出最佳的整体综合性能。

引言

在分析复杂的临床或环境样本（例如，粪便、土壤）时，目前主要有两种用于DNA提取的方法。第一种是通过强烈的珠磨步骤对基质进行机械破碎；第二种则是通过酶解方式破坏基质，从而在化学释放细菌细胞的同时抑制基质中的PCR抑制物。鉴于这两种提取方法的作用机制不同，已有研究显示，合适的DNA提取方法高度依赖于样本类型和分析目的，这并不令人意外。既往的比较性DNA提取研究表明，某些方法更适用于提高环境样本中DNA的质量和产量1-3，而另一些方法则在群落水平分析中表现出优势，例如变性梯度凝胶电泳（DGGE）4-6、末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）7、自动核糖体基因间隔区分析（ARISA）8以及系统发育微阵列分析9。因此，考虑到近年来细菌群落分析技术的不断进步，必须根据环境样本的类型及拟开展的分析类型，选择或开发合适的DNA提取方法。

新一代测序技术与更定量的群落评估方法（例如定量PCR（qPCR））相结合，正在环境科学和临床科学中日益普及。然而，目前关于DNA提取方法对这些数据集影响的研究仍十分有限。大多数DNA提取方法的比较研究集中于来自人类或人类模型样本的微生物组群落估计10,11，而非农业动物样本。少数针对家禽的新一代测序研究主要关注特定的宏基因组12,13或微生物组14问题，未讨论DNA提取方法对最终微生物组分析结果的影响。考虑到与家禽生产相关的环境样本（例如粪便、垫料/ bedding、牧场土壤）具有复杂的性质，必须谨慎选择DNA提取方法。已知家禽相关的环境样本中含有大量PCR抑制物，有时需将DNA提取物稀释多达500倍才能进行PCR及后续下游分析15-17。因此，必须针对此类样本优化DNA提取方法，不仅需有效物理破坏样本基质，还需能够减少或消除其中大量存在的抑制物。

QIAamp DNA Stool Mini Kit 是一种酶法提取方法，在从难以处理的肠道/粪便样本中提取 DNA 时被认为是“金标准”1,18,19，并已成功应用于家禽环境样本8,14。该方法最大的优势之一是利用专有基质去除 PCR 抑制剂，这对于此类环境样本尤为重要；此外，还可通过自动化工作站显著提高通量并减少样本处理误差。该方法的一个主要缺点是缺乏机械均质化步骤，无法将细菌细胞从环境基质中有效物理分离。在检测非家禽来源的肠道和粪便样本时，在 DNA 提取流程中加入珠击破碎或机械裂解步骤可显著提高提取效率9、DNA 产量和质量1,4,5，并在丰富度、多样性和覆盖度方面显著改善下游的群落分析结果5,6,11。这些研究不仅将机械珠击法与“金标准”酶法进行了比较，部分研究还将机械珠击步骤添加到酶法流程中以提升提取效果6,9,11。

根据上述研究结果，在酶法基础上增加机械均质化步骤，可改进禽类相关环境样本中的细菌群落分析（包括定性和定量分析）。因此，本研究的目标有两个：（1）开发一种新型DNA提取技术，结合机械法（强力均质化步骤）和酶法（去除PCR抑制物及自动化）各自最理想的特点；（2）通过定量方法（qPCR）和定性方法（微生物组学），将该新型方法与代表性的机械法和酶法在细菌群落评估方面进行比较。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 环境禽类生产样品的机械匀浆处理

  1. 提取前，将水浴锅设置为 95 °C，并让水浴锅充分升温至该温度。
  2. 称取 0.33 g 土壤或粪便样品至一个 2 ml Lysing Matrix E 管中。
    1. 管中样品量不得超过 0.33 g，否则后续加入的溶液将超出管子的容量。
    2. 若样品为冷冻状态，需先在室温下解冻后再进行称量。
    3. 若需分析总共 1 g 的土壤/粪便样品，则对每个独立环境样品称取 3 份 0.33 g 的平行样。
    4. 如需在提取前保存样品，可将其存放于锥形矩阵管中，并置于 -20 °C 条件下。
  3. 向样品管中加入 825 µl 磷酸钠缓冲液和 275 µl PLS 溶液。使用涡旋振荡器混合约 15 秒，然后以 14,000 x g 离心 5 分钟。
  4. 倾去上清液，向管中加入 700 µl Buffer ASL。使用涡旋振荡器混合 5 秒。
    1. 确保此时锥形管中留有顶部空间（约占总体积的 10%）。若无足够顶部空间，后续均质步骤中管子容易发生泄漏，可能导致交叉污染和/或样品损失。
  5. 将样品放入 FastPrep 24 仪器中，以 6.0 m/sec 的速度均质 40 秒。
  6. 将均质后的样品以 14,000 x g 离心 5 分钟。将上清液转移至一个新的无菌 2 ml 微量离心管中。
  7. 为最大程度回收样品中的 DNA，重复步骤 1.4 至 1.6，将各次所得上清液合并至同一无菌 2 ml 微量离心管中。

