本文介绍了一种利用荧光测定法定量分析贴壁巨噬细胞系吞噬荧光颗粒的实验方案。该方法可实现对颗粒内化及伴随发生的肌动蛋白聚合的高通量定量分析。
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本文内容
摘要
摘要
荧光分析法的目的是作为一种高效、低成本、高通量的方法，用于分析吞噬作用及其他细胞过程。该技术可用于多种细胞类型，包括贴壁和非贴壁细胞，以检测多种细胞特性。在研究吞噬作用时，荧光技术利用吞噬性细胞类型（如巨噬细胞）以及经荧光标记的调理颗粒，这些颗粒的荧光可在台盼蓝存在下被淬灭。将贴壁巨噬细胞接种于96孔板后，加入荧光颗粒（绿色或红色），并允许细胞进行不同时间长度的吞噬。在荧光颗粒被内化后，用台盼蓝洗涤细胞，从而淬灭未被内化或仅黏附于细胞表面的细菌所产生的荧光信号。台盼蓝洗涤后，细胞用PBS洗涤，固定，并用DAPI（细胞核蓝色荧光标记）染色，以标记细胞核。通过简单的荧光定量读板，检测细胞核（蓝色）或颗粒（红色/绿色）的荧光强度，可计算绿色与蓝色荧光相对荧光单位的比值，进而确定反映每个细胞内化荧光细菌数量的吞噬指数。采用96孔板法并使用多通道移液器进行洗涤时，从吞噬结束到数据采集完成的整个实验耗时少于45分钟。流式细胞术也可用于类似目的，但荧光定量法的优势在于其高通量、快速评估能力，对样本操作最少，并能快速量化单个细胞的荧光强度。类似策略也可应用于非贴壁细胞、活体标记细菌、肌动蛋白聚合，以及任何基于荧光的细胞过程。因此，荧光定量法因其低成本和高通量能力，在细胞过程研究中具有广阔的应用前景。
引言
荧光信号的定量分析已广泛应用于多种科学方法中，包括PCR、流式细胞术、共聚焦显微镜、FRET分析以及多重ELISA。荧光成像与定量具有广泛的应用，是研究各种细胞过程的有力工具。过去十年中，荧光标记物及其信号的应用取得了革命性进展，荧光酶标仪的出现进一步推动了细胞过程中发射荧光的高通量定量分析。
荧光分析法可作为定量吞噬作用的有力工具。自梅契尼科夫于1800年发现吞噬细胞以来，吞噬作用便一直是研究对象1。多年来，已有多种方法被用于研究这一对先天免疫防御入侵的细菌、病毒、真菌和寄生虫病原体至关重要的过程2-5。早期的定量方法依赖显微镜观察和体视学技术来可视化正在吞噬的细胞，随后通过计数被内化的颗粒（手动或借助软件）进行定量分析6-8。仅使用显微镜进行定量分析的一些缺点包括：人工计数细菌耗时费力，且更容易受到观察者偏倚的影响。另一种用于定量吞噬作用的方法是微生物学技术，即在吞噬作用发生后，将细胞裂解液中的细菌接种到细菌培养板上进行培养，但该方法无法准确反映杀菌机制以及部分内化细菌的存在情况。与显微镜法相比，该方法更加耗时，且分析过程需要数天时间。流式细胞术似乎是目前最快、最有效的吞噬作用定量方法，已被多个研究团队广泛采用9-11，但该方法所需的仪器通常价格昂贵，因此与前述检测方法相比，成本最高。
荧光测定法是分析颗粒内化的良好替代方法，因为....
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方案
注意：本方案可用于多种应用，例如吞噬作用和肌动蛋白聚合的定量分析，具体应用见我们先前发表的研究12。该方案具有多种可修改性，表1列出了以往研究中成功使用过的细胞类型和颗粒。图1展示了本方案在吞噬作用或肌动蛋白聚合定量分析中的标准应用流程。
图1：用于定量吞噬作用和肌动蛋白聚合的荧光测定示意图。 细胞接种、处理并贴壁后，加入带有绿色荧光标记（FITC）的颗粒以进行吞噬。通过台盼蓝或抗生素洗涤（以去除未被内化的颗粒）终止反应，并使用4%多聚甲醛固定细胞。随后用红色荧光标记的肌动蛋白染料（罗丹明鬼笔环肽）和蓝色荧光染料（DAPI）对细胞进行染色。吞噬作用和肌动蛋白聚合的指数通过绿色/蓝色（FITC/DAPI）或红色/蓝色（罗丹明/DA....
