利用生物配体的微米级图案功能化的细胞培养基底在组织工程领域具有广泛的应用价值。本文展示了多种具有微米图案的聚乙二醇刷状结构组织培养基底的多功能且自动化制备方法，这些聚乙二醇刷具有正交化学特性，可实现生物配体的空间精确定位和位点特异性固定。
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方法文章
利用机器人微接触印刷（R-µCP）与连续亲核取代反应制备复杂细胞培养基底
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
在组织工程中，理想情况是在微米尺度上对培养过程中的组织形态和细胞命运实现空间控制。通过使用接枝了聚乙二醇（PEG）刷的培养基底，可实现这一目标，即构建出微尺度下抗污染、抗细胞黏附的区域，以及细胞能够与共价固定的配体发生特异性生物相互作用的区域。为了利用此类基底构建复杂的组织，有必要依次图案化多种功能化的 PEG 刷，使其具备不同的生物活性，并在微米尺度上按特定方向排列，以模拟 体内 微环境。微接触印刷（μCP）是一种用于构建接枝PEG刷图案的多功能技术，但手动μCP无法实现微米级精度操作。因此，我们将先进机器人技术与软光刻技术及新兴表面化学反应相结合，开发出一种机器人辅助微接触印刷（R-μCP）方法，用于制备具有复杂、微米级且高度有序PEG刷图案的培养基底，其中PEG刷呈现正交“点击”化学功能。本文详细描述了此类基底制备的工作流程。
引言
PEG接枝表面能够在保持其固有抗污性能的同时共价结合生化配体，因此是构建培养基底上定制微环境的理想选择1,2,3配体偶联的PEG刷介导的生物特异性相互作用，可实现对复杂环境中生化信号效应的还原性分析 体内 个体细胞表型受组织微环境的影响。此外，可利用生物正交“点击”化学反应实现配体的定向固定，使其呈现天然构象4-6因此，PEG刷状聚合物的微尺度空间图案化是一种多功能工具，可用于设计定制的 体外 微环境用于研究由固定化生化信号诱导的细胞信号传导6,7.
一种生成生化信号空间图案的常用方法是微接触印刷（μCP）法，即在镀金基底上印制聚乙二醇（PEG）修饰的烷基硫醇图案。随后，由PEG化烷基硫醇构成的微图案化自组装单分子层（SAMs）可限制生化分子的物理吸附。 例如， 蛋白质仅结合至基底的非图案化区域8,9然而，通过该技术制备的自组装单分子膜（SAMs）在长期细胞培养条件下易发生氧化。因此，常通过表面引发的原子转移自由基聚合（SI-ATRP）方法，在微接触印刷（μCP）制备的烷基硫醇SAMs表面进一步接枝聚乙二醇（PEG）聚合物刷，以提高该区域的抗污稳定性。10具体而言，在镀金表面通过微接触印刷（μCP）技术印制烷基硫醇聚合引发剂ω-巯基十一烷基溴代异丁酸酯，随后进行聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯（PEGMEMA）单体的表面....
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方案
1. 制备弹性印章
- 为制备PDMS印章的硅模板，使用计算机辅助设计软件设计光掩模的特征图案。
- 将第一种图案设计为20 × 20的环形阵列，内径（ID）为300 μm，外径（OD）为600 μm，中心间距为1,200 μm。
- 将第二种图案设计为20 × 20的环形阵列，内径（ID）为600 μm，外径（OD）为900 μm，中心间距为1,200 μm。
- 此外，在每个阵列设计的四个角落处以45°角放置1 × 1 mm2的方形参考标记，其与角落图案的中心间距为1,200 μm。
- 采用标准光刻技术（详见文献15或与微流控代工厂合作）制备用于本实验的硅模板，其长宽比为1:1，对应特征深度为300 μm。
注意：特征深度低于100 μm可能导致印章在接触基底表面之前发生异常形变。
注意：本方案从已获得带有上述光刻胶图案的硅模板开始，此类模板的制备需要专用设备和洁净室环境。建议咨询加工服务商或核心设施以制备这些图案化模板。
- 通过在密闭环境中过夜（O/N）孵育（十三氟-1,1,2,2-四氢辛基）三氯硅烷蒸气，对硅模板进行硅烷化处理。
注意：硅烷蒸气具有高毒性，仅可在通风橱中操作。 - 将PDMS预聚物与PDMS固化剂按10:1的比例混合后浇注....
