一种利用灰度分析对小鼠脱发进行定量分析的新技术

摘要

脱发是一种常见的毛发脱落现象，可在多种不同情况下发生，包括作为化疗的副作用。我们建立了一种利用标准凝胶成像仪进行灰度分析来定量小鼠脱发程度的方法，以促进对有前景的新型脱发疗法的研究。

摘要

脱发是一种常见的毛发脱落现象，可在多种不同情况下发生，包括男性型脱发、多囊卵巢综合征以及斑秃。脱发也可能作为癌症患者化疗的副作用出现。本研究旨在建立一种稳定且可靠的方法，用于量化小鼠的毛发脱落情况，从而帮助研究人员准确评估和比较针对上述各类脱发疾病的新型治疗方法。该方法利用标准凝胶成像仪获取并处理小鼠图像，通过测量光吸收程度来反映小鼠体表黑色（或灰色）毛发量的大致比例。以该方式获得的量化数据可进一步采用标准统计学方法进行分析。即， ANOVA、T检验）。该方法已在化疗诱导脱发、斑秃以及脱蜡致脱发的小鼠模型中进行了测试。本报告提供了执行这些测量的详细方案，包括来自C57BL/6和C3H/HeJ品系小鼠的验证数据。这一新技术具有多项优势，包括操作相对简便、依赖大多数科研实验室中常见的设备，以及采用比主观评估更可靠的客观定量评估。对小鼠毛发生长量化方法的改进将有助于脱发模型的研究，并促进临床前研究中对潜在新疗法的评估。

引言

脱发（毛发脱落）是一种具有多重病因的心理和情绪困扰事件。男性型脱发是最常见的脱发原因，约三分之二的男性在35岁前会受到影响¹。在患有多囊卵巢综合征的女性中也可观察到类似的脱发模式。在这两种疾病中，脱发均由雄激素介导。脱发也可能作为一种自身免疫性疾病发生，即斑秃，影响约1.7%的人群²。  脱发还可能作为某些医疗治疗的副作用出现，例如化疗³。  高比例（65–85%）的化疗患者会经历不同程度的脱发^4,5。在化疗背景下，脱发的心理后果已被广泛研究。化疗引起的脱发可导致焦虑、抑郁、负面的身体形象、自尊心下降以及整体幸福感降低^6,7。高比例（47–58%）的女性癌症患者认为脱发是化疗过程中最具创伤性的方面，高达8%的患者因害怕脱发而拒绝接受治疗^4,6。在雄激素性脱发中，也有证据支持通过治疗来减轻脱发带来的心理甚至医学后果^8,9。同样，斑秃也被报道具有严重的心理影响²，其斑片状的脱发特征可能导致比大多数其他脱发原因更令人不悦的外观后果。

尽管具有轻度抗雄激素作用的药物（例如，螺内酯）曾被用于脱发治疗，但疗效有限，而首个对脱发有效的药物是米诺地尔¹⁰。这种降压药具有促进毛发生长的观察到的副作用，现已被用作多种类型脱发的局部治疗手段。然而，治疗反应常常不完全，部分患者仅表现为脱发减缓，而非真正的毛发再生¹⁰。非那雄胺是一种II型5α-还原酶的竞争性拮抗剂，可阻断睾酮向双氢睾酮的转化，从而在部分全身性雄激素阻断的代价下改善雄激素性脱发。长期（10年）治疗的应答率约为50%¹¹。总体而言，尽管该领域已有大量研究，目前仍缺乏针对脱发的充分有效疗法。

几十年来，科学家和临床医生一直在研究用于临床试验中测量头皮毛发生长的方法。随着治疗脱发药物的开发，人们越来越需要可靠、经济且微创的方法来测量毛发生长情况，特别是对治疗的反应。过去，利用图像分析技术对脱发疾病患者的毛发密度进行精确定量，已通过多种技术获得了稳定且有效的结果，这些技术包括数字化图像分析¹²、单根毛发及皮肤病变的图像分析¹³，以及对特定头皮区域进行显微扫描以定量毛发质量¹⁴。

