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方法文章

小鼠脂肪组织的定位、鉴定与切除

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DOI：

10.3791/52174

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2014年12月4日

 ,  ,  , 
1Department of Emergency Medicine, University of Cincinnati College of Medicine

本文内容

摘要

由于肥胖与其他共病之间存在显著且负面的关联，研究脂肪组织在疾病和整体健康中的作用具有重要意义。本文介绍了一种分离和切除脂肪组织库的实验方案，可用于通过原位（in situ）和体外（in vitro）方法对脂肪组织进行研究。

摘要

肥胖在过去几十年中显著增加，影响了超过三分之一的美国成年人口。仅在2005年，肥胖带来的直接医疗成本就高达1902亿美元，其经济影响极为巨大。肥胖是多种疾病的重要风险因素。历史上，人们对脂肪组织及其在体内的重要且基本功能知之甚少。白色脂肪和棕色脂肪是脂肪组织的两种主要类型，但目前的研究文献已确认了一种新型脂肪，称为米色脂肪或“brite”脂肪。研究表明，不同脂肪储存部位具有特定的代谢特征，某些脂肪库更易导致肥胖及相关疾病的发生。本实验方案的目标是为研究人员提供识别和切除脂肪组织库的能力，以便分析各种因素对脂肪组织的影响，以及脂肪在疾病和整体健康中所起的有益或有害作用。通过分离和切除脂肪组织库，研究人员可观察其宏观形态学变化及组织学变化。所分离的脂肪组织还可用于分子生物学研究，以评估转录和翻译水平的变化，或用于 体外 通过实验发现感兴趣靶点及作用机制。该技术由于设计上的优势，能够简便地分离多个储存部位，且污染极少，优于其他已发表的技术。

引言

由于20世纪后几十年肥胖症的急剧增加，脂肪组织受到了媒体的广泛关注。目前，肥胖症影响了美国超过三分之一的成年人以及17%的儿童和青少年1。涵盖所有种族群体的统计研究显示，在肥胖流行的相关数据中，非西班牙裔黑人的年龄校正后肥胖率最高（49.5%），高于墨西哥裔美国人（40.4%）、所有西班牙裔人群（39.1%）和非西班牙裔白人（34.3%）2。肥胖对经济的影响也日益成为医疗系统的重大关切。2012年的一项估算表明，2005年美国因肥胖产生的年度医疗费用高达1902亿美元，约占整体医疗支出预算的21%。令人遗憾的是，仅儿童肥胖就造成了约140亿美元的直接医疗成本。统计数据显示，患有肥胖症个体的平均年度医疗费用比无此疾病的个体高出2,741美元3-5。

肥胖是多种疾病的主要风险因素，例如：2型糖尿病、血脂异常、心血管疾病、癌症、肌肉骨骼系统疾病和慢性炎症。肥胖与代谢综合征及其他慢性疾病的发病机制密切相关6-8。鉴于肥胖与其他共病之间存在如此显著且负面的关联，科学研究已将重点放在更深入地理解当前这一流行状况，以及脂肪组织在其中所发挥的多种关键作用上。

传统上，脂肪组织被认为无关紧要，仅被视为一种简单的填充组织。目前研究表明，脂肪组织在机体功能中发挥着多种重要作用，包括代谢、激素调节、炎症反应、保护和保温9。脂肪组织主要由脂肪细胞构成，同时也含有周细胞、内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞以及多能干细胞8。脂肪组织在体内以不同的脂肪库形式分布，主要脂肪库位于皮下、真皮下、肌内以及内脏周围10。研究显示，不同脂肪库具有特异性的代谢特征，对肥胖及相关疾病也表现出脂肪库特异性的易感性8。

传统上，脂肪组织被分为两大类：白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）；尽管近期文献表明还存在第三类，被称为“米色”或“ beige”脂肪组织11。研究表明，脂肪组织在颜色、形态、代谢功能、生化特征以及基因表达模式方面均存在差异10。WAT中的脂肪细胞含有一个单一且较大的脂滴，线粒体数量可变。WAT主要分布于皮下和内脏部位。其主要功能是储存能量并保护器官。BAT中的脂肪细胞具有多房结构，并富含线粒体。BAT主要位于颈部、胸腔大血管周围以及肩胛区域12。BAT的主要功能是通过耗能行为调节产热7。研究表明，米色或beige脂肪组织在形态和表达特征上与BAT相似，但其起源于白色脂肪细胞11。