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结果
手动对齐的应用 μCP 已有研究证实，利用正交“点击”化学功能化的聚乙二醇接枝刷阵列来构建培养基底的技术6然而，这种方法对图案取向的控制能力有限，且常常导致功能化区域的重叠。在此，提出一种新型的R-μCP 系统被用于克服这一限制，其能够精确地构建一系列PEG刷状环阵列 300 μm 身份与 600 μm OD 呈现末端炔基团，位于另一组 PEG 刷状环阵列中 600 μm 身份与 900 μm 展示末端叠氮基团的OD14. 在炔烃修饰的PEG刷与叠氮-PEG反应后3-生物素及含叠氮基团的PEG刷与DBCO-PEG的反应4-生物素作为底物，使用荧光探针对样本进行免疫染色，并通过共聚焦显微镜成像（图 4）. 使用定制的 MATLAB 程序分析这些图像，计算得出两个 PEG 刷状阵列以亚微米级精度对齐10 μm 准确性， 即， X ~ 6.4 μm, Y ~ 1.7 μm，且 θ ~ 0.02°，这已达到我们SCARA型号制造商声明的极限即, ~10 μ.......
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讨论
理想的组织工程支架应具有仿生特性，从而重现天然组织中关键生物活性配体的空间分布。此外，它们还应具备动态特性，能够随时间调节配体的呈现及其空间分布模式，以引导组织形态发生并实现细胞命运的区域性特异性诱导。制造此类支架需要在基底上以复杂且高度有序的方式固定多种生化信号分子。尽管模拟细胞微环境中所有内源性因子 体外 是不合理的，本文所述的R-μCP系统可实现多种正交生物活性化学区域的固定，并能对空间取向进行微米级控制。
当考虑到固定化配体结合的聚乙二醇（PEG）刷阵列能够引发生物特异性相互作用，而未结合的PEG刷则仍能抵抗蛋白质吸附，从而可用于调控细胞黏附与迁移时，这些基底的应用价值进一步提升。尽管被动的细胞外基质（ECM）蛋白或聚合物-PEG偶联物的微图案吸附是一种控制细胞黏附和迁移的较简单方法，但该技术仅能提供短暂的调控，因为吸附过程本身是可逆的11。此外，分子以不可预测的方向和随机的浓度吸附到表面，从而限制了生物特异性相互作用的保真度与可控性。再者，通常用于构建抗污区域的化合物（如牛血清白蛋白或Pluronic F127）不具备特定的反应位点.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性财务利益。
致谢
本工作的资助由威斯康星发现研究所和威斯康星校友研究基金会提供给 GTK、TK 和 JDM。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| SCARA | Epson | LS3-401ST | 如有需要，可选用精度更高的高端型号。 |
| (十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷 | Gelest | SIT8174.0 | 注意：仅可在化学通风橱中操作。在硅片硅烷化过程中，必须确保所有硅烷完全蒸发后，人员方可进入通风橱。 |
| Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒 | Ellsworth Adhesive Co | NC9020938 | 使用前需通过真空处理彻底脱气。其他类似试剂盒（如 Kit 182）亦可接受。 |
| 24 mm × 50 mm #1 盖玻片 | 费舍尔科技公司（Fisher Scientific） | 48393106 | 可根据需求从多家供应商处购买不同尺寸的产品。 |
| CHA-600 Telemark 电子束蒸发仪 | Telemark | SEC-600-RAP | 需接受专门培训方可操作。 |
| EPSON LS3 SCARA | EPSON | LS3-401ST | |
| ω-巯基十一烷基溴代异丁酸酯 | Prochimia | FT 015-m11-0.2 | 储存于 -20 °C。其他ATRP引发剂亦可使用，因该R-μCP平台适用于所有微图案化方法。 |
| 50 ml 施兰克管瓶（Schlenk Tube Flask） | Synthware | 60003-078 | 需配备带隔膜的橡胶塞。 |