遗憾的是，尽管上述方法在临床试验中对促进毛发生长干预措施的有效性评估有所改进，但这些方法尚未应用于临床前研究中的啮齿类动物实验。我们的目标是建立一种一致且可靠的方法来定量小鼠的脱发情况，从而使研究人员能够更准确地评估和比较针对各种类型脱发的新治疗策略。我们开发了一种方法，利用大多数实验室中常见的设备，可快速、可靠地定量具有棕色或黑色毛发的小鼠的毛发密度。该方法已在化疗诱导脱发、斑秃以及脱毛蜡致脱发的小鼠模型中进行了测试。本文提供了进行这些测量的详细操作方案，包括来自 C57BL/6 和 C3H/HeJ 小鼠品系的验证数据。由于该技术依赖于检测毛干中色素对光的吸收，因此无法用于检测白色小鼠或白化小鼠的毛发生长。

方案

伦理声明：所有涉及动物的研究必须经机构的动物护理和使用委员会（IACUC）批准（本研究相关数据已获蒙特菲奥里医学中心 IACUC 批准，方案编号 #11-6-240 和 #13-7-100）。动物在拍摄过程中仅接受轻度麻醉，目的仅为保持其静止，本方案不涉及任何会引起疼痛的操作。

1. 照片的采集

1. 使用印有文字的纸张设置凝胶成像仪的焦距和视野。验证拍摄区域内光源的均匀性。为帮助确保均匀性，请使用带有内置光源的凝胶成像仪进行反射摄影。请勿使用透射光源，因为这会产生动物的轮廓影像，不适合进一步的灰度分析。
   注意：这会使小鼠略微失焦，从而在感兴趣区域（ROI）内实现光学平均，有助于减少极小（即 <10 像素）感兴趣区域的量子化误差。较大的感兴趣区域不会受到此微小对焦调整的影响，也不会受到动物大小差异的影响。
2. 使用氯胺酮（100 mg/ml）/赛拉嗪（20 mg/ml）（2:1）对动物进行麻醉，因其可快速起效并快速恢复，适合对多个动物进行拍照。
   注意：当动物静止到足以进行摄影时，表明麻醉已生效。由于动物通常在此轻度麻醉下10–15分钟内即可恢复，兽医未建议使用眼膏。
3. 将麻醉后的动物垂直放置于凝胶成像仪上（尽可能接近平行）。
   1. 拍摄背部照片时，将动物置于俯卧位，四肢伸展。
   2. 拍摄腹部照片时，将动物置于仰卧位，并注意避免动物发生侧向旋转。
4. 在拍摄区域内放置灰度标准品。
5. 关闭访问门。重要提示：环境光可能引起曝光变化。
6. 设置光圈值（F-stop），使感兴趣区域处于图像采集的线性范围之内（读取光圈值）。
   注意：大多数系统会显示图像饱和的位置。
7. 拍摄照片。
8. 通过增加或减少1个光圈值（F-stop），将光圈值调整至另一曝光设置，使感兴趣区域仍处于线性采集范围内，同时确保标准品和感兴趣区域均处于线性采集范围（参考光圈值）。
9. 拍摄照片。
10. 完成摄影后，将动物置于加热台上，并监测直至其能够维持胸卧位。将动物放回笼中。待所有动物完全恢复后，将其群体送回动物房。

2. 光吸收的定量分析

1. 使用凝胶成像仪配套软件在动物图像上标记感兴趣区域。
   1. 对于动物全身背侧视图，使用一个从上肢延伸至下肢的矩形或椭圆形区域，并尽可能向两侧扩展，确保该区域的任何部分均不超过动物背部范围，如图1A所示。
      注意：也可使用手绘工具自由标记感兴趣区域。
   2. 对于动物全身腹侧视图，使用两个矩形区域：一个覆盖骨盆区域，另一个覆盖胸部区域，如图1B所示。
   3. 对于较小的感兴趣区域，即药物给药部位，根据实际情况进行标记。
2. 在灰度吸收标准品图像上标记感兴趣区域。
3. 记录每个已标记感兴趣区域的吸收值。