本文所述的手术方法使研究人员能够分析环境、药物和遗传等因素对脂肪组织的影响，以及脂肪组织在疾病和整体健康中所起的有益或有害作用。同时，该方法提供了一种识别和分离不同类型脂肪组织的途径，有助于更深入地理解不同脂肪储存部位之间的生化关系与差异，从而帮助明确体内脂肪的位置、功能与类型之间的关联。该方法通过实现大体观察、基因表达分析、蛋白质表达分析、组织学检查以及原代细胞系的分离，为上述研究提供了技术支持。 体外 研究。目前已有大量文章阐述了不同脂肪组织库的代谢行为及其解剖位置，但并未提供如何准确定位、识别和分离这些脂肪组织库的详细方法。本手术方法提供了一种精确的技术，相较于其他仅针对一两个脂肪库分离的方法，能够在解剖和污染最少的情况下实现多个脂肪库的分离。13-14.

本实验方案的目的是提供一种精确的方法，用于从多个解剖部位识别和分离不同类型的脂肪组织库。

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方案

注意：所有动物实验操作均经辛辛那提大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物编号 85-23，1996 年修订版）的规定。

1. 处死并消毒小鼠

  1. 将小鼠放入含有超治疗剂量异氟烷的安乐死盒中，使其吸入至安乐死效果。小鼠安乐死后，将其从盒中取出。
  2. 采用颈椎脱位作为第二种安乐死手段。
  3. 用70%乙醇擦拭动物体表，对小鼠外部表面进行消毒。

2. 三种不同脂肪组织库的鉴定与分离

  1. 棕色脂肪组织（BAT）的分离：
    1. 确保毛发已被酒精清洁湿润，以利于切开表皮和真皮层。
    2. 将小鼠仰卧放置，背部紧贴实验台。
    3. 用镊子夹住横膈膜下方的皮肤，提起后用剪刀剪开。
    4. 沿小鼠体周横向剪开，暴露腹膜。
    5. 通过剥离小鼠上半身皮肤，显露蝴蝶状的棕色脂肪储存区。一手握住小鼠下肢和腹部，另一手将皮肤向上拉向头部。
    6. 调整小鼠体位，使其俯卧于实验台上。注意避免毛发污染暴露的脂肪组织。
    7. 清洁手术器械，并更换一副新的手套。
    8. 定位肩胛骨及其对应的脂肪组织。小心去除覆盖在蝴蝶状区域上的表层白色脂肪，然后分离肩胛间区的棕色脂肪组织。注意避免损伤与棕色脂肪紧密相连的肌肉。
      注意：建议使用解剖显微镜去除白色脂肪，以及在分离棕色脂肪与肩胛骨时使用。
    9. 取出脂肪组织，转移至2 ml 微量离心管中。
    10. 若需提取RNA或蛋白质，应将组织浸入液氮中速冻，并于-80 °C保存。应立即冷冻样本以防止降解。若用于培养，用DMEF-12培养基覆盖组织，并置于冰上，直至所有样本收集完毕（补充信息）。
  2. 皮下脂肪组织（SQ）的分离，一种白色脂肪组织储存区（WAT）：
    1. 更换一副新手套，以避免不同脂肪组织之间的交叉污染。
    2. 通过剥离小鼠下半身皮肤，暴露腹股沟区域的三角形皮下脂肪储存区。一手握住上肢和胸廓，另一手将皮肤向下拉向足部。
    3. 将小鼠保持仰卧位，同时注意避免毛发污染暴露的脂肪组织。
    4. 清洁手术器械，并更换一副新的手套。
    5. 小心分离皮下脂肪的三角区域。注意避免肌肉、邻近脂肪、乳腺组织或血管的污染，防止血液污染样本。
      注意：若边界不清晰，建议使用解剖显微镜。
    6. 取出脂肪组织，转移至2 ml 微量离心管中。
    7. 若需提取RNA或蛋白质，应将组织浸入液氮中速冻，并于-80 °C保存。应立即冷冻样本以防止降解。
    8. 若用于染色，可固定或包埋于OCT中。若用于培养，用DMEF-12培养基覆盖组织，并置于冰上，直至所有样本收集完毕（补充信息）。
  3. 性腺脂肪组织的分离，一种内脏脂肪组织（VAT）和白色脂肪组织（WAT）储存区：
    1. 更换一副新手套，以避免不同脂肪组织之间的交叉污染。
    2. 用剪刀在横膈膜正下方横向剪开腹膜，再从横膈膜沿冠状面中线剪至直肠，以暴露腹腔器官。
    3. 定位睾丸或卵巢，并识别附着的白色脂肪组织，雄性称为附睾脂肪，雌性称为性腺脂肪。
    4. 清洁手术器械，并更换一副新的手套。
    5. 小心将两侧附睾脂肪组织从睾丸、附睾及输精管上分离。若为雌性，则小心将两侧性腺脂肪垫从卵巢上分离。
    6. 取出脂肪组织，转移至2 ml 微量离心管中。
    7. 若需提取RNA或蛋白质，应将组织浸入液氮中速冻，并于-80 °C保存。应立即冷冻样本以防止降解。
    8. 若用于染色，可固定或包埋于OCT中。若用于培养，用DMEF-12培养基覆盖组织，并置于冰上，直至所有样本收集完毕（补充信息）。

