制造复杂的栽培基质使用机器人微接触印刷（R-μCP）和顺序亲核取代

摘要

用生物配体的微尺度模式功能化的细胞培养底物在组织工程领域具有巨大的用途。在这里，我们展示了使用多个微图案聚乙二醇刷子制造组织培养基质的多功能和自动化制造，这些刷子呈现正交化学成分，可实现生物配体的空间精确和位点特异性固定。

摘要

在组织工程中，希望在微米尺度的培养中展示对组织形态和细胞命运的空间控制。呈现接枝聚乙二醇 （PEG） 刷的培养底物可用于通过创建微米级、无污染和抗细胞粘附区域以及细胞参与与共价栓系配体的生物特异性相互作用的区域来完成此任务。要使用此类底物设计复杂组织，有必要按顺序图案化多个 PEG 刷，这些功能化以赋予不同的生物活性，并在模拟体内生态位的微尺度方向上对齐。微触点打印 （μCP） 是一种通用的技术，用于对这种接枝 PEG 刷进行图案化，但手动 μCP 无法以微尺度精度进行。因此，我们将先进的机器人技术与软光刻技术和新兴的表面化学反应相结合，开发了一种机器人微接触打印 （R-μCP） 辅助方法，用于制造具有复杂、微量和高度有序的 PEG 刷图案的培养底物，呈现正交的"点击"化学。在这里，我们详细描述了制造此类基材的工作流程。

引言

的PEG接枝表面显示共价结合的配体的生化，同时保持固有的不污性能的能力，使他们为工程定制微观环境对培养基质^1,2,3的理想选择。通过配体结合的PEG介导刷的生物特异性相互作用使得在单个细胞的表型体内组织的微环境中的复杂的生物化学发现线索的作用还原论分析。此外，生物正交的“点击”化学方法可用来促进配体的定向固定化，使得它们在天然构象^4-6给出。因此，PEG的微观空间的图案笔刷是一个多功能的工具来创建设计师在体外龛调查引起的固定生化线索^6,7细胞信号转导。

产生生化立方米的空间格局的常用方法ES限嗣继承微接触印刷（μCP）镀金基板与PEG结合的烷基硫醇模式。然后，PEG-聚乙二醇化复合链烷硫醇的微图案化的自组装单分子层限制了生化分子， 例如，蛋白质的物理吸附，只在基板^8,9的非图案区域。然而，通过这种技术产生的自组装是在长期的细胞培养介质中对氧化敏感。因此，μCP'd硫醇自组装膜通常还采用表面引发的原子转移自由基聚合（SI-ATRP），以增加该地区的不污稳定性¹⁰接枝的PEG聚合物刷。具体地，微接触的烷基硫醇聚合引发剂，ω-meraptoundecyl溴异丁酸乙酯，对金涂覆的表面，随后由SI-ATRP的聚（乙二醇）甲基醚甲基丙烯酸酯（PEGMEMA）单体生成具有微图案化的长期，稳定，非表面结垢PEG刷。此外，这些能够被进一步修改，以呈现不同的化学部分^11。

以这个属性，沙等优势。人 。开发出一种方法来设计培养基质多组分PEGMEMA画笔呈现直角“点击”化学物质。在该方法中，他们使用了一系列的穿插顺序叠氮化钠，乙醇胺微接触/ SI-ATRP的步骤，和炔丙基胺的亲核取代来创建培养基材呈现多种固定化配体⁶的微型图案。而使用这样的化学品在与人工微接触结合来设计新的培养基材的电位是巨大的，它是由精度和准确度与多个微接触的步骤可以在一个单一的基片对齐的限制。将需要的精度和准确度水平高可再现地制造复杂中使用这些通用的技术体外龛。

