高通量荧光测定法评估巨噬细胞吞噬作用与肌动蛋白聚合

摘要

本文介绍了一种利用荧光测定法定量分析贴壁巨噬细胞系吞噬荧光颗粒的实验方案。该方法可实现对颗粒内化及伴随发生的肌动蛋白聚合的高通量定量分析。

摘要

荧光分析法的目的是作为一种高效、低成本、高通量的方法，用于分析吞噬作用及其他细胞过程。该技术可用于多种细胞类型，包括贴壁和非贴壁细胞，以检测多种细胞特性。在研究吞噬作用时，荧光技术利用吞噬性细胞类型（如巨噬细胞）以及经荧光标记的调理颗粒，这些颗粒的荧光可在台盼蓝存在下被淬灭。将贴壁巨噬细胞接种于96孔板后，加入荧光颗粒（绿色或红色），并允许细胞进行不同时间长度的吞噬。在荧光颗粒被内化后，用台盼蓝洗涤细胞，从而淬灭未被内化或仅黏附于细胞表面的细菌所产生的荧光信号。台盼蓝洗涤后，细胞用PBS洗涤，固定，并用DAPI（细胞核蓝色荧光标记）染色，以标记细胞核。通过简单的荧光定量读板，检测细胞核（蓝色）或颗粒（红色/绿色）的荧光强度，可计算绿色与蓝色荧光相对荧光单位的比值，进而确定反映每个细胞内化荧光细菌数量的吞噬指数。采用96孔板法并使用多通道移液器进行洗涤时，从吞噬结束到数据采集完成的整个实验耗时少于45分钟。流式细胞术也可用于类似目的，但荧光定量法的优势在于其高通量、快速评估能力，对样本操作最少，并能快速量化单个细胞的荧光强度。类似策略也可应用于非贴壁细胞、活体标记细菌、肌动蛋白聚合，以及任何基于荧光的细胞过程。因此，荧光定量法因其低成本和高通量能力，在细胞过程研究中具有广阔的应用前景。

引言

荧光信号的定量分析已广泛应用于多种科学方法中，包括PCR、流式细胞术、共聚焦显微镜、FRET分析以及多重ELISA。荧光成像与定量具有广泛的应用，是研究各种细胞过程的有力工具。过去十年中，荧光标记物及其信号的应用取得了革命性进展，荧光酶标仪的出现进一步推动了细胞过程中发射荧光的高通量定量分析。

荧光分析法可作为定量吞噬作用的有力工具。自梅契尼科夫于1800年发现吞噬细胞以来，吞噬作用便一直是研究对象¹。多年来，已有多种方法被用于研究这一对先天免疫防御入侵的细菌、病毒、真菌和寄生虫病原体至关重要的过程^2-5。早期的定量方法依赖显微镜观察和体视学技术来可视化正在吞噬的细胞，随后通过计数被内化的颗粒（手动或借助软件）进行定量分析^6-8。仅使用显微镜进行定量分析的一些缺点包括：人工计数细菌耗时费力，且更容易受到观察者偏倚的影响。另一种用于定量吞噬作用的方法是微生物学技术，即在吞噬作用发生后，将细胞裂解液中的细菌接种到细菌培养板上进行培养，但该方法无法准确反映杀菌机制以及部分内化细菌的存在情况。与显微镜法相比，该方法更加耗时，且分析过程需要数天时间。流式细胞术似乎是目前最快、最有效的吞噬作用定量方法，已被多个研究团队广泛采用^9-11，但该方法所需的仪器通常价格昂贵，因此与前述检测方法相比，成本最高。

荧光测定法是分析颗粒内化的良好替代方法，因为它能够使用成本较低的设备对荧光进行无偏定量。荧光测定法的其他优势还包括高效率以及高通量能力，可用于定量标记的内化颗粒所发射的荧光。

荧光测定法的优势可推广至吞噬作用以外的其他过程的定量分析。例如，荧光分析可用于研究任何导致细胞内或膜结合受体表达变化、细胞通透性/活力变化、转染效率以及肌动蛋白聚合调节的过程。荧光技术的一个缺点是，根据所使用的标记物不同，实验间可能存在较高的变异性，通常可通过相对定量方式（如相对于对照组的倍数变化或百分比增加）展示数据来解决这一问题。

