测量谷胱甘肽诱导的水螅摄食反应

摘要

本文介绍一种简单的方法，用于定量分析还原型谷胱甘肽诱导的水螅摄食反应。该方法通过测量水螅触手顶端与口之间的距离来实现。

摘要

水螅是已知最原始的具有神经系统和化学感受能力的生物之一，能够通过检测还原型谷胱甘肽（GSH）来捕获猎物。猎物的运动可触发水螅刺细胞（称为刺丝囊）的机械感受性释放，刺丝囊会插入猎物体内。水螅的摄食反应包括触手卷曲以将猎物移向口部、口的张开以及随后对猎物的吞咽，这些反应由受伤猎物释放的液体中所含的GSH所触发。为了揭示目前尚未明确的水螅摄食反应的分子机制，有必要建立一种用于测量该反应的检测方法。本文描述了一种简单的定量检测方法，通过测量水螅触手顶端与口之间的距离，并计算加入GSH前后该距离的比值，来评估摄食反应。该比值被称为相对触手伸展度，被发现可有效反映摄食反应的程度。本方法利用饥饿模型进行了验证，结果显示饥饿状态的水螅相较于每日喂食的个体表现出更强的摄食反应。

引言

水螅是具有神经系统的最原始生物，能够通过化学感应来检测还原型谷胱甘肽（GSH），从而捕获猎物¹。它以多种动物为食，包括线虫、甲壳类、昆虫幼虫、蝌蚪和刚孵化的鱼¹。这些猎物的运动可触发水螅刺细胞中刺丝囊的机械感应释放，刺丝囊插入猎物体内²。当猎物受伤后释放的体液中含有GSH时，会进一步激活水螅的摄食反应，包括触手卷曲以将猎物移向口部、口部张开以及随后将猎物吞食。已有研究表明，多种分子如多巴胺³、谷氨酸⁴、GABA、甘氨酸⁵、NMDA受体⁶以及抑咽神经肽⁷均参与调控水螅的摄食反应。此外，GSH诱导的化学感应反应受动物摄食状态的调节，饥饿状态的水螅表现出更强的摄食反应¹。这种GSH敏感性的提高具有重要的生物学意义，因为在饥饿状态下，水螅需要以更高的灵敏度寻找猎物。

尽管在显微镜下可以清楚地观察到谷胱甘肽（GSH）诱导的摄食反应，但通常用于测量摄食反应的方法均为非定量方法。在大多数情况下，以水螅口部保持开放的时间作为摄食反应的衡量指标^8,9；而在另一种方法中，定量依据则是群体中表现出摄食反应的水螅个体数量¹⁰。然而，观察水螅息肉口部开放时间的操作较为繁琐，且易受到观察过程中无法控制的参数（如口部朝向）所引入的变异影响。同样，由于摄食反应本身是一个定量参数，基于群体的方法也容易因观察者个人判断或观察偏倚而产生变异或误差。为克服这些问题，我们建立了一种基于水螅触手顶端至息肉口部距离的相对定量方法，用于量化水螅（Hydra vulgaris Ind-Pune¹¹）的摄食反应。

方案

1. 水螅的培养与摄食反应的测定

1. 通过每天喂食卤虫并将其培养在培养基（1 mM Tris-HCl 缓冲液，pH 7.6，1 mM NaCl，1 mM CaCl₂）中来维持水螅水螅体的培养₂，0.1 mM KCl 和 0.1 mM MgSO₄₄) 置于玻璃碗中 18 °C 在12小时光照-12小时黑暗循环条件下，如前所述¹².
2. 为测量摄食反应，将一只具有5至6条触手的成熟水螅水螅体转移至24孔板的一个孔中。通过倾斜孔板去除残留培养基，然后立即加入 500 µl 新鲜培养基
3. 准备 9 µM 谷胱甘肽溶液置于水螅培养基中。由于谷胱甘肽溶液易被氧化，每次实验均须使用新鲜配制的谷胱甘肽溶液。
4. 将培养皿转移至配备图像记录装置的显微镜成像平台上。使用深色背景，以便在对比背景下清晰地成像水螅息肉的行为。
5. 用于观察和成像水螅行为的房间需避免强度波动的光照、气流和噪音干扰。此类干扰可能导致水螅息肉发生触手收缩，即使在无谷胱甘肽存在的情况下亦可出现。
6. 让水螅体放松 5 分钟。
7. 确保水螅体位于孔板中央区域，以便能够清晰成像其行为。若水螅体位于孔板边缘，可用移液器冲洗培养基将其移至中央，随后再次静置使其松弛。
8. 拍摄水螅处于放松状态的图像，作为零时点观察。
9. 快速添加 9 µM 谷胱甘肽溶液，使其终浓度达到 3 µM 在孔板中。根据实验目的及水螅表现出的反应，测试一系列不同浓度的谷胱甘肽，并选择所需的适当浓度。
10. 添加谷胱甘肽溶液后立即启动计时器，每隔15-30秒拍摄图像，持续4-5分钟。在延时成像过程中不得更改放大倍数设置。
11. 轻柔且均匀地加入谷胱甘肽溶液，使动物在孔中的位置在显微镜视野中受到的干扰最小。然而，若加入谷胱甘肽溶液后息肉发生大幅度移动，可非常轻柔地移动培养板，将息肉调整至视野范围内以便进行图像采集。
12. 在对照实验中，使用不含谷胱甘肽的培养基，其余所有参数保持不变。
13. 确保在上午时段（下午1点前）完成上述所有实验步骤，以避免昼夜节律对摄食反应程度的可能影响。
14. 使用 GNU 图像处理程序（GIMP）打开每一张捕获的图像。
15. 使用菜单中提供的“Measure”工具 > 工具 > 测量每个触手顶端与口锥之间的距离。如果在任意图像中观察到口部开口，则测量张开口的中心与触手顶端之间的距离。将此距离称为触手伸展度。
16. 计算每个水螅在暴露于谷胱甘肽前后触手伸展的平均值。计算零时点平均触手伸展与后续各时间点平均触手伸展的比值。该比值称为相对触手伸展。
17. 至少对 20 个息肉进行重复测量。