e_content“>为了解决此限制，几个自动化和半自动化的微接触系统已经生成。轮穴等人开发出了微接触系统，其中定制邮票被放置在轨道系统和进入共形接触以使用金包被的载玻片一个计算机控制的气动致动器，然而，这种方法需要的定制邮票设计的精确制造，并报告有10微米的精度与执行多个微接触步骤^12，当所取得的精确度的报告。最近，利用集成的运动耦合系统的方法小于1微米的精度报告使用单个图案，但是无法准确地对准多个图案由于缺少精确控制从模具印模特征到模具^13上 。另外，两者的以前的方法所需要的基底图案形成步骤之间保持固定从而显著限制性的表面改性化学，可以是分集利用。在这里，我们描述了一种自动化的R-微接触系统能够对多个微接触步骤，准确和精确的对准，同时允许在邮票的设计和制造的灵活性最大。此外，图案化衬底可以重复从冲压件之间的体系中除去，从而允许使用各种不同的底物改性化学品，包括顺序的亲核取代。衬底使用这样的化学工程已被用于预先细胞培养由我们两人^6,14和其他^7。因此，我们已经合并的R-微接触和连续的亲核取代反应来开发用于培养基材的复杂和微图案化的生化线索可伸缩的制造方法。

方案

1.生成弹性邮票

1. 要生成PDMS印章的硅大师，采用计算机辅助设计软件设计的光罩的功能模式。
   1. 设计的第一图案为20×20阵列的环的具有300μm的内径（ID）和600微米的外径与1200微米的中心到中心的间距。
   2. 设计第二图案作为20×20阵列的环带600微米的ID和900微米外径与1200微米的中心到中心的间距。
   3. 此外，将1×1 ^平方毫米平方的参考标记在所有四个角的每个阵列的设计间隔1200微米的中心到中心的距离的角图案中的45°角。
   4. 制造硅的主人用于本实验中，用1：1的长宽比，使用与微流体铸造别处¹⁵或协作详述标准光刻技术关联到一个300微米的特征深度。
      注：功能深度小于100微米的可导致与基材表面接触之前，邮票异常变形。
      注：此协议首先在已经得到的硅大师与光致抗蚀剂的叙述模式，这需要专门的设备和洁净室创建。这是最好的一个制作者或核心设备来创建这些图案高手请教。
2. Silanize硅大师O / N通过孵育（十三-1,1,2,2-tetrahydroocty）三氯硅烷的蒸气。
   注：硅烷的蒸气有剧毒，只应在通风橱处理。
3. 1比率的PDMS预聚物和PDMS在60℃下固化的硅烷化硅的主人的顶部剂在培养皿中O / N的：通过固化10创建的硅主人的逆复制品。
4. 从硅主人除去PDMS压模，并粘接邮票到丙烯腈 - 丁二烯 - 苯乙烯（ABS）的背衬或任何其他刚性材料S使用胶水。
   注意：选择的材料不需要是透明的或生物相容的。但是，它必须与所述机器人的工具和更高的刚性比PDMS的接口提供一个平坦的表面。

2.准备Coverslides

1. 漂洗显微镜coverslides在甲苯，甲醇和超声处理在丙酮中为下一个温和的氮气流中，用乙醇冲洗并干燥前1分钟（1 24毫米×50毫米＃）。
   注：只有在通风橱处理甲苯和丙酮。
2. 外套coverslides以〜3.5 nm的钛（Ti），然后通过使用聚焦的电子束蒸发器18.0纳米的金（Au）。
   注：此步骤是用各种金涂覆的基材包括硅和聚苯乙烯兼容。而有可能在现场产生这些，金涂覆的基材也可通过商业供应商。
   注：钛层至少应为3纳米厚，而在衬底上的Au层应该是一个吨至少5纳米厚和范围可以全部在厚度为1mm取决于最终衬底^16,17的理想的光学特性的方式。衬底不需要是用于制造光学透明的;然而，它便于制造基板的微观分析。
3. 在即将使用前冲洗镀金coverslides温和氮气下乙醇和干燥。