方案

注意：本方案可用于多种应用，例如吞噬作用和肌动蛋白聚合的定量分析，具体应用见我们先前发表的研究¹²。该方案具有多种可修改性，表1列出了以往研究中成功使用过的细胞类型和颗粒。图1展示了本方案在吞噬作用或肌动蛋白聚合定量分析中的标准应用流程。

图1：用于定量吞噬作用和肌动蛋白聚合的荧光测定示意图。 细胞接种、处理并贴壁后，加入带有绿色荧光标记（FITC）的颗粒以进行吞噬。通过台盼蓝或抗生素洗涤（以去除未被内化的颗粒）终止反应，并使用4%多聚甲醛固定细胞。随后用红色荧光标记的肌动蛋白染料（罗丹明鬼笔环肽）和蓝色荧光染料（DAPI）对细胞进行染色。吞噬作用和肌动蛋白聚合的指数通过绿色/蓝色（FITC/DAPI）或红色/蓝色（罗丹明/DAPI）荧光的相对荧光单位比值进行定量。

1. 细胞铺板与处理

注意：开始之前，建议每种处理至少设置4个技术重复，并在板布局中包含以下对照：仅有细胞（未染色、仅含DAPI或仅含罗丹明）和仅有颗粒。

1. 在步骤1-4中，所有试剂的添加操作均须在无菌细胞培养罩内进行，以防止样品受到污染。
2. 将巨噬细胞（小鼠J774细胞系）以每孔50 μl含1-5 × 10⁴个细胞的密度接种于96孔板中，使用预热的完全培养基。本方法推荐使用黑色96孔板，底部可为透明或黑色，具体选择取决于酶标仪的检测能力。
   1. 完全培养基的配制：添加10%热灭活胎牛血清（FBS），以避免补体级联反应的干扰；添加1%青霉素/链霉素（若吞噬实验中不使用活菌）。若使用贴壁细胞，需静置孵育1-2小时以促进细胞贴壁；若为非贴壁细胞，则以500 × g离心10分钟使细胞沉降。
3. 加入终浓度为2倍的待测激动剂/拮抗剂或溶剂对照（用PBS或更优选用完全培养基重悬），每孔50 μl，使最终体积为100 μl（终浓度为1倍），随后根据实验需求孵育相应时间。使用多通道移液器和试剂储液槽可显著提高操作效率。

2. 荧光颗粒的调理作用

表 1：吞噬作用和肌动蛋白聚合荧光分析中测试的细胞类型与荧光颗粒。 表 1 展示了本课题组通过荧光分析方法所使用的细胞类型（细胞系和原代细胞）与荧光颗粒的组合。除了利用野生型细胞检测吞噬作用和肌动蛋白聚合外，我们还使用部分颗粒检测转染表达GFP（绿色荧光蛋白）细胞的吞噬功能。此外，转染含有荧光报告基因质粒的细胞所产生的荧光也可作为细胞标记物，与DAPI联合使用。 表注： A - 肌动蛋白聚合；P - 吞噬作用；PT - GFP标记转染细胞的吞噬作用；OPDex - 包被调理素的葡聚糖微球；HKOP - 经热灭活的包被调理素颗粒。

1. 在处理、洗涤以及孵育过程中，务必始终将荧光颗粒和标记物避光保存，以防止光漂白
   1. 对于干燥的颗粒，根据生产商的说明称取荧光标记的热灭活调理化（HKOP）细菌（E2861：E. coli K-12 菌株），注意确保质量能够达到 10:1 - 20:1 的细菌:细胞比例（或至少 10:1 的比例——该比例常用于吞噬作用的定量分析）^13,14。颗粒数量可由生产商提供，或通过计数 1 mg/ml 储存液的系列稀释液来确定。
   2. 将颗粒重悬于 50 μl PBS 中，并在最高速度下涡旋振荡 1 分钟。确保充分涡旋（本步骤及后续所有步骤中均需如此），因为颗粒容易发生聚集，可能影响调理化效果。
   3. 对于悬浮状态的颗粒（如荧光标记的葡聚糖微珠，DEX 微珠），将储存液涡旋振荡 1 分钟，取 50 μl 悬浮液，或根据微珠浓度调整体积，以确保达到 10:1 的微珠:细胞比例。
2. 向颗粒中加入等体积的调理试剂，并剧烈涡旋振荡 1 分钟。
3. 将颗粒与调理试剂在 37 °C 下孵育 1 小时。
4. 孵育结束后，以 500 × g 离心 5 分钟，弃去含有过量调理试剂的上清液。加入 100 μl PBS 洗涤颗粒，涡旋振荡以重悬沉淀，再以 500 × g 离心 5 分钟。
   1. 重复上述步骤两次，以确保充分调理并去除未结合的抗体。
5. 将调理后的颗粒重悬于 5 ml 培养基中，配制成工作液（足以用于一块 96 孔板），避光保存，直至加入细胞。

