一种混合DNA提取方法细菌群落的定性和定量评估，从家禽生产样品

摘要

开发了一种用于环境家禽生产样品的新型半自动杂交 DNA 提取方法，并在总细菌群落的定量和定性估计方面证明了对普通机械和酶提取方法的改进。

摘要

的DNA提取协议的功效可以是高度依赖于样品被调查的的类型和执行的下游分析的类型。考虑到采用新的细菌群落分析技术（ 例如，microbiomics，宏基因组学）越来越流行在这些学科范围内的农业和环境科学等诸多环境样品可能是生理化学和微生物学的独特（ 如粪便和垫料/寝具样本家禽生产谱），适当和有效的DNA提取方法需要慎重选择。因此，一种新型的半自动混合DNA提取方法与环境家禽生产样品使用专门开发的。该方法是DNA提取的两种主要类型的组合：机械和酶。两步强烈的机械同质化的步骤（使用珠跳动专门针对环境下制定TAL样本）加入到“金标准”的酶的DNA提取方法的开始的粪便样品来增强去除细菌和DNA从样品基质和改善革兰氏阳性细菌的社区成员的恢复。一旦混合方法的酶法提取部分开始，剩下的净化过程是使用机器人工作站，以增加样品通量，降低样加工误差的自动化。在比较严格的机械和酶的DNA提取方法，这种新的混合方法加工的家禽粪便和垃圾样品时，考虑提供定量时（使用16S rRNA基因定量PCR）和定性（使用microbiomics）的总细菌群落的估计最佳的整体性能相结合。

引言

在分析复杂的临床或环境样本（例如粪便、土壤）时，有两种主要方法用于提取 DNA。第一种是使用强烈的磁珠跳动步骤对基质进行机械破碎，而第二种是对基质进行酶促破碎，以化学方式释放细菌细胞并同时抑制基质中的 PCR 抑制剂。鉴于这两种类型的提取方法工作方式不同，因此以前的研究表明，合适的 DNA 提取方法高度依赖于样品和分析也就不足为奇了。先前的比较 DNA 提取研究表明，一些方法更适合提高环境样本^1-3 的 DNA 质量和数量，而其他方法则证明了对群落水平分析的改进，例如变性梯度凝胶电泳 （DGGE）^4-6、末端限制性片段长度多态性 （T-RFLP）⁷、自动核糖体基因间间隔区分析 （ARISA）⁸ 和系统发育微阵列⁹.因此，需要根据环境样本的类型和对这些样本进行的分析类型，特别是考虑到细菌群落分析的最新进展，使用或开发适当的 DNA 提取方法。

下一代测序与更定量的群落评估（例如定量 PCR （qPCR））相结合，在环境和临床科学中变得越来越普遍，然而，很少有研究来确定 DNA 提取方法对这些数据集的影响。大多数 DNA 提取比较研究涉及来自人类或人类模型样本的微生物组群落估计^{10,11，而不是}农业动物样本。少数以家禽为重点的下一代测序研究涉及特定的宏基因组学^12,13 或微生物组学¹⁴ 问题;他们没有讨论 DNA 提取方法对所得微生物组学分析的影响。考虑到与家禽生产相关的环境样品（例如粪便、垫料/垫料、牧场土壤）的复杂性，需要仔细选择 DNA 提取方法。已知家禽相关环境样品含有大量 PCR 抑制剂，PCR 和后续下游分析需要高达 500 倍的 DNA 提取物稀释液^15-17。因此，必须针对这些类型的样品优化 DNA 提取方法，以便不仅物理破坏基质，而且能够减少/消除存在的大量抑制剂。

QIAamp DNA Stool Mini Kit是一种酶法提取方法，被认为是从困难的肠道/粪便样本中提取DNA的"金标准"^1,18,19，并已成功应用于家禽环境样本^8,14。通过使用专有基质酶促去除 PCR 抑制剂是该方法对这些类型的环境样品使用的最大优势之一，使用自动化工作站能够显著提高通量（并减少样品处理误差）。一个主要缺点是缺乏机械匀浆步骤来物理分离细菌细胞与环境基质。在检测非家禽来源的肠道和粪便样本时，在 DNA 提取方案中增加磁珠打碎或机械破碎步骤可显著提高提取效率⁹、DNA 产量/质量^1,4,5，并显著改善下游群落分析的丰富度、多样性和覆盖度^5,6,11.这些研究不仅将机械打珠方法与"金标准"酶法进行了比较，而且有些研究还将机械打珠步骤添加到酶法方案中以改善结果^6,9,11。

