本文描述了一种利用原子力显微镜（AFM）研究蛋白质光感受器结构的方法。峰值力定量纳米力学性能成像（PF-QNM）可揭示云母表面完整存在的蛋白质二聚体。
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摘要
摘要
原子力显微镜（AFM）利用连接在悬臂上的锥形探针来探测表面的力学响应。通过激光和四象限检测器可测量探针的偏转，精度可达约10 pN，这些数据可被转换为表面形貌图像。振幅调制或“轻敲模式”AFM是指探针在以其共振频率振荡的同时间歇性地接触表面，从而生成图像。当与液体池联用时，轻敲模式AFM能够在生理相关条件下对蛋白质等生物大分子进行成像。轻敲模式AFM需要手动调节探针，并频繁调整大量扫描参数，这对缺乏经验的用户而言可能具有挑战性。为了获得高质量的图像，这些调整过程最为耗时。
PeakForce定量纳米力学性能成像（PF-QNM）通过测量探针与样品每个接触点的力响应曲线来生成图像。借助ScanAsyst软件，PF-QNM可实现自动化。该软件可根据特定样品自动调节设定点、驱动频率、扫描速率、增益以及其他关键扫描参数。这一过程不仅能保护脆弱的探针和样品，还显著缩短了获得高分辨率图像所需的时间。PF-QNM适用于液体环境中的原子力显微镜（AFM）成像，因此在生物相关材料的成像方面具有广泛应用。
本文所述方法介绍了利用PF-QNM技术获取光合类球红细菌（R. palustris）中细菌红光光感受器RpBphP3（P3）在光适应状态下的成像结果。通过该方法，可在云母表面的成像缓冲液环境中观察到P3蛋白单个二聚体以及二聚体的聚集体。通过适当调整样品表面或溶液浓度，该方法可广泛适用于其他具有生物学意义的大分子及软物质材料。
引言
自1986年发明以来，原子力显微镜（AFM）已成为研究表面、薄膜和单个分子结构与力学性质的重要工具（图1）1-3。通过使用液体池，该方法在生理相关环境中研究生物大分子甚至活细胞方面变得尤为有用4-10。由于接触模式AFM中悬臂对样品施加的侧向力会造成损伤，因此通常不适用于软材料或表面结合较弱的分子的成像；而轻敲模式AFM则通过探针间歇性地接触表面而非持续接触，显著降低了这些作用力11。在此模式下，悬臂在其共振频率或接近共振频率下垂直于表面振荡。与接触模式AFM类似，形貌信息通过绘制z轴压电陶瓷在xy平面（距离）上的运动变化来分析。
悬臂梁在共振时或接近共振时的动力学特性可能非常不稳定，因此在非“稳态”情况下实现自动化极为困难。具体而言，这些动力学特性同时依赖于样品性质和扫描环境。对于吸附在较硬表面上的软分子，针对分子优化的反馈回路可能导致在表面上出现反馈振荡。在液体中操作会进一步增加悬臂梁调谐的复杂性。温度或液面的变化需要持续重新调整设定点、增益及其他成像参数。这些调整通常对用户而言非常耗时且具有挑战性。
峰值力定量纳米力学性能成像（PF-QNM）与轻敲模式原子力显微镜（AFM）类似，通过间歇性接触样品来避免侧向相互作用（图2）。12-15 然而，PF-QNM 在非共....
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方案
1. 计算机与显微镜的设置
- 打开氮气阀门2 调节气浮台的旋钮，确保气浮台平稳悬浮并处于水平状态。
- 依次打开计算机、控制器和光纤光源。
- 将扫描仪设置为AFM/LFM模式，并将摄像头对准AFM探头中心。
- 打开软件，选择实验组别中的“纳米力学性能”类别，实验类型选择“定量纳米力学映射”，具体实验方法选择“液体中的峰值力定量纳米力学模式”。点击加载实验，然后点击设置。
- 使用Z轴物镜对焦相机，以观察载物台表面。利用粗调上下压电装置，将载物台移动至原子力显微镜（AFM）探头孔径表面下方约1 mm处。
2. 云母表面的制备
- 将一张粘性贴纸按压到洁净样品支撑盘（直径 15 mm，厚度 0.8 mm）的表面。将云母 V-4 级盘（25 × 25 × 26 mm）压到粘性贴纸上，直至牢固粘合。
- 用一段透明胶带贴紧云母表面，确保完全贴合且无气泡。从一侧将胶带撕下，使云母均匀解理。如有必要，重复此步骤以确保云母表面平整。
- 用一对圆形镊子（盘片夹持器）夹住支撑盘，使洁净的云母面朝上，然后将其放置到扫描器上。云母应低于原子力显微镜（AFM）探头孔径的水平位置。
3. 流体池组装及云母表面成像
- 用100%乙醇冲洗....