2. 样品匀浆中抑制剂的酶学抑制

注意：本方案使用 QIAamp DNA Stool Mini Kit。

  1. 将上清液置于95 °C水浴中孵育5分钟，以最大限度地从上清液中残留的细胞中回收DNA。
    1. 对于主要含有革兰氏阴性菌的样本，应在70 °C孵育。但如果存在革兰氏阳性菌（如家禽粪便样本中常见的情况），则需在95 °C孵育。
    2. 使用塑料锁扣夹固定微量离心管，以确保管盖不会因内部压力升高而“弹开”，从而避免可能的样品损失。
  2. 打开每个微量离心管释放压力，重新盖紧管盖，并用涡旋振荡器混匀15秒。
  3. 以14,000 × g离心1分钟，移取1.2 ml上清液至新的无菌2 ml微量离心管中。
  4. 向每个样本中加入1片InhibitEx片剂，用涡旋振荡器混匀，直至样品变为均匀的白色或微白色液体。
    1. 将InhibitEx片剂放入含有样本的微量离心管时，应避免用手直接接触片剂。为此，可将装有片剂的泡罩包装直接对准打开的微量离心管口，轻轻推动使片剂从泡罩中脱出并落入管内。
  5. 室温（约25 °C）孵育1分钟，然后以14,000 × g离心5分钟。
  6. 将全部液体转移至无菌1.5 ml微量离心管中，以14,000 × g离心5分钟。
    1. 转移液体时，避免触及在步骤2.5结束时可能已沉淀于微量离心管底部的任何残留颗粒物。

3. 使用 QIAcube 机器人工作站进行自动化 DNA 纯化

注意：塑料耗材的数量、离心机内样品转子适配器的排列方式以及所需缓冲液/溶液的体积，均取决于所运行样品的数量。

  1. 将洗脱管和滤芯管放入转子适配器的相应插槽中。每个样本向转子适配器的中间插槽加入 400 µl。根据待纯化的样本数量，将转子适配器以正确的排列方式放入工作站离心机中。
    1. 确保所有微量离心管盖均已牢固地固定在转子适配器内，否则在纯化程序的离心步骤中可能导致管体断裂。
  2. 向工作站添加所需数量的 1,000 µl 和 200 µl 滤芯吸头，并将提供的缓冲液瓶中加入所需体积的缓冲液。
    注意：本纯化程序所需的缓冲液（AL、AW1、AW2 和 AE）均包含在 QIAamp DNA Stool Mini Kit 中。用户需自行提供 AW 缓冲液所需以及纯化过程中使用的 100% 乙醇。
  3. 将所需体积的提供的蛋白酶 K 溶液加入无菌的 1.5 ml 微量离心管中，并将其放入工作站的 A 插槽。同时，将所需数量（等于待纯化样本数）的 2 ml 安全锁微量离心样本管 RB 放入工作站的振荡区域。
    1. 确保样本管的管盖已牢固放置在工作站的相应插槽中，否则当仪器初始扫描工作站以确认所有所需耗材和液体均已就位时，将导致错误。
  4. 使用工作站的触摸屏，选择 DNA Stool – Human Stool – Pathogen Detection Protocol（粪便 DNA – 人粪便 – 病原体检测程序），并浏览后续屏幕，以确认工作站已正确装载。当所有检查屏幕均通过后，选择“开始”以运行该程序。
    1. 若需提取超过 12 个样本的 DNA，请开始下一组样本的均质化过程（步骤 1），因为 12 个样本的运行在工作站上约需 72 分钟完成。
  5. 从转子适配器中取出样本，盖上管盖，并置于 -20 °C 保存，直至后续下游分析时使用。
    1. 此时，使用基于离心/蒸发的系统合并单个样本的 3 个重复纯化产物（总分析量 = 1 g）。合并重复样本，并重新洗脱至终体积为 100 µl 的 Tris-ETDA 缓冲液中。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