根据上述研究的结果，通过在酶法中增加机械均质化步骤，可以从家禽相关环境样品中改进细菌群落分析（定性和定量）。因此，本研究的目标有两个：（1） 开发一种新的 DNA 提取技术，该技术利用机械（强大的均质化步骤）和酶（PCR 抑制剂去除和自动化）提取方法的最理想的方面，以及 （2） 将这种新方法的定量（通过 qPCR）和定性（通过微生物组学）细菌群落评估与代表性的机械和酶方法进行比较。

方案

环境家禽生产样品1.机械同质化

1. 在提取之前，设定一水浴中以95℃，并让水浴时间达到该温度。
2. 称出0.33克土壤或粪便物质的到2ml裂解矩阵E管。
   1. 不超过0.33克在管样品的，因为这会导致以下的解决方案，以超过所述管的容量。
   2. 解冻冷冻样品RT之前称重。
   3. 为了共1克土壤/粪便进行分析，称出3复制0.33克样本为每个单独的环境样本。
   4. 商店样品在萃取前-20℃圆锥形基质管内，如果需要的话。
3. 添加825微升磷酸钠缓冲液和275微升的PLS溶液到样品管中。混合使用涡旋为〜15秒，然后离心样品在14000×g离心5分钟。
4. 倒出superna坦并加入700μlBuffer ASL的。混合使用涡旋5秒。
   1. 确保有顶部空间（〜10％总体积）在锥形管可用在这一点上。如果没有顶部空间，该管将有一种倾向在接下来的均化步骤可能导致交叉污染和/或样品损失泄漏。
5. 将样品成FastPrep 24仪器，并且使样品均质化，在6.0米/秒，40秒的速度。
6. 离心匀浆样品在14000×g离心5分钟。将上清液转移到一个无菌的2ml微量管中。
7. 为了最大限度地提高来自样品的DNA回收率，重复步骤1.4至1.6，将上清液合并到同一无菌，加入2ml微量离心管中。

从样品匀浆抑制剂2.酶抑制

注：此协议使用的QIAamp DNA凳子套件。

1. 孵育上清液在95℃水浴中5分钟，以最大化从上清液内的任何剩余的细胞中的DNA的恢复。
   1. 孵育在70℃下对含有大部分革兰氏阴性生物体的样本。然而，如果革兰氏阳性生物体存在（这是与家禽粪便样品的情况下），孵育在95℃。
   2. 使用在离心管塑料锁定夹以确保该管不会“弹出”开放式和可能丢失的样品体积作为压力可以在这些密封的离心管中建立起来的。
2. 打开每个微量离心管中以释放压力，再盖的微量离心管，并混合使用涡旋15秒。
3. 离心样品以14000×g离心1分钟，取出1.2上清液毫升，并将其放置到一个新的无菌的2ml微量管中。
4. 加1 InhibitEx标签到每个样品中，并混合使用涡旋直到样品变得均匀白色/灰白色液体。
   1. 避免吨ouching所述InhibitEx标签而将其放入装有样品的离心管中。要做到这一点，将直接包含的标签在开放的离心管的泡罩包装，轻轻推离卡的泡罩包装，并移入离心管中。
5. 孵育在室温（〜25℃）的样品1分钟，离心机在14000×g离心5分钟。
6. 所有的液体转移到一个无菌的1.5 ml离心管和离心机在14000×g离心5分钟。
   1. 避免传输液体时可能已沉淀在离心管的底部，在步骤2.5的末端任何剩余的颗粒。

使用QIAcube工作站机器人工作站3.自动化DNA纯化

注：塑料消耗品的数量，在离心机内的样本转子适配器的结构中，和缓冲器/溶液的所需体积依赖于NUMBER是正在运行的样品。

1. 加入洗脱管和过滤管的转子适配器中的适当插槽。对于每个样品，加入400微升至转子适配器的中间槽。根据被纯化的样本数将转子适配器在工作站离心机在正确安排。
   1. 确保所有的离心管盖子被正确地固定在转子适配器中因为不这样做可能会导致在的离心步骤的纯化方案之一剪切。
2. 加入1000微升和200微升过滤提示所需数量的工作站，并填写所提供的缓冲瓶缓冲所需音量。
   注意：需要这种纯化方案（AL，AW1，AW2，和AE）的缓冲器都包含所述的QIAamp DNA粪便Mini试剂盒之内。用户需要提供所需要的AW BU的100％的乙醇ffers并且如在纯化过程中所用的溶液。
3. 添加提供的蛋白酶K的解决方案所需要的量进入无菌1.5 ml离心管，并将其放置到工作站上插槽A。此外，添加所需数量（等于样本的数量被净化）2毫升安全锁的离心样品管的RB到工作站的摇床截面。
   1. 保证样品管的盖子被安全地放置在工作站上的相应插槽中，因为不这样做将导致一个错误，当机器开始扫描工作站，以确保所有需要的塑料和液体可用于要求运行。
4. 使用触摸屏的工作站上，选择DNA凳 - 人类凳 - 病原体检测协议，并通过后续屏幕阅读，以确保工作站被正确加载。一旦所有的检查屏幕被传递，选择开始运行这个协议。
   1. 如果从超过12个样品中提取DNA，开始均质化处理（步骤1）为下一个组样品中，由于12个样本的运行花费〜72分钟，以完成在工作站上。
5. 从转子适配器在-20℃，直到需要用于后续下游分析取出样品，帽他们，和地点。
   1. 在这一点上，结合了3个重复纯化用于使用离心分离/蒸发为基础的系统的个体的样品（总分析量= 1克）。结合的重复和重新洗脱至100微升的Tris-ETDA缓冲器的最终体积。

