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方法文章

使用峰值力定量纳米力学性能成像对红光光感受器进行原子力显微镜观察

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DOI：

10.3791/52164

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2014年10月24日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Northeastern Illinois University, 2Department of Chemistry, Northeastern Illinois University

本文内容

摘要

本文描述了一种利用原子力显微镜（AFM）研究蛋白质光感受器结构的方法。峰值力定量纳米力学性能成像（PF-QNM）可揭示云母表面完整存在的蛋白质二聚体。

摘要

原子力显微镜（AFM）利用连接在悬臂上的锥形探针来探测表面的力学响应。通过激光和四象限检测器可测量探针的偏转，精度可达约10 pN，这些数据可被转换为表面形貌图像。振幅调制或“轻敲模式”AFM是指探针在以其共振频率振荡的同时间歇性地接触表面，从而生成图像。当与液体池联用时，轻敲模式AFM能够在生理相关条件下对蛋白质等生物大分子进行成像。轻敲模式AFM需要手动调节探针，并频繁调整大量扫描参数，这对缺乏经验的用户而言可能具有挑战性。为了获得高质量的图像，这些调整过程最为耗时。

PeakForce定量纳米力学性能成像（PF-QNM）通过测量探针与样品每个接触点的力响应曲线来生成图像。借助ScanAsyst软件，PF-QNM可实现自动化。该软件可根据特定样品自动调节设定点、驱动频率、扫描速率、增益以及其他关键扫描参数。这一过程不仅能保护脆弱的探针和样品，还显著缩短了获得高分辨率图像所需的时间。PF-QNM适用于液体环境中的原子力显微镜（AFM）成像，因此在生物相关材料的成像方面具有广泛应用。

本文所述方法介绍了利用PF-QNM技术获取光合类球红细菌（R. palustris）中细菌红光光感受器RpBphP3（P3）在光适应状态下的成像结果。通过该方法，可在云母表面的成像缓冲液环境中观察到P3蛋白单个二聚体以及二聚体的聚集体。通过适当调整样品表面或溶液浓度，该方法可广泛适用于其他具有生物学意义的大分子及软物质材料。

引言

自1986年发明以来，原子力显微镜（AFM）已成为研究表面、薄膜和单个分子结构与力学性质的重要工具（图1）1-3。通过使用液体池，该方法在生理相关环境中研究生物大分子甚至活细胞方面变得尤为有用4-10。由于接触模式AFM中悬臂对样品施加的侧向力会造成损伤，因此通常不适用于软材料或表面结合较弱的分子的成像；而轻敲模式AFM则通过探针间歇性地接触表面而非持续接触，显著降低了这些作用力11。在此模式下，悬臂在其共振频率或接近共振频率下垂直于表面振荡。与接触模式AFM类似，形貌信息通过绘制z轴压电陶瓷在xy平面（距离）上的运动变化来分析。

悬臂梁在共振时或接近共振时的动力学特性可能非常不稳定，因此在非“稳态”情况下实现自动化极为困难。具体而言，这些动力学特性同时依赖于样品性质和扫描环境。对于吸附在较硬表面上的软分子，针对分子优化的反馈回路可能导致在表面上出现反馈振荡。在液体中操作会进一步增加悬臂梁调谐的复杂性。温度或液面的变化需要持续重新调整设定点、增益及其他成像参数。这些调整通常对用户而言非常耗时且具有挑战性。