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结果
光适应状态下光感受器蛋白P3的代表性原子力显微镜图像如下所示 图3 和 4. 新鲜裂解的云母基底（图3A云母表面平整，适合用于蛋白质吸附。采集洁净云母的图像作为阴性对照具有多重重要意义。首先，这可确保液体池清洁，避免先前实验残留物污染样品表面。其次，该步骤可用于检测探针质量；若探针被污染或发生形变，图像中将出现条纹或表现为噪声。最后，洁净云母图像可确认探针能够被适当调谐，以满足后续实验的要求。
如果表面覆盖率合适，可以使用PeakForce QNM观察到单个光感受器蛋白二聚体（图3B,C）。箭头指示单个二聚体；星号表示蛋白聚集体。蛋白样品的浓度、沉积时间以及成像缓冲液的离子强度均会影响表面覆盖率23。为了获得高比例的单分子分布，需要使用极稀的溶液并缩短沉积时间。例如，将沉积时间延长一倍会导致更大聚集体的分布显著增加。如果将蛋白浓度提高至0.100 mg/ml，则无需改变沉积时间或缓冲液离子强度，即可观察到一层光感受器薄膜。
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讨论
原子力显微镜（AFM）是一种扫描探针显微技术，完全能够在生理相关条件下对蛋白质及其他生物大分子进行成像。与X射线晶体学和核磁共振（NMR）相比，AFM的一个局限性在于其难以达到同等的分辨率，尤其是横向分辨率。当使用AFM分析任意表面上的分子时，在数据分析过程中还必须考虑表面和探针对分子成像结果的影响。通过适当的软件可完成对探针影响所导致图像失真的去卷积处理。建立理论模型以与实验结果进行比较也具有重要价值。
本文展示了细菌远红光光感受蛋白 RpBphP3（P3）的原子力显微镜（AFM）图像（图3）。尽管显微镜组装和软件操作的描述针对所使用的特定仪器型号，但云母片和蛋白质样品的制备步骤具有通用性，可应用于任何AFM实验。
为了在云母表面获得理想的蛋白质覆盖度，本实验方案中有几个关键步骤必须严格遵守。首先，在将稀释后的蛋白质溶液施加到云母表面之前，必须轻轻混匀（步骤 4.3）。由于 P3 的分子量较高，其沉积溶液具有较强的胶体性质，因此随着时间推移，P3 会沉降到管.......
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披露
不存在相互竞争的经济利益或利益冲突。
致谢
感谢 NSF-MRI 项目（CHE：1229103）资助购买了组装双模式原子力显微镜/扫描隧道显微镜（AFM/STM）所需的新控制电子设备、软件、液体池及其他设备。感谢芝加哥大学 NSF-MRSEC 项目（DMR-0820054）的共享设施在原子力显微镜仪器使用、培训和成像方面提供的支持， 以及材料研究设施网络（DMR-0820054）提供的仪器使用时间。我们特别感谢郭启题博士、贾斯汀·朱雷勒博士和李嘉仪教授在 NSF-MRI 项目资助到位之前即允许我们的学生使用相关仪器设备。感谢北伊利诺伊大学获得的美国教育部第三类 STEM 拨款（编号：P031C110157），该拨款为学生和教师提供了暑期研究津贴，并资助了耗材的采购。最后，感谢布鲁克-纳米公司（Bruker-Nano, Inc.）持续提供的仪器支持，以及允许我们复制展示 PeakForce QNM 工作机制的图表，并使用术语 ScanAsyst 来描述其自动化软件。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Tris-HCl | 费舍尔科技 | O4997-100 | |
| NaCl | Acros Organics | 7647-14-5 | |
| MgCl2 | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| 多模式 8 型原子力显微镜（Multimode 8 AFM） | Bruker-Nano | 492-008-011 | 配备 Nanoscope V 控制器和 J 型扫描器 |
| 探针 | Bruker-Nano | SNL-10, ScanAsyst-Fluid+ | |
| 轻敲模式液体池（Tapping Mode Fluid Cell） | Bruker-Nano | MTFML | |
| 云母 V-4 级 | SPI supplies | 1150503 | 25 x 25 x 0.26 mm |
| 样品支撑圆盘 | nanoSurf | BT02236 | |
| 培养皿 | Plasta-Medic, Inc. | 100 mm x 15 mm | |
| 微量移液器 | Denville Scientific | XL 3000i | |
| RpBphP3 | 根据引用文献方法制备 | ||
| Nanoscope 软件 | Bruker-Nano | ||
| 光纤光源 | Digital Instruments Inc. | F0-50 | |
| Pelco 原子力显微镜圆盘夹钳 | Ted Pella Inc | 1668 | 12 mm |
| 1 ml 注射器 | McKesson | 102-ST1C | |
| Eppendorf 管 | Denville Scientific | C2171 | |
| Pymol 分子图像系统 v.1.5.0.1 | Schrodinger, LLC |
参考文献
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, Available from: http://dx.doi.org/10.1103/PhysRevLett.56.930 930-933 (1986).
- Sonnenfeld, R., Hansma, P. K. Atomic-Resolution Microscopy in Water Science. 232, 211-213 (19....
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重印与许可