3. R​​-μCP外环的

1. R-μCP与选择标准的多关节机器人臂（SCARA）系统之前，校准使用系统软件的机器人工具效应和相应的双摄像头系统。
   注意：这些工具被描绘在图1中。

图1. R-μCP系统和机械臂工具。 >（A）R-μCP系统的所有工装夹具大型看法，（一）真空吸盘，（二）试剂槽，（三）朝下的摄像头，（四）邮票嵌套夹具，（E）的机器人工具。 （B）中的机器人臂的工具描绘（六）金刚石尖蚀刻工具和（g）气动吸尘工具保持将a（h）的ABS支持的PDMS压模。

2. 手动将600微米的ID和900微米OD突出的环在邮票嵌套夹具朝下一个PDMS印章。手动放置一个刚清洗干净的金涂覆coverslide上的真空吸盘，在图1A中显示的顶部，并使用该连接的实验室真空固定它。
3. 使用机械手的控制，对准朝下的相机在镀金coverslide的中心点，如在图2A中 。
   注：此点最初可通过目视检查而定义的，并不需要很高的精度，由于PDMS压模得多LARG尔比的涂覆金的滑动。
4. 指示机器人臂以蚀刻四个参考的“X”标记，在一个正方形的尺寸为顶点3.8毫米由3.8毫米集中在使用连接到机器人臂的金刚石尖蚀刻工具的镀金coverslide。 （示于图2B;自动化的过程）
   注：这将确保所有四个参考点都在朝下的摄像头之一的视觉框架。
5. 使用机器人气动吸工装，接机，并保持PDMS印章1毫米上面的邮票嵌套夹具， 如图2C。 （自动化过程）
6. 利用朝上的摄像头和LED照明环描绘在图2D和E，可视化的印模的正方形的参考标记，并确定它们与照相机软件10倍，以确定所述时间戳的平均的X，Y，和从该中心的角度偏移机器人工装轴。 （自动化过程）
7. 作为注意：一个内部计算由所述机器人系统的软件进行精确地对准印模的和盖玻片的X，Y中心位置和角度偏移量中的未来的R-微接触的步骤。
8. 3.8）放置在链烷烃硫醇的ATRP引发剂，ω-mercaptoundecyl溴异丁酸乙酯（2毫摩尔的乙醇浴中的邮票），如在图2F中描绘。 （自动化过程）
9. 从链烷醇溶液除去印模，并将其放置在加压到0.48巴（5 psi）的氮气流中蒸发乙醇， 如图2G。 1分钟后增加的氮气流的压力为1.03巴（15磅），以确保均匀的干燥。 （自动化流程）
   注：不完全干燥会导致图案逼真的全部或部分损失。
10. 干燥后，将印模在镀金滑动的所计算出的中心位置，并降低其在100微米为增量，同时监测Z轴马达力， 如图2H所描绘。
    注意：此连通的扭矩通过Z轴电机经历和在所述机器人指导软件显示。 （自动化过程）
11. 停止降低一次的79.2千帕的预定压力已经达到印模，并保持与镀金的滑动，持续15秒的接触。 （自动化过程）
    注：该压力值以下是目前邮票的设计和功能的高度优化。如果印模设计改变，特别为高纵横比的邮票，调整这些相应地通过尝试和错误的过程。
12. 慢慢地除去从镀金滑动印模和放置印章背面的印章嵌套夹具。 （自动化过程）

PEGMEMA对微模式Coverslides 4 SI-ATRP

1. 释放真空压力保持在微图案化coverslide，并将其转移到50毫升的Schlenk烧瓶中。用真空泵密封和脱气的Schlenk烧瓶中。
2. 添加5.5含大分子单体PEGMEMA（208.75毫摩尔），水（34.4毫升），甲醇（43.8毫升），铜（II）溴化物（1毫摩尔），和2'，2-联吡啶（3毫摩尔）的原子转移自由基聚合反应混合物中的溶液在Schlenk烧瓶中。
3. 加入0.5毫升的L-抗坏血酸钠（454.3毫摩尔）的水，使反应开始，并允许它继续16小时，在室温下惰性气体。
   注：在加入的L-抗坏血酸钠，反应颜色由浅绿色转变为暗棕色， 如图3A-B中。
   注意：该反应可以继续超越16小时，但它不会显著增加的PEG刷子的长度。