峰值力定量纳米力学性能成像（PF-QNM）与轻敲模式原子力显微镜（AFM）类似，通过间歇性接触样品来避免侧向相互作用（图2）。12-15 然而，PF-QNM 在非共振模式下运行，其频率远低于轻敲模式 AFM。这消除了轻敲模式 AFM 中调谐参数的困难，尤其是在液体环境中这些困难更为显著的问题。在 PF-QNM 中，图像通过在每个接触点采集力响应曲线而获得。结合 ScanAsyst 软件15，扫描参数的调节可实现自动化，即使经验不足的操作者也能在数分钟内获得高分辨率图像。一旦用户对 AFM 操作更加熟悉，可随时选择禁用部分或全部自动参数，从而允许实验人员手动精细调节图像质量。自问世以来，PF-QNM 已被用于在亚分子水平上对细菌视紫红质（一种膜蛋白）及其他天然蛋白质进行成像。16-18 对于细菌视紫红质，其蛋白质柔韧性与X射线晶体结构之间存在直接相关性。12 PF-QNM 已被用于对活细胞进行高分辨率研究。19,20 此外，PF-QNM 数据揭示了红细胞膜内结构与力学性能之间的重要关联，这些关联对于细胞的完整性和功能至关重要。21

我们采用了扫描探针显微技术（SPM）22，包括原子力显微镜（AFM）23，来研究一类称为细菌光敏色素（bacteriophytochromes, BphPs）的红光感受蛋白的结构24,25。BphPs由一个光感应模块共价连接至一个信号效应模块（如组氨酸激酶，HK）构成26。光感应模块通常含有一个胆绿素发色团，其在吸收光子后发生结构转变，并通过一系列构象变化将信号传递至效应模块，最终导致整个蛋白的全局性构象改变24,27-29。基于这种转变，BphPs具有两种不同的光吸收状态：红光吸收态和远红光吸收态，分别记为Pr和Pfr。对于大多数BphPs而言，Pr是热力学稳定的、暗适应状态28。由于对这些蛋白的结构了解有限，Pr与Pfr之间光转换的分子机制尚未完全阐明。除了一项来自D. radiodurans的结构研究外30，所有已发表的此类蛋白X射线晶体学结构均处于暗适应状态，且缺乏效应结构域。完整的BphPs分子过大，难以通过核磁共振（NMR）进行有效研究，同时因其完整形式（尤其是光适应状态）极难结晶，故难以适用于X射线晶体学分析。近年来，BphPs已被改造为红外荧光蛋白标记物（IFP）31。对这些蛋白的结构表征将有助于更有效地设计IFP32-36。

本文的重点是介绍一种利用液相原子力显微镜结合PF-QNM技术对细菌光敏色素（BphPs）进行成像的方法。该方法通过研究光合细菌R. palustris来源的细菌光敏色素RpBphP3（P3）的光适应状态来加以演示。本文所展示的原子力显微镜方法是一种方便且直接的蛋白质及其他生物大分子成像手段。利用该方法，可在较短时间内获取单个分子的结构细节，类似于高等科学课程实验课的时间范围。通过测量截面轮廓并完成进一步的尺寸分析，实验数据可与有用的计算模型进行比较。37-42

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方案

1. 计算机与显微镜的设置

  1. 打开氮气阀门2 调节气浮台的旋钮，确保气浮台平稳悬浮并处于水平状态。
  2. 依次打开计算机、控制器和光纤光源。
  3. 将扫描仪设置为AFM/LFM模式，并将摄像头对准AFM探头中心。
  4. 打开软件，选择实验组别中的“纳米力学性能”类别，实验类型选择“定量纳米力学映射”，具体实验方法选择“液体中的峰值力定量纳米力学模式”。点击加载实验，然后点击设置。
  5. 使用Z轴物镜对焦相机，以观察载物台表面。利用粗调上下压电装置，将载物台移动至原子力显微镜（AFM）探头孔径表面下方约1 mm处。

2. 云母表面的制备

  1. 将一张粘性贴纸按压到洁净样品支撑盘（直径 15 mm，厚度 0.8 mm）的表面。将云母 V-4 级盘（25 × 25 × 26 mm）压到粘性贴纸上，直至牢固粘合。
  2. 用一段透明胶带贴紧云母表面，确保完全贴合且无气泡。从一侧将胶带撕下，使云母均匀解理。如有必要，重复此步骤以确保云母表面平整。
  3. 用一对圆形镊子（盘片夹持器）夹住支撑盘，使洁净的云母面朝上，然后将其放置到扫描器上。云母应低于原子力显微镜（AFM）探头孔径的水平位置。