本研究中，新鲜粪便样本和垫料样本采集自美国东南部一处商业肉鸡舍（约25,000只鸡）。肉鸡（Gallus gallus）为科宝500杂交品种，采样时日龄为59天。新鲜粪便和垫料样本取自鸡舍内四个不同区域（靠近湿帘区、靠近饮水/喂料线区、饮水/喂料线之间区以及靠近排风扇区），每个区域的样本均由该区域内五个混合样本组成。鸡舍四个区域的样本按样本类型（粪便或垫料）分别进行提取，并进行定性和定量分析。下文所展示的数据代表了两种环境样本在整个鸡舍范围内的平均值。

采用先前发表的qPCR方案20测定总16S rDNA丰度（用于估算样品中所含的全部细菌群落），并通过各提取方法获得的DNA量对数值进行标准化（基于前文所述的荧光测定分析方法21）。在三种提取方法中，图1显示，机械法对粪便和垫料样品均持续提供了最高的标准化细菌总基因丰度估计值（分别为5.85 ± 0.16 和 5.56 ± 0.08 log10 16S rDNA 拷贝数 ng-1 提取DNA）；而...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

所采用的DNA提取方法影响了粪便和垫料样品中细菌总群落的定性和定量估计结果，这支持了此前观察到的DNA提取方法对样品分析具有依赖性1,3,6。对于粪便和垫料样品，不同DNA提取方法在细菌总群落的定量估计（机械法 > 混合法 > 酶解法）和定性估计（酶解法 > 混合法 > 机械法）中的表现顺序不同。尽管混合法在定量和定性估计中均未产生最高值，但在两种情况下，其结果在统计学上与表现最佳的提取方法相近（图1，表2），因此在所测试的三种提取方法中，混合法提供了最佳的定性与定量细菌总群落估计组合。需要注意的是，DNA提取方法可显著影响细菌群落谱型，本研究结果（图2，表1）以及以往使用环境样品的多项研究均表明了这一点4,5,8,9,11,12，这些差异性影响可能显著干扰研究数据的分析与解释。鉴于此，研究人员必须根据样品类型和实验目标，在每一项研究中慎重选择合适的DNA提取方法。

新型杂交方法有效性的关键步骤是强有力的均质化处理，该步骤不仅有助于从复杂的...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢 Latoya Wiggins 和 Katelyn Griffin 在样品采集方面的协助，同时感谢 Laura Lee Rutherford 在采样和分子分析方面的帮助。我们还要感谢阿贡国家实验室的 Sarah Owens 在微生物组样品制备与测序方面提供的支持。本研究得到了美国农业部农业研究局（Agricultural Research Service）CRIS 项目“禽类加工系统中的病原体减除与加工参数”（项目编号 #6612-41420-017-00）和“禽类食品中食源性病原体的分子表征方法”（项目编号 #6612-32000-059-00）的同等支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
裂解矩阵 E 管MPBio6914-050提供不同规格，目录号后三位数字表示数量（-050 = 50 支，-200 = 200 支，-1000 = 1,000 支）
磷酸钠溶液MPBio6570-205可单独购买，也包含在 FastDNA Spin Kit for feces（目录号 116570200）中
PLS 缓冲液MPBio6570-201
ASL 缓冲液（560 ml）Qiagen19082
FastPrep 24 匀浆仪MPBio116004500可选配 48 x 2 ml HiPrep 适配器（目录号 116002527），使机械匀浆步骤通量翻倍
QIAamp DNA Stool Mini KitQiagen51504
QIAcube24（110V）Qiagen9001292初步结果显示 QIAcube HT（目录号 9001793）也可用于提高通量，但需使用不同的耗材，尚需进一步对比研究
滤芯吸头，1,000 µl（1024 支）Qiagen990352
滤芯吸头，200 µl（1024 支）Qiagen990332
QIAcube 转子适配器（10 x 24）Qiagen990394转子适配器套件中包含的 1.5 ml 微量离心管有替代选项。  替代品为 Sarstedt Micro tube 1.5 ml Safety Cap，目录号 72.690
样本管 RB（2 ml）Qiagen990381替代品：Eppendorf Safe-Lok 微量管，目录号 022363352