3. 分析

感兴趣区域获得的吸光度水平可能需要相对于背景标准进行归一化，以便在不同照片之间进行比较。曝光与吸光度之间的关系为对数-对数关系。即， log（曝光）与log（吸收）之间存在线性关系。利用这一关系，可将感兴趣区域的吸收值归一化至一个标准背景值，从而实现不同照片之间吸收值的直接比较，包括在不同时间点拍摄的照片。即， 研究方案中的连续测量）。执行这些校正的具体步骤详见可选步骤 3.1 和 3.2。

1. （可选）绘制 log（曝光）曲线 与 使用灰度吸收标准获得的值计算 log(吸收值)
2. （可选）按如下方法对每张照片的拍摄标准差异进行校正：
   1. 选择用于读数的F值（由步骤1.6确定）和用于参考的F值（由步骤1.8确定）。
   2. 在读取光圈值的所有照片中计算标准品的平均吸光度。该平均值即为参考标准值（RSV）。
   3. 计算标准（delta-S）及每个定义的感兴趣区域（delta-ROI-1、delta-ROI-2……delta-ROI-X）在每张照片中读数与参考F挡光圈设置之间的吸光度差值
   4. 按以下方法计算每个 ROI 的校正吸收值：ROI-X 的校正吸收值 = 读数光圈下的 ROI-X 吸收值 + (RSV - 标准物质在读数光圈下的吸收值) × (Δ-ROI-X / Δ-S)
3. 整理实验数据，并对连续变量采用标准统计方法进行数据分析即， 方差分析，T检验

结果

本技术通过C3H/HeJ移植小鼠进行了验证，该小鼠是斑秃的动物模型¹⁶。这些动物会出现全身性脱发，且脱发程度随时间逐渐加重。然而，脱发呈斑片状分布，在不同小鼠之间表现可能存在差异，导致较大的变异性，从而影响定性评估的准确性。该模型为检测小鼠不同部位光学密度测量值之间的相关性提供了机会，以此作为有效性评估的依据。

第一个问题是，使用不同曝光条件、不同感兴趣区域（ROI）划定方式以及来自同一只小鼠非重叠区域的ROI所获得的测量结果之间是否存在相关性。结果显示存在显著相关性（p <0.0001）在比较由矩形定义的感兴趣区域时观察到 与 小鼠背侧表面的椭圆形标准图4A）。在动物体的不同部位以及不同暴露水平下也观察到类似的高相关性（未显示）。这表明这些测量结果具有很高的精确度。此外，在F值2.0时的吸收率之间也存在显著相关性 与 1.2 使用矩形感兴趣区域（ROI）在背部背侧表面进行 <0.0001, 图4B). 即使在同一小鼠的背侧与腹侧表面之间比较吸收...

讨论

本报告详细介绍了一种用于定量啮齿类动物脱发的新技术。该技术利用凝胶成像仪进行图像采集与分析，此类设备在大多数实验室中均 readily available。研究表明，该方法对操作中的微小差异具有良好的稳健性（图4–图5），且与治疗模型中肉眼可见的脱发程度高度相关（图6）。这些技术已成功应用于雄激素性脱发实验疗法的评估¹⁷。

一种用于定量评估啮齿类动物毛发生长的工具在推动脱发症治疗研究方面可能具有重要价值。许多脱发小鼠模型具有内在变异性，这使得基于主观评估治疗干预效果变得困难。同样，若采用一种能够以连续变量形式提供结果的定量评估方法，则可通过组均值及标准差/标准误进行数据汇总，并可使用标准统计学方法（如方差分析、t检验）进行检验。该定量评估方法可用于测量一系列时间点的反应，并可用于构建受试化合物的剂量-反应曲线。因此，定量分析能够实现对正在开发的治疗手段疗效进行基于证据的评估。

该技术利用了多种小鼠品系中毛...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
KODAK Gel Logic 100 成像系统	Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA		用于获取和分析图像的凝胶成像仪，必须具备内置光源以进行反射摄影。
The Kodak/Tiffen Q-13 灰度标尺	Imatest		灰度标准
C57BL/6J 小鼠	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine		用于代表性研究的小鼠
C3H/HeJ 移植小鼠	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine		用于代表性研究的小鼠