| 聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯 | Sigma Aldrich | 447943 | 运输时含有MEHQ和BHT自由基抑制剂。 |
| 甲醇（ACS认证级） | 费舍尔科技公司（Fisher Scientific） | A412-4 | 注意：仅可在化学通风橱中操作。 |
| 溴化铜(II) | Sigma Aldrich | 437867 | 注意：应佩戴外科口罩以减少暴露。 |
| 2,2'-联吡啶 | Sigma Aldrich | D216305 | 注意：应佩戴外科口罩以减少暴露。 |
| L-抗坏血酸钠 | Sigma Aldrich | A4034 | |
| 20 ml 硼硅酸盐玻璃闪烁瓶 | 费舍尔科技公司（Fisher Scientific） | 03-340-4E | |
| 叠氮化钠 | Sigma Aldrich | S2002 | 注意：应佩戴外科口罩以减少暴露。 |
| N,N-二甲基甲酰胺 | Sigma Aldrich | 227056 | 注意：仅可在化学通风橱中操作。 |
| 乙醇胺 | Sigma Aldrich | 398136 | 注意：仅可在化学通风橱中操作。 |
| 三乙胺 | Sigma Aldrich | T0886 | 注意：仅可在化学通风橱中操作。 |
| 二甲基亚砜 | Sigma Aldrich | 276855 | 注意：仅可在化学通风橱中操作。 |
| 丙炔胺 | Sigma Aldrich | P50900 | 注意：仅可在化学通风橱中操作。 |
| 200 证明醇 | 威斯康星大学物资分发服务中心（University of Wisconsin Material Distribution Services） | 2292 | 注意：仅可在化学通风橱中操作。 |
| 叠氮-PEG3-生物素 | ClickChemistryTools | AZ104-100 | 溶于DMF |
| 硫酸铜(II) | Sigma Aldrich | C1297 | 注意：应佩戴外科口罩以减少暴露。 |
| 三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺（TBTA） | Sigma Aldrich | 678937 | |
| L-抗坏血酸 | Sigma Aldrich | A7506 | |
| 磷酸盐缓冲液 | 英潍捷基（Invitrogen） | 14190144 | |
| 驴血清 | Sigma Aldrich | D9663 | 被驴血清污染的物品被视为生物危害材料，应按规定妥善处置。其他多种化合物（例如 BSA）也可用于此目的。 |
| 12孔聚苯乙烯板 | 赛默飞世尔科技 - NUNC | 07-200-81 | 可从多家供应商处购买不同尺寸的培养板。 |
| DBCO-PEG4-生物素 | Clickchemistytools | A105P4-10 | 溶于DMF |
| 链霉亲和素-Alexa Fluor 488 标记物 | Life Technologies | S-11223 | 溶于PBS |
| 链霉亲和素-Alexa Fluor 546 标记物 | Life Technologies | S-11225 | 溶于PBS |
| Nikon A1-R 共聚焦显微镜 | Nikon | Nikon Eclipse Ti, A1R | 倒置荧光显微镜足以用于成像功能化微图案基底。 |
参考文献
- Senaratne, W., Andruzzi, L., Ober, C. K. Self-Assembled Monolayers and Polymer Brushes in Biotechnology: Current Applications and Future Perspectives. Biomacromolecules. 6 (5), 2427-2448 (2005).
- Hucknall, A., Kim, D. -H., Rangarajan, S., Hill, R. T., Reichert, W. M., Chilkoti, A.
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重印与许可