图3.启动SI-ATRP的。（A）的反应和（B）以后的颜色变化如下添加L-抗坏血酸钠的启动。微图案化coverslide表面以下的SI-ATRP过程中（C）显微图像。比例尺1mm以下。

4. 从申克烧瓶中取出微图案coverslide并用乙醇，水，以及乙醇和干燥下温和氮气流冲洗。
   注：下面的SI-ATRP，表面修饰应肉眼可见的，并在显微镜下进行成像和分析， 如图3C所示 。
   注：这是测试试验的精确度，因为它省却了免疫染色基板的最简单的方法。

的微模式PEGMEMA链5.叠氮化物官能

1. 放置在20毫升玻璃反应管形瓶中的微图案化coverslide。
2. 加入6毫升N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中含有100mM氮化钠的反应小瓶。保持该反应在37℃下放置24小时。
   注：只有在通风橱处理DMF。称出叠氮化钠时请务必小心。
3. 完成后，除去从反应小瓶的微图案化coverslide和冲洗用在氮气流中的乙醇，然后用水和干燥。

6.钝化溴官能PEGMEMA链

1. 放置在20毫升玻璃反应瓶微图案coverslide。
2. 加入6毫升含有100毫乙醇胺和300mM的三乙胺的反应小瓶二甲亚砜（DMSO）中的。保持该反应在40℃下放置24小时。
   注意：只有在化学通风橱中处理的DMSO，乙醇胺，三乙胺等。
3. 完成后删除该微图案化coversl从反应小瓶的ide，冲洗用在氮气流中的乙醇，然后用水和干燥。

7. R-μCP内环和PEGMEMA的SI-ATRP

1. 开展R-μCP步骤如前面步骤3.2和3.6描述 - 3.12，与300微米的ID和600微米OD突出的环，使得具有较小的特点的环都放在前面微图案的环内代以PDMS印章。
   注：此邮票的压力阈值是132.0千帕。如前面所提到的，这些压力设置为在该实验中所使用的印模特征优化。
2. 开展SI-ATRP步骤如前面的步骤描述4.1 - 4.4。

的微模式PEGMEMA链8.乙炔官能

1. 放置微图案coverslide在20毫升玻璃反应瓶中。
2. 加6毫升DMSO含100毫米炔丙基胺的反应小瓶。保持此反应混合物在室温放置24小时。
   注：仅在通风橱处理DMSO和炔丙基胺。
3. 完成后除去从反应小瓶的微图案化coverslide和冲洗用在氮气流中的乙醇，然后用水和干燥。

9.铜催化的“点击”乙炔的生物素化终止PEGMEMA链

1. 放置微图案coverslide在20毫升玻璃反应瓶中。
2. 添加6毫升硫酸铜（15毫摩尔）/三[（1-苄基 -1H- 1,2,3-三唑-4-基）甲基]胺（TBTA，30毫摩尔）的（1:1体积/体积的水/ DMF）中含有562μM的叠氮基的PEG ₄ -生物素偶联物的反应小瓶。在水中添加加入1.2ml L-抗坏血酸（0.15毫摩尔）至混合物中，以初始化该反应。
3. 通过10秒的反应液中的氮泡，用封口膜密封的小瓶，并24小时在室温下反应。
4. 当completion个反应瓶中取出微图案化coverslide，用清水冲洗干净，并放置在一个12孔聚苯乙烯菜。