2. 使用饥饿模型进行方法验证

1. 进行饥饿处理时，将数只水螅水母转移到一个单独的玻璃皿中，连续5天不喂食。对照组的数只水螅水母则在类似大小的玻璃皿中每天喂食丰年虾。每天更换两个实验组玻璃皿中的培养液，以避免培养液中出现真菌生长。
2. 实验当天，用丰年虾对水螅对照组喂食1小时，随后将这些水螅用于后续实验，但需先从培养液中彻底移除所有未被摄食及死亡的丰年虾。
3. 采用前述第1步中描述的方法，比较饥饿处理的水螅与对照组水螅的摄食反应。为避免观察时间可能带来的偏差，应交替进行饥饿组与对照组水螅水母的测量。

结果

谷胱甘肽可诱导水螅的触手向口部卷曲，以包裹猎物。这种触手卷曲使触手顶端更接近垂唇。这导致触手伸展范围减小，即触手顶端与垂唇之间的线性距离缩短（图1）。在多个水螅体上取平均后，添加谷胱甘肽前后平均触手伸展范围的比值（相对触手伸展度）随时间逐渐降低。然而，在添加不含谷胱甘肽的培养基后，相对触手伸展度仅短暂下降，并在约1分钟内恢复至单位值（图2）。已知饥饿状态可增强谷胱甘肽诱导的摄食行为^1,13。本文所述摄食行为测量方法通过饥饿模型得到了验证。添加谷胱甘肽1分钟后，饥饿组的触手伸展度显著低于饱食组（采用双尾t检验，假设方差相等，p = 1 × 10^-16）（图3）。

讨论

水螅的摄食行为代表了后生动物中最古老的化学感受系统之一。尽管早在多年前就已检测到刺丝囊辅助捕食后释放的甲壳类体液中存在谷胱甘肽（GSH）¹，但迄今为止，尚未从水螅中鉴定出GSH受体蛋白或其可能编码的基因。针对水螅中GSH结合蛋白的研究甚少^{8, 14, 15}，这些假定受体蛋白的身份仍不明确，且目前报道的可能参与摄食反应的其他分子组分也极为有限^{16, 17}。在整个动物界中，唯一已被鉴定的GSH受体（GSHR）来自金鱼¹⁸。经典实验技术，如利用G蛋白偶联受体（GPCR）信号级联中多种蛋白的抑制剂，以及先进的分子生物学技术（如RNA干扰介导的基因沉默和CRISPR-Cas9介导的基因组编辑），可为鉴定水螅中GSH信号通路的分子组分提供有力工具。受体及其他GSH信号组分表达与功能改变的可评分读出指标，将是摄食行为的改变。因此，建立一种测定GSH诱导水螅摄食反应的方法至关重要。

从表型上看，摄食反应表现为触手向口部卷曲，随后口部张开。基于上述观察，我们建立了一种简单且可靠的方法来定量分析摄食行为，即测量触手...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
冷却培养箱	Panasonic	MIR-254-PE
显微镜	Leica	S8AP0
显微镜用相机	Leica	EC3
还原型谷胱甘肽	Sigma	G4251	4 °C 保存。使用前将瓶体恢复至室温，以避免氧化
图像编辑软件	GIMP	版本 2.8