3. 流体池组装及云母表面成像

  1. 用100%乙醇冲洗流体池、O型圈、注射器接头、软管接头和喷射软管。用去离子水冲洗流体池。让所有部件完全自然晾干。
  2. 将软管接头插入洁净流体池的端口。使用平头镊子轻轻将O型圈压入流体池的中心凹槽内。
  3. 轻压探针固定夹上的弹簧，并将其从针尖槽口方向转开。
  4. 用平头镊子夹住探针远离针尖的长端。将探针放入槽口中，使针尖朝向流体池中心。压紧弹簧，并调整固定夹以固定探针（图1B）。
  5. 检查原子力显微镜（AFM）上的夹具，确保其完全缩回（图1C）。
  6. 将流体池、O型圈和探针朝下放置在云母样品上。让流体池自然落在AFM的固定柱上。放下夹具以稳定流体池在载物台上的位置。按下显微镜的下降开关，直至目视观察到O型圈被牢固压缩在支撑盘与流体池之间。
  7. 观察显示器，调节粗调焦旋钮，使流体池顶部在屏幕上清晰可见。
  8. 使用X/Y调节旋钮和Z物镜调节显微镜，直至屏幕上清晰看到针尖图像。针尖呈金属金色三角形。使用显微镜上的压电下降杠杆将针尖移近样品表面。对准针尖的反射像，并注意实际悬臂与反射像之间的相对位置。此时两者应基本对齐，但尚未完全重合。
  9. 将注射器接头连接至无菌1 ml注射器。将喷射软管一端连接至注射器接头，另一端放入缓冲液容器中。将注射器活塞完全拉出。
  10. 将软管连接至流体池上的软管接头。轻压活塞，直至中心腔室完全充满液体。检查流体池内是否存在气泡。确认无液体从流体池泄漏至显微镜表面。将注射器置于一个抬高的稳固支撑物上。
  11. 通过摄像头画面和X/Y平移旋钮在屏幕上定位激光（一个弥散的红点）。使用激光移动控制旋钮，将激光对准针尖。
  12. 精细调节激光和反射镜控制旋钮，使显微镜上显示的总信号值最大化（数值 = 4 - 6）。
  13. 使用扫描头左后侧和左上方的旋钮调节四象限光电二极管的角度，使显微镜上显示的垂直和水平偏转尽可能接近零（± 0.1）。
  14. 在软件中选择采集选项。至少选择高度（前向扫描和反向扫描）、峰值力误差和形变。其他选项可根据用户需求，由实验人员根据所需的具体信息进行个性化设置。
  15. 在每个采集窗口中，将实时平面拟合（RT Plane Fit）设为“线”（line）；在高度窗口中，将离线平面拟合（OT Plane Fit）设为“无”（none）。若尚未设置，将X和Y偏移以及扫描角度设为零。
  16. 将扫描速率设为1 Hz，每行采样点数设为256，ScanAsyst自动控制设为“独立”（individual），ScanAsyst自动Z限位设为“关闭”（off）。将Z限位改为500 nm，扫描尺寸设为1 µm。
  17. 点击“engage”（开始接触）。此时针尖将接近样品表面。在接近过程中，观察屏幕左下角Z压电电压的变化。若针尖超出范围，需撤回针尖并重新接近。若仍不成功，可能需要更换针尖以实现成功接近。一旦针尖成功接触，各采集窗口中将开始出现构成图像的扫描线。
  18. 以1 × 1 µm范围对云母进行成像，并缓慢放大，确保云母表面清洁且平整。点击连续捕获以保存实时图像。根据需要放大并移动观察区域。