10.免疫荧光检测生物素化乙炔组

1. 1小时在室温块DPBS（3％驴血清）微图案化coverslide。染色为生物素化的乙炔基团与链霉亲和546结合物（2微克/毫升）在DBPS（3％驴血清的PBS中）处理2小时，在室温。
2. 冲洗微图案coverslide 5次用DPBS 10分钟，温和搅拌。
   注： 图4B中示出了滑动的图像后，此步骤就完成了。

11.无铜“，点击”叠氮的生物素化终止PEGMEMA链

注：如果需要的话，该底物修饰步骤可以在原位细胞培养过程中进行的。

1. 离开微图案化coverslide在12孔Polystyrene盘以下DBPS​​冲洗。
2. 加2 ml DBPS（或细胞培养基）中含有20μM的DBCO-PEG ₄ -生物素，并且允许该反应继续进行24小时，在室温（或37℃的培养箱）。
3. 完成后，冲洗微图案化coverslide 5次DPBS（或者干脆进行媒体的变化）。

12.免疫荧光检测生物素标记的叠氮基团的

1. 染色为生物素化的叠氮基团与链霉亲和488结合物（2微克/毫升）在2毫升的DPBS（3％驴血清）培养2小时，在室温。
2. 冲洗微图案coverslide 5倍于DPBS中10分钟，温和搅拌。
3. 图象微图案coverslide使用共聚焦荧光显微镜。 图4A-C示出了该幻灯片的图片在此步骤之后完成。
   注意：当进行组织培养试验用基板，跳过第10及该协议第12条。所需degre后ê官能化，通过在氮气流下漂洗两面用100％乙醇和烘干消毒工程coverslide。幻灯片转移到无菌的生物安全柜，并继续进行细胞接种和培养前冲洗幻灯片，用PBS五倍。

结果

使用手动调整μCP技术工程师培养基质与功能化正交PEG接枝画笔数组“点击”化学品已被证明在以往的工作^6。然而，这提供的图案取向最小控制和通常导致功能化区域的重叠。这里，一个新颖的R-微接触系统被用于克服此限制，并且它能够准确图案的聚乙二醇刷的环用300微米的ID和600μm的外径呈现末端炔基的聚乙二醇刷的环单独的阵列中与600微米的阵列ID和900微米OD呈现终端叠氮基团被证实^14。以下炔呈递PEG的反应刷与叠氮化-PEG ₃ -生物素和叠氮化物的呈递的PEG反应用刷子DBCO-PEG ₄ -生物素，将基板进行免疫染色用荧光探针，并用共聚焦显微镜成像（六igure 4）。使用计算出的一个自定义的MATLAB程序，这些图像的分析，这两个PEG刷阵列分别对准子10微米的精度， 即X〜6.4微米，y〜1.7微米，θ〜0.02°，这是在制造商的引用极限我们的SCARA模型（ 即约10微米），并指示R-μCP系统的性能前^14。因此，我们...

讨论

理想的基质用于组织工程将仿生并由此概括的天然组织中发现的关键的生物活性配体的空间分布。他们也将具有动态属性，使配体的时间调整，并且在它们出现，以允许定向组织形态发生和空间上的限制诱导细胞命运的分布模式。这种基材的制造需要在衬底上复杂和高度有序取向多种生化线索的固定。虽然模拟细胞的小生境所有的内源性因素在体外是不合理的，这里所描述的R-μCP系统允许的正交生物活性化学物质与空间定位的微观控制多个区域的固定化。

