小鼠脂肪组织的定位、鉴定与切除

摘要

由于肥胖与其他共病之间存在显著且负面的关联，研究脂肪组织在疾病和整体健康中的作用具有重要意义。本文介绍了一种分离和切除脂肪组织库的实验方案，可用于通过原位（in situ）和体外（in vitro）方法对脂肪组织进行研究。

摘要

肥胖在过去几十年中显著增加，影响了超过三分之一的美国成年人口。仅在2005年，肥胖带来的直接医疗成本就高达1902亿美元，其经济影响极为巨大。肥胖是多种疾病的重要风险因素。历史上，人们对脂肪组织及其在体内的重要且基本功能知之甚少。白色脂肪和棕色脂肪是脂肪组织的两种主要类型，但目前的研究文献已确认了一种新型脂肪，称为米色脂肪或“brite”脂肪。研究表明，不同脂肪储存部位具有特定的代谢特征，某些脂肪库更易导致肥胖及相关疾病的发生。本实验方案的目标是为研究人员提供识别和切除脂肪组织库的能力，以便分析各种因素对脂肪组织的影响，以及脂肪在疾病和整体健康中所起的有益或有害作用。通过分离和切除脂肪组织库，研究人员可观察其宏观形态学变化及组织学变化。所分离的脂肪组织还可用于分子生物学研究，以评估转录和翻译水平的变化，或用于 体外 通过实验发现感兴趣靶点及作用机制。该技术由于设计上的优势，能够简便地分离多个储存部位，且污染极少，优于其他已发表的技术。

引言

由于20世纪后几十年肥胖症的急剧增加，脂肪组织受到了媒体的广泛关注。目前，肥胖症影响了美国超过三分之一的成年人以及17%的儿童和青少年¹。涵盖所有种族群体的统计研究显示，在肥胖流行的相关数据中，非西班牙裔黑人的年龄校正后肥胖率最高（49.5%），高于墨西哥裔美国人（40.4%）、所有西班牙裔人群（39.1%）和非西班牙裔白人（34.3%）²。肥胖对经济的影响也日益成为医疗系统的重大关切。2012年的一项估算表明，2005年美国因肥胖产生的年度医疗费用高达1902亿美元，约占整体医疗支出预算的21%。令人遗憾的是，仅儿童肥胖就造成了约140亿美元的直接医疗成本。统计数据显示，患有肥胖症个体的平均年度医疗费用比无此疾病的个体高出2,741美元^3-5。

肥胖是多种疾病的主要风险因素，例如：2型糖尿病、血脂异常、心血管疾病、癌症、肌肉骨骼系统疾病和慢性炎症。肥胖与代谢综合征及其他慢性疾病的发病机制密切相关^6-8。鉴于肥胖与其他共病之间存在如此显著且负面的关联，科学研究已将重点放在更深入地理解当前这一流行状况，以及脂肪组织在其中所发挥的多种关键作用上。

传统上，脂肪组织被认为无关紧要，仅被视为一种简单的填充组织。目前研究表明，脂肪组织在机体功能中发挥着多种重要作用，包括代谢、激素调节、炎症反应、保护和保温⁹。脂肪组织主要由....

方案

注意：所有动物实验操作均经辛辛那提大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物编号 85-23，1996 年修订版）的规定。

1. 处死并消毒小鼠

1. 将小鼠放入含有超治疗剂量异氟烷的安乐死盒中，使其吸入至安乐死效果。小鼠安乐死后，将其从盒中取出。
2. 采用颈椎脱位作为第二种安乐死手段。
3. 用70%乙醇擦拭动物体表，对小鼠外部表面进行消毒。

2. 三种不同脂肪组织库的鉴定与分离

1. 棕色脂肪组织（BAT）的分离：
   1. 确保毛发已被酒精清洁湿润，以利于切开表皮和真皮层。
   2. 将小鼠仰卧放置，背部紧贴实验台。
   3. 用镊子夹住横膈膜下方的皮肤，提起后用剪刀剪开。
   4. 沿小鼠体周横向剪开，暴露腹膜。
   5. 通过剥离小鼠上半身皮肤，显露蝴蝶状的棕色脂肪储存区。一手握住小鼠下肢和腹部，另一手将皮肤向上拉向头部。
   6. 调整小鼠体位，使其俯卧于实验台上。注意避免毛发污染暴露的脂肪组织。
   7. 清洁手术器械，并更换一副新的手套。
   8. 定位肩胛骨及其对应的脂肪组织。小心去除覆盖在蝴蝶状区域上的表层白色脂肪，然后分离肩胛间区的棕色脂肪组织。注意避免....

结果

使用所述手术方法，成功实现了腹股沟皮下脂肪、肩胛间棕色脂肪、内脏附睾脂肪（图1），以及主动脉弓周围血管脂肪、胸主动脉脂肪、肾上腺周围主动脉脂肪和肾下主动脉脂肪（图2）的识别与定位。通过苏木精-伊红（H&E）染色对分离的棕色脂肪组织（BAT）和白色脂肪组织（WAT）样本进行了组织学检查，并成功区分了二者（图3）。对上述所有分离和切除的脂肪组织库中脂联素（AdipoQ）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）、细胞死亡诱导因子DFFA样效应蛋白a（CIDEA）及其他脂肪特异性标志物的RNA水平进行了分析（数据未显示）。

成功培养并分化了皮下脂肪细胞和血管周围脂肪细胞的原代细胞系，用于微阵列分析。通过油红O染色证实了培养的前脂肪细胞已转化为脂肪细胞。图4成功分离、培养和诱导脂肪细胞分化，可用于 体外 研究，成功测定了蛋白质活性。在治疗组与对照组中测定了基质金属蛋白酶-2（MMP2）的酶活性。MMP2 的活性被测定 .......

讨论

肥胖可导致多种疾病，而脂肪组织所起作用的完整机制尚未完全阐明；因此，对脂肪组织领域的持续研究十分必要。动物模型，特别是小鼠模型，是研究疾病进展和测试潜在药物治疗的首选初始模型。在使用这些模型时，精确分离和切除脂肪组织库是研究脂肪相关疾病病理学的重要且必要的工具。

在当前关于脂肪库的研究文献中，已有大量研究涉及不同脂肪库的代谢行为、差异及其解剖位置。然而，能够提供如何精确定位、识别并分离这些脂肪库的详细方法的文献仍较为少见。通过对现有脂肪组织分离方法的综述发现，仅有少数实验方案描述了如何一次分离一个或两个脂肪库的技术。相比之下，本方案的独特之处在于提供了一种精确的技术，可在解剖操作最少、污染风险最低的前提下，同时分离多个脂肪库，并涵盖了对所获取样本进行多种后续研究方法的详细说明^13-14。

在该方法中，有多个步骤对于样品的分离和纯度至关重要。经常清洁工具、手套和表面以去除毛发和污染物，是避免脂肪库污染的关键步骤。在横切小鼠体表皮肤以暴露腹膜进行脱皮时，必须注意不要切得过深。若切破腹膜，将使脱皮操作变得非常困.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
异氟烷	Med-Vet International	#RXISO-250
70% 乙醇	Fisher	07-678-001
DMEF-12	Sigma Aldrich	D-6421	使用前在水浴中预热。
2 ml 微量离心管	Midsci	MCT-200-C-S
磷酸盐缓冲液	Sigma Aldrich	P5368-10PAK