3. 血管周围脂肪组织（PVAT）的分离

  1. 心脏的分离
    1. 将小鼠仰卧放置，四肢向外伸展。
    2. 使用手术胶带固定附属装置。
    3. 在将小鼠按上述方法放置后，用镊子提起剑突以产生张力，沿横向剪开膈肌，暴露胸腔下部。
    4. 在提起剑突以保持张力的同时，沿胸骨侧上方朝头部方向剪开肋骨。
    5. 在锁骨下方紧贴其下缘处提起肋骨笼，沿锁骨下缘向两侧腋窝方向切开。暴露胸腔及其内容物（心脏、肺） 等等。应能清晰地看到。
    6. 使用无菌纱布吸除胸腔内的多余血液和液体，清洁胸腔。若需采集器官或血管，务必进行灌注（补充信息）。
    7. 待该区域液体清除后，切断支气管及相连的血管以移除肺脏，从而更好地暴露心脏。
  2. 主动脉周围血管脂肪组织（PVAT）的定位与切除
    1. 移除以下器官以更好地暴露主动脉的下部：肝脏、胃、脾脏、胰腺、肠和结肠。
    2. 首先识别胃和食管，在胃食管交界处切断食管，以将胃从体内游离出来。
    3. 接下来，辨认肠道及其周围的肠系膜。在肠系膜表面进行浅层切割，因其紧邻腹主动脉的肾段，然后“游离肠管”。
    4. 尽可能靠近直肠处切断结肠，从而将胃、肠和结肠从鼠体中分离。
    5. 通过切断相连的肠系膜和血管，移除胃、小肠、结肠、胰腺和脾脏。胰腺和脾脏应随胃、小肠和结肠一并游离取出。
    6. 通过切断肝静脉和相连的肠系膜取出肝脏，切除所有肝叶。
    7. 切除包裹肾脏的脏层腹膜和周围脂肪，保留肾脏与主动脉的连接 体内 作为主动脉不同节段的地理标记。
    8. 用无菌的1×PBS冲洗该区域，并用无菌纱布吸除所有液体。
    9. 使用显微剪刀和显微镊子，将主动脉与其背侧与脊柱的连接以及腹侧与食管的连接分离。
    10. 沿降主动脉从心脏起始处至髂部分叉处分离并游离主动脉。
    11. 识别并分离锁骨下血管。从颈部向主动脉根部分离这些血管，以更好地暴露心脏中的主动脉连接处和主动脉根部。
    12. 去除胸腺，然后剪断头臂动脉、左颈总动脉和左锁骨下动脉，以允许心脏移动。
    13. 在解剖显微镜的辅助下，观察围绕主动脉的血管周围脂肪组织（PVAT）层。
    14. 使用显微镊子轻轻将血管周围脂肪组织（PVAT）从主动脉上剥离，注意避免夹捏或挤压PVAT。使用显微剪从膈肌上方的胸段开始，小心剪断PVAT与主动脉之间的连接。
      注意：建议使用解剖显微镜。
    15. 重复此过程，沿主动脉全长进行，直至腹主动脉的肾下区域结束，该区域位于主动脉血管分叉为髂动脉处的稍上方。
    16. 如果需要主动脉弓周围血管脂肪组织，可采用相同方法去除主动脉弓小弯侧的血管周围脂肪组织。
    17. 将PVAT样本放入2 ml微量离心管中。
    18. 若需提取 RNA 或蛋白质，将组织浸入液氮中速冻，并于 -80 °C 保存。样品应立即冷冻，以防止降解。若进行培养，用 DMEF-12 覆盖组织，并置于冰上，直至所有用于培养的样品收集完毕（补充信息）。
      注意：若需进行全面的脂肪组织库分析，还可考虑以下脂肪组织库：肾周、肠系膜、大网膜、心包和腘窝脂肪。