4. 蛋白质沉积及成像样品的制备

  1. 获取纯化的蛋白质样品38，并置于冰上保存。若样品储存在冷冻柜中，请在冰上解冻5分钟。
  2. 使用冷藏的成像缓冲液将蛋白质稀释至0.0010 mg/ml。此处使用的成像缓冲液为15 mM Tris-HCl（pH = 8.0）、150 mM NaCl和15 mM MgCl2。
  3. 用冷藏的成像缓冲液填充一个四室（100 × 15 mm）培养皿，每个腔室至少加入5 ml缓冲液。使用连接在微量移液器上的枪头轻轻混匀稀释后的蛋白质溶液。
  4. 将200 µl稀释后的蛋白质溶液滴加到已准备好的云母表面。30秒后，用圆形镊子（圆盘夹具）轻轻夹起蛋白质/云母样品，并使样品保持与实验台平行。
  5. 在保持样品与培养皿底部平行的前提下，立即将样品浸入培养皿第一象限中的缓冲液中（步骤4.2）。1秒后取出样品。
  6. 继续保持样品与培养皿底部平行，依次对剩余三个象限重复执行步骤4.5。
  7. 将圆盘放置于干燥无尘的布上以吸去多余水分，随后将圆盘转移至显微镜载物台上。切勿用布接触样品表面，且不得让样品干燥。
  8. 重复步骤3.6 - 3.16。

5. 在云母上成像蛋白质

  1. 点击屏幕左侧的“检查参数”框。弹簧常数和针尖半径应根据所用针尖进行设置。
  2. 点击“engage”（启动）。与云母成像过程（步骤 3.17）类似，观察压电陶瓷Z轴窗口中针尖的接近过程。
  3. 让扫描器对同一区域至少连续扫描两次。点击“连续采集”以保存每次获取的图像。
  4. 将扫描器移动到新区域，和/或根据需要更改图像尺寸。
  5. 当自动软件完成特定图像尺寸的扫描参数调整后，关闭该软件。
  6. 手动调节扫描速率、Z轴限位、扫描线数和电压，以精细调节图像焦点。如果图像严重失焦，重新开启软件以恢复至初始起始位置。在放大观察蛋白质时，若要提高图像分辨率，应降低扫描速率，并按比例增加扫描线数。
  7. 实验结束后，用100%乙醇清洗液体池，并用去离子水（DI H2O）冲洗。让液体池完全干燥。
  8. 打开数据处理软件以处理原始图像数据。首先点击“flatten”（平整化）图标对图像进行平整化处理。选择“Zeroth order”（零阶平整），然后点击执行。根据图像情况，可能需要进行平面拟合以获得合适的平整图像。此时，选择“plane fit”（平面拟合）图标，用光标在图像的平坦区域绘制一个平面，然后点击执行。如有必要，可重复此操作。
  9. 选择“截面”（cross-section）选项卡以测量蛋白质的尺寸。用光标画一条线，并将其移动到待分析的分子或区域上方。对多个区域重复此操作，软件将生成叠加图。将图像或用于生成图像的数据导出为与其他软件和绘图程序兼容的格式。

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结果

光适应状态下光感受器蛋白P3的代表性原子力显微镜图像如下所示 图3 和 4. 新鲜裂解的云母基底（图3A云母表面平整，适合用于蛋白质吸附。采集洁净云母的图像作为阴性对照具有多重重要意义。首先，这可确保液体池清洁，避免先前实验残留物污染样品表面。其次，该步骤可用于检测探针质量；若探针被污染或发生形变，图像中将出现条纹或表现为噪声。最后，洁净云母图像可确认探针能够被适当调谐，以满足后续实验的要求。