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结果
通过本方案定量吞噬作用及其后续肌动蛋白聚合的两种主要方法是观察连续性或同步化的吞噬作用。
显微镜分析（图1B）展示了与荧光计所记录结果相类似的荧光图像（另见示意图1）。图1B中显示了肌动蛋白的红色荧光、FITC标记的HKOP E. coli的绿色荧光、细胞核的DAPI染色，以及上述三种荧光染料的合并图像。该图像表明吞噬作用有效发生、肌动蛋白发生聚合，且对未被内化的颗粒实现了有效的锥虫蓝淬灭。
如图2A和图2C所示，J774细胞对调理化和非调理化颗粒的持续吞噬作用相当。有趣的是，调理化吞噬后肌动蛋白聚合增加，但在较晚的时间点增速减缓（图2B），而非调理化颗粒内化后的肌动蛋白聚合则未见增加（图2D）。在今后研究这些过程时需重视这一点，因为与非调理化颗粒的内化相比，调理化吞噬可引发更强的肌动蛋白聚合。通过MTT分析.......
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讨论
荧光测定技术的主要局限性在于实验变异，以及与大量洗涤和使用非贴壁细胞相关的细胞损失。
观察到的差异主要源于荧光颗粒本身的变异性，因为在配制储备液时，称量和移液操作无法精确保证每次实验所用颗粒数量完全相同。为解决实验间变异的问题，数据可用相对形式表示，例如以吞噬百分率（% phagocytosis）或相对于对照组的倍数变化（fold change from control，对照组 — t = 0；加入颗粒后立即去除）来表示。此类分析方法可产生可重复的趋势，且不同实验之间的对照组吞噬百分率数值相近。采用此类数据分析方式，仅需3至6次实验重复即可实现统计学显著性。尽管荧光测定技术本身存在一定变异性，但通过适当的数据分析，仍可有效检测并重现观察到的趋势。在熟练掌握该技术后，单名科研人员一天内可完成约六块96孔板，即600个处理组的实验操作。
在非贴壁细胞类型的研究中，细胞丢失现象普遍存在。贴壁细胞类型最适合用于此类方法，因为它们能够耐受多次且彻底的洗涤步骤。
为防止荧光组分发生光.......
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披露
作者不存在相互竞争的经济利益。
致谢
作者谨此感谢以下资助来源：RO1 DA 12104、RO1 DA 022935、RO1 DA031202、K05DA033881、P50 DA 011806、1R01DA034582（资助 S.R）以及 F31 DA026264-01A1、T32 DA07097（资助 J.N.）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 μm 黄绿色荧光 Fluo-Spheres； | Molecular Probes | F8852 | 使用前在 37oC 下将 50μl 与 50μl 调理试剂混合孵育 30 分钟 |
| 热灭活E. coli 生物颗粒-荧光素偶联物 | Molecular Probes | E2861 | 使用前将 5 mg 溶于 50 μl PBS 中，并与 50 μl 调理试剂混合，在 37 °C 孵育 30 分钟 |
| 调理试剂 | Molecular Probes | E2870 | |
| 罗丹明-鬼笔环肽 | Molecular Probes | R415 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 台盼蓝 | Gibco | 15250-061 | |
| 以下试剂有多个品牌可选，本研究所使用的产品来自以下制造商： | |||
| RPMI 细胞培养基 | Gibco | 添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素；使用前在 37 °C 预热 | |
| 荧光酶标仪 - Fluostar Omega | BMG Labtech | ||
| 多聚甲醛（16%） | Fischer Scientific | AA433689M | 使用前稀释至 4% |
| 96 孔板 | Greiner | 655097 | 透明、黑色或透明底黑色板 |
| 多通道移液器（8 - 12 通道） | |||
| 试剂储液槽 | |||
| 1× PBS | |||
| 微量离心管（0.6 ml） | |||
| 锥形离心管（10 ml） |
参考文献
- Murphy, K. Janeway's Immunobiology. , 8th edn, Garland Science. New York, NY. (2012).
- Burke, D. W., O'Connor, D. O., Zalenski, E. B., Jasty, M., Harris, W. H. Micromotion of cemented and uncemented femoral components. The Journal Of Bone And Joint Surgery. British Volume. 73 (1), 33-37 (1991).....
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