这些底物的增加的效用进一步考虑到，而PEG画笔数组绑定固定配时能够引起生物特异性相互作用，未结合的PEG电刷保持抗蛋白质吸附，因而可用于控​​制细胞的粘附和迁移。虽然细胞外基质（ECM）蛋白或聚合物-PEG偶联物的被动，微图案化的吸附是控制细胞粘附和迁移更简单的方法，这些技术只提供短暂控制，因为吸附是一个可逆的过程^11。此外，分子吸附在不可预知的方向的表面和随意的浓度，从而限制了保真度和生物特异性相互作用的控制。此外，化合物通常用于创建不污的区域，如牛血清白蛋白或的Pluronic F127，不具有指定的反应位点为进一步官能限制性吸附后<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
斯卡拉			可提供具有更高精度的高端型号。
（十三氟-1,1,2,2-四氢辛基）三氯硅烷	凝胶	SIT8174.0	注意，只能在化学通风橱中处理。硅烷化硅片时，在所有硅烷蒸发之前，任何人都不应进入通风橱。
Sylgard 184 硅胶弹性体套件	Ellsworth Adhesive Co	NC9020938	使用前通过真空暴露对溶液进行彻底脱气。试剂盒 182 等替代试剂盒是可接受的。
24 mm x 50 mm #1 盖玻片	Fisher Scientific	48393106	这些可以从许多供应商处购买，尺寸各不相同，以满足需要。
CHA-600 Telemark 电子束蒸发器	Telemark	SEC-600-RAP	需要专业培训。
爱普生 LS3 SCARA	爱普生	LS3-401ST&
omega;-mertcapto十一烷基溴异丁酸	Prochimia	FT 015-m11-0.2	储存在 -20 &°C。其他 ATRP 启动器可用作此 R-μCP 平台适用于所有微图案模式。
Schlenk 管瓶 50 ml	Synthware	60003-078	需要带隔膜的橡胶塞。
聚（乙二醇）甲基丙烯酸甲醚	Sigma Aldrich	447943	发货时含有不含 MEHQ 和 BHT 的制备抑制剂。
甲醇（ACS 认证）	Fisher Scientific	A412-4	注意，只能在化学通风橱中处理。
溴化铜 （II）	Sigma Aldrich	437867	注意，用外科口罩限制接触。
2,2'-联吡啶	Sigma Aldrich	D216305	注意，用外科口罩限制暴露。
L-抗坏血酸钠	Sigma Aldrich	A4034
20 ml 硼硅酸盐玻璃闪烁瓶	Fisher Scientific	03-340-4E
叠氮化钠	Sigma Aldrich	S2002	注意，用外科口罩限制暴露。
N，N-二甲基甲酰胺	Sigma Aldrich	227056	注意，只能在化学通风橱中处理。
乙醇胺	Sigma Aldrich	398136	注意，只能在化学通风橱中处理。
三乙胺	Sigma Aldrich	T0886	注意，只能在化学通风橱中处理。
二甲基亚砜	Sigma Aldrich	276855	注意，只能在化学通风橱中处理。
丙酰氨基	Sigma Aldrich	P50900	注意，只能在化学通风橱中处理。
200 Proof Ethanol	University of Wisconsin Material Distribution Services	2292	注意，只能在化学通风橱中处理。
叠氮化物-PEG3-生物素	点击化学工具	AZ104-100	溶于 DMF
硫酸铜 （II）	Sigma Aldrich	C1297	注意，用外科口罩限制接触。
三[（1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基）甲基]胺 （TBTA）	Sigma Aldrich	678937
L-抗坏血酸	Sigma Aldrich	A7506
磷酸盐缓冲剂	盐水 Invitrogen	14190144
驴血清	Sigma Aldrich	D9663	驴血清污染的物品被视为生物危害性物质，应予以处理。还有各种其他化合物（例如 BSA）可用于此目的。
12 孔聚苯乙烯板	Thermo Scientifit - NUNC	07-200-81	板可从多家供应商处购买，尺寸各不相同。
DBCO-PEG4-生物素	Clickchemistytools	A105P4-10	溶于DMF
链霉亲和素、Alexa Fluor 488偶联物	Life Technologies	S-11223	于PBS
链霉亲和素、Alexa Fluor 546偶联物	Life Technologies	S-11225	于PBS
Nikon A1-R共聚焦显微镜 Nikon Nikon		Eclipse Ti、A1R	落射荧光显微镜足以对功能化的微图案基材进行成像。