如果表面覆盖率合适，可以使用PeakForce QNM观察到单个光感受器蛋白二聚体（图3B,C）。箭头指示单个二聚体；星号表示蛋白聚集体。蛋白样品的浓度、沉积时间以及成像缓冲液的离子强度均会影响表面覆盖率23。为了获得高比例的单分子分布，需要使用极稀的溶液并缩短沉积时间。例如，将沉积时间延长一倍会导致更大聚集体的分布显著增加。如果将蛋白浓度提高至0.100 mg/ml，则无需改变沉积时间或缓冲液离子强度，即可观察到一层光感受器薄膜。

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讨论

原子力显微镜（AFM）是一种扫描探针显微技术，完全能够在生理相关条件下对蛋白质及其他生物大分子进行成像。与X射线晶体学和核磁共振（NMR）相比，AFM的一个局限性在于其难以达到同等的分辨率，尤其是横向分辨率。当使用AFM分析任意表面上的分子时，在数据分析过程中还必须考虑表面和探针对分子成像结果的影响。通过适当的软件可完成对探针影响所导致图像失真的去卷积处理。建立理论模型以与实验结果进行比较也具有重要价值。

本文展示了细菌远红光光感受蛋白 RpBphP3（P3）的原子力显微镜（AFM）图像（图3）。尽管显微镜组装和软件操作的描述针对所使用的特定仪器型号，但云母片和蛋白质样品的制备步骤具有通用性，可应用于任何AFM实验。

为了在云母表面获得理想的蛋白质覆盖度，本实验方案中有几个关键步骤必须严格遵守。首先，在将稀释后的蛋白质溶液施加到云母表面之前，必须轻轻混匀（步骤 4.3）。由于 P3 的分子量较高，其沉积溶液具有较强的胶体性质，因此随着时间推移，P3 会沉降到管...

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披露

不存在相互竞争的经济利益或利益冲突。

致谢

感谢 NSF-MRI 项目（CHE：1229103）资助购买了组装双模式原子力显微镜/扫描隧道显微镜（AFM/STM）所需的新控制电子设备、软件、液体池及其他设备。感谢芝加哥大学 NSF-MRSEC 项目（DMR-0820054）的共享设施在原子力显微镜仪器使用、培训和成像方面提供的支持， 以及材料研究设施网络（DMR-0820054）提供的仪器使用时间。我们特别感谢郭启题博士、贾斯汀·朱雷勒博士和李嘉仪教授在 NSF-MRI 项目资助到位之前即允许我们的学生使用相关仪器设备。感谢北伊利诺伊大学获得的美国教育部第三类 STEM 拨款（编号：P031C110157），该拨款为学生和教师提供了暑期研究津贴，并资助了耗材的采购。最后，感谢布鲁克-纳米公司（Bruker-Nano, Inc.）持续提供的仪器支持，以及允许我们复制展示 PeakForce QNM 工作机制的图表，并使用术语 ScanAsyst 来描述其自动化软件。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Tris-HCl费舍尔科技O4997-100
NaClAcros Organics7647-14-5
MgCl2Acros Organics7791-18-6
多模式 8 型原子力显微镜（Multimode 8 AFM）Bruker-Nano492-008-011配备 Nanoscope V 控制器和 J 型扫描器
探针Bruker-NanoSNL-10, ScanAsyst-Fluid+
轻敲模式液体池（Tapping Mode Fluid Cell）Bruker-NanoMTFML
云母 V-4 级SPI supplies115050325 x 25 x 0.26 mm
样品支撑圆盘nanoSurfBT02236
培养皿Plasta-Medic, Inc.100 mm x 15 mm 
微量移液器Denville ScientificXL 3000i
RpBphP3根据引用文献方法制备
Nanoscope 软件Bruker-Nano
光纤光源Digital Instruments Inc.F0-50
Pelco 原子力显微镜圆盘夹钳Ted Pella Inc166812 mm
1 ml 注射器McKesson102-ST1C
Eppendorf 管Denville ScientificC2171
Pymol 分子图像系统 v.1.5.0.1Schrodinger, LLC

参考文献

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