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结果

使用所述手术方法，成功实现了腹股沟皮下脂肪、肩胛间棕色脂肪、内脏附睾脂肪（图1），以及主动脉弓周围血管脂肪、胸主动脉脂肪、肾上腺周围主动脉脂肪和肾下主动脉脂肪（图2）的识别与定位。通过苏木精-伊红（H&E）染色对分离的棕色脂肪组织（BAT）和白色脂肪组织（WAT）样本进行了组织学检查，并成功区分了二者（图3）。对上述所有分离和切除的脂肪组织库中脂联素（AdipoQ）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）、细胞死亡诱导因子DFFA样效应蛋白a（CIDEA）及其他脂肪特异性标志物的RNA水平进行了分析（数据未显示）。

成功培养并分化了皮下脂肪细胞和血管周围脂肪细胞的原代细胞系，用于微阵列分析。通过油红O染色证实了培养的前脂肪细胞已转化为脂肪细胞。图4成功分离、培养和诱导脂肪细胞分化，可用于 体外 研究，成功测定了蛋白质活性。在治疗组与对照组中测定了基质金属蛋白酶-2（MMP2）的酶活性。MMP2 的活性被测定 ...

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讨论

肥胖可导致多种疾病，而脂肪组织所起作用的完整机制尚未完全阐明；因此，对脂肪组织领域的持续研究十分必要。动物模型，特别是小鼠模型，是研究疾病进展和测试潜在药物治疗的首选初始模型。在使用这些模型时，精确分离和切除脂肪组织库是研究脂肪相关疾病病理学的重要且必要的工具。

在当前关于脂肪库的研究文献中，已有大量研究涉及不同脂肪库的代谢行为、差异及其解剖位置。然而，能够提供如何精确定位、识别并分离这些脂肪库的详细方法的文献仍较为少见。通过对现有脂肪组织分离方法的综述发现，仅有少数实验方案描述了如何一次分离一个或两个脂肪库的技术。相比之下，本方案的独特之处在于提供了一种精确的技术，可在解剖操作最少、污染风险最低的前提下，同时分离多个脂肪库，并涵盖了对所获取样本进行多种后续研究方法的详细说明13-14。

在该方法中，有多个步骤对于样品的分离和纯度至关重要。经常清洁工具、手套和表面以去除毛发和污染物，是避免脂肪库污染的关键步骤。在横切小鼠体表皮肤以暴露腹膜进行脱皮时，必须注意不要切得过深。若切破腹膜，将使脱皮操作变得非常困...

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披露

作者声明不存在任何竞争性财务利益或其他利益冲突。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
异氟烷Med-Vet International#RXISO-250
70% 乙醇Fisher07-678-001
DMEF-12Sigma AldrichD-6421使用前在水浴中预热。
2 ml 微量离心管MidsciMCT-200-C-S
磷酸盐缓冲液Sigma AldrichP5368-10PAK

参考文献

  1. Ogden, C. L., Carroll, M. D., Kit, B. K., Flegal, K. M. Prevalence of obesity in the United States, 2009-2010. NCHS Data Brief. 82, 1-8 (2012).
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