结果

在这项研究中，新鲜的粪便排泄物和垃圾样品从商业肉鸡舍（〜25000鸟）在美国东南部恢复。肉鸡（ 鸡内金 ）是柯布-500十字架，他们分别为59日龄，在采样的时间。新鲜的粪便和垃圾样本来自四个不同的区域恢复的房子内（靠近散热垫，附近的饮水器/馈线，在饮水器/馈线之间，靠近排风扇），并从这些地区的样本中含有5汇集样品从该区域内。从房子的四个方面的样本中提取定量/定性分别根据样品类型（粪便或枯枝落叶）进行分析。下面呈现的数据表示为整个房子两种环境样品类型的平均值。

总16S rDNA的丰度，包含在样品中的总细菌群落的估计，用先前公布确定编的qPCR协议^20，和值使用的DNA的量从每一提取方法回收标准化（基于荧光分析先前²¹描述三种提取方法中， 图1示出了机械的方法提供一致的最高总细菌归基因丰估计双方的粪便和垃圾样本（5.85±0.16和5.56±0.08日志₁₀ 16S rDNA的副本纳克^-1 DNA提取，分别）;而酶法一直提供最低的粪便和垫料的估计...

讨论

所使用的DNA提取方法影响的定量和定性的总细菌群落估计为粪便和垃圾样本，配套样品分析的DNA提取方法依赖性质^1,3,6以前见过。对于这两种粪便和垃圾样本的DNA提取方法的性能订的是定量（机械>混合>酶）和质（酶>混合>机械）总细菌群落的估计不同。而混合方法没有产生最高定量或定性的估计，在两种情况下，混合方法产生的统计学相似性能最高的提取方法（ 图1，表2），由此产生的定性和定量的总的最佳组合的结果三种提取方法的细菌群落估计测试。应NE指出，细菌群落PROFILES可以通过DNA提取方法的强烈影响，如在此研究（ 图2，表1），并使用环境样品^{4,5,8,9,11,12}其他先前的研究结果可以看出，这些不同影响可能强烈影响的研究数据的分析和解释。认识到这一点，研究人员必须认真考虑适当的提取方法为他们的样品类型和实验目标的一项研究，通过学习基础。

一个关键步骤的新颖的混合方法的有效性是强大的均化步骤中，不仅大大地帮助细菌细胞的释放从复粪便/土壤基质，也能分解...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
裂解矩阵 E 管	MPBio	6914-050	提供不同尺寸和猫的最后 3 个数字。不。标示尺寸（-050 = 50 管，-200 = 200 管，-1000 = 1,000 管）
磷酸钠溶液	MPBio	6570-205	可以单独购买，也可以包含在粪便的 FastDNA 离心试剂盒中（货号。编号 116570200）
PLS 缓冲液	MPBio	6570-201
缓冲液 ASL （560 ml）	Qiagen	19082
FastPrep 24 均质器	MPBio	116004500	48 x 2 ml HiPrep 适配器（货号编号 116002527） 可用于机械匀浆步骤的双通量
QIAamp DNA 大便 Mini Kit	Qiagen	51504
QIAcube24 （110V）	Qiagen	9001292	初步结果显示，QIAcube HT （Cat.否，9001793） 可用于提高吞吐量，但该机器需要不同的耗材，并且需要做更多的比较工作。
滤芯吸头，1,000 ml （1024）	Qiagen	990352
滤芯吸头，200 ml （1024）	Qiagen	990332
QIAcube 转头适配器 （10 x 24）	Qiagen	990394	对于转子适配器套件中包含的 1.5 ml 微量离心管，有另一种选择。它是 Sarstedt 微型管 1.5 ml 安全帽，货号。No. 72.690
样品管 RB （2 ml）	Qiagen	990381	替代品： Eppendorf Safe-Lok 微量试管，货号022363352号