参考文献

  1. Maukonen, J., Simoes, C., Saarela, M. The currently used commercial DNA-extraction methods give different results of clostridial and actinobacterial populations derived from human fecal samples. FEMS microbiology ecology. 79, 697-708 (2012).
  2. Tang, J. N., et al. An effective method for isolation of DNA from pig faeces and comparison of five different methods. Journal of microbiological. 75, 432-436 (2008).
  3. McOrist, A. L., Jackson, M., Bird, A. R. A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from human faecal samples. Journal of microbiological. 50, 131-139 (2002).
  4. Ariefdjohan, M. W., Savaiano, D. A., Nakatsu, C. H. Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens. Nutrition journal. 9, 23(2010).
  5. Carrigg, C., Rice, O., Kavanagh, S., Collins, G., O'Flaherty, V. DNA extraction method affects microbial community profiles from soils and sediment. Applied microbiology and biotechnology. 77, 955-964 (2007).
  6. Smith, B., Li, N., Andersen, A. S., Slotved, H. C., Krogfelt, K. A. Optimising Bacterial DNA Extraction from Faecal Samples: Comparison of Three Methods. The Open microbiology journal. 5, 14-17 (2011).
  7. Claassen, S., et al. A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction kits for extraction of DNA from faecal samples. Journal of microbiological. 94, 103-110 (2013).
  8. Scupham, A. J., Jones, J. A., Wesley, I. V. Comparison of DNA extraction methods for analysis of turkey cecal microbiota. Journal of applied microbiology. 102, 401-409 (2007).
  9. Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of microbiological methods. 81, 127-134 (2010).
  10. Peng, X., et al. Comparison of direct boiling method with commercial kits for extracting fecal microbiome DNA by Illumina sequencing of 16S rRNA tags. Journal of microbiological. 95, 455-462 (2013).
  11. Yuan, S., Cohen, D. B., Ravel, J., Abdo, Z., Forney, L. J. Evaluation of methods for the extraction and purification of DNA from the human microbiome. PloS one. 7, 33865(2012).
  12. Qu, A., et al. Comparative Metagenomics Reveals Host Specific Metavirulomes and Horizontal Gene Transfer Elements in the Chicken Cecum Microbiome. PloS one. 3, 2945(2008).
  13. Sekelja, M., et al. Abrupt temporal fluctuations in the chicken fecal microbiota are explained by its gastrointestinal origin. Applied and environmental microbiology. 78, 2941-2948 (2012).
  14. Oakley, B. B., et al. The Poultry-Associated Microbiome: Network Analysis and Farm-to-Fork Characterizations. PloS one. 8, 57190(2013).
  15. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Eiteman, M. A., Lovanh, N., Sistani, K. Evaluation of nitrogen retention and microbial populations in poultry litter treated with chemical, biological or adsorbent amendments. Journal of environmental management. 92, 1760-1766 (2011).
  16. Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Eiteman, M. A., Sistani, K. Microbial mineralization of organic nitrogen forms in poultry litters. Journal of environmental quality. 39, 1848-1857 (2010).
  17. Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Sistani, K. The effect of alum addition on microbial communities in poultry litter. Poultry science. 87, 1493-1503 (2008).
  18. Li, M., et al. Evaluation of QIAamp DNA Stool Mini Kit for ecological studies of gut microbiota. Journal of microbiological. 54, 13-20 (2003).
  19. Dridi, B., Henry, M., El Khechine, A., Raoult, D., Drancourt, M. High precalence of Methanobrevibacter smithii and Methanosphaera stadtmanae detected in the human gut using an improved DNA detection protocol. PloS one. 4, 7063(2009).
  20. Harms, G., et al. Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant. Environmental science and technology. 37, 343-351 (2003).
  21. Rothrock, M. J. Comparison of microvolume DNA quantification methods for use with volume-sensitive environmental DNA extracts. Journal of natural and environmental sciences. 2, 34-38 (2011).
  22. Navas-Molina, J. A., et al. Methods in Enzymology. DeLong Edward, F. 531, Academic Press. 371-444 (2013).
  23. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).
  24. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 Suppl 1, 4516-4522 (2011).
  25. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature methods. 7, 335-336 (2010).
  26. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27, 2194-2200 (2011).
  27. Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26, 2460-2461 (2010).
  28. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
  29. Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26, 266-267 (2010).
  30. Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2–approximately maximum-likelihood trees for large alignments. PloS one. 5, 9490(2010).
  31. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Lovanh, N., Sorrell, J. K., Loughrin, J. H. Spatial and temporal changes in the microbial community in an anaerobic swine waste treatment lagoon. Anaerobe. 16, 74-82 (2010).
  32. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Warren, J. G., Sistani, K. R., Moore, P. A. Effect of alum treatment on the concentration of total and ureolytic microorganisms in poultry litter. Journal of environmental quality. 37, 2360-2367 (2008).
  33. Lovanh, N., Cook, K. L., Rothrock, M. J., Miles, D. M., Sistani, K. Spatial shifts in microbial population structure within poultry litter associated with physicochemical properties. Poultry science. 86, 1840-1849 (2007).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

机械匀浆酶法提取珠磨破碎机器人工作站PCR抑制物去除16S rRNA qPCR微生物组分析家禽粪便样本环境样本处理
一种用于家禽生产样品中细菌群落定性与定量评估的混合DNA提取方法
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。