3. 吞噬作用

1. 将颗粒的工作液置于无菌试剂储液槽中。从此处向步骤 1中准备好的细胞加入 50 μl 经调理的颗粒（终浓度为 50 ng/ml），并在标准细胞培养条件下进行吞噬作用。下图展示了两种可通过本方法评估的吞噬作用方式（图 2）。

图2：持续性吞噬与同步化吞噬的比较。持续性吞噬是指颗粒随时间缓慢沉降到孔板底部细胞表面，细胞持续不断地将其内化。而通过同步化步骤（离心）可迫使颗粒迅速沉降至底部，增加颗粒与细胞的接触，从而触发细胞立即内化颗粒。同步化吞噬是一种更快速的过程，由于细胞与颗粒之间的接触增加，颗粒被内化的速度显著加快。

1. 1. 对于连续吞噬法（图2），该方法允许细胞在调理过的细菌缓慢沉降至底部并与细胞接触的过程中持续吞噬细菌，应采用较长的时间范围，以使细菌能够到达孔底并与细胞接触。若进行时间进程实验，可在不同时间间隔加入细菌，但所有反应孔在同一时间终止，以提高处理速度。
   2. 对于同步吞噬法（图2），该方法通过离心增强颗粒与细胞的接触，一旦将颗粒加入含细胞的孔板中，立即对整块孔板进行离心（500 × g，5分钟），以实现所有时间点的同步，并加速颗粒与细胞的相互作用。
      1. 从离心步骤完成后立即开始计时。若进行时间进程实验，应按照下述方法在不同时间间隔分别终止各个时间点的反应。

注意：与之前的方法相比，同步吞噬法虽然操作稍显繁琐，但可在更短时间内获得更高的吞噬指数。

4. 终止吞噬作用

1. 对于贴壁细胞，吸除上清液，并加入50 μl用PBS稀释的台盼蓝（1:2稀释），以淬灭未被内化的细菌的荧光。
2. 对于非贴壁细胞，离心培养板并吸除上清液，然后加入50 μl稀释的台盼蓝。每次洗涤后需将培养板离心（500 × g，5–10分钟），以尽量减少细胞丢失并确保充分洗涤。
3. 台盼蓝孵育后，用PBS洗涤细胞两次，以去除残留的台盼蓝（直至从孔中移除的PBS变为澄清）。研究表明，台盼蓝可淬灭未被内化的、荧光标记的热灭活细菌颗粒的荧光^15,16，但对活细菌或OPDex微球无此作用。对于活细菌，应使用含抗生素（如青霉素、链霉素或庆大霉素）的洗涤步骤替代台盼蓝洗涤，以避免未被内化的颗粒产生荧光干扰。
4. 加入100 μl 4%多聚甲醛固定细胞，在室温孵育15分钟，然后用PBS洗涤（每次每孔100 μl）。此步骤后可将细胞在4 °C保存最多一周，或直接进行染色与定量。
   注意：自此步骤起，后续所有操作均可在细胞培养超净台外进行。
5. 吸除所有液体，每孔加入50 μl用PBS配制的5 ng/ml DAPI溶液，染色5分钟，然后用PBS洗涤两次。洗涤后，每孔加入50 μl PBS，并记录吞噬情况。

5. 肌动蛋白染色

注意：除了吞噬作用外，荧光测定法还可通过检测肌动蛋白的强度来定量肌动蛋白聚合，当使用抑制剂处理导致片状伪足、伪足及膜皱褶受到抑制时，肌动蛋白强度会降低（图1A）。如果除吞噬作用外还希望定量肌动蛋白聚合，此步骤为可选。若肌动蛋白聚合是最终研究目标，则用于吞噬作用的荧光颗粒的使用为可选。

1. 经多聚甲醛固定后（步骤 4.3），每孔加入 100 μl PBS 洗涤两次，每次洗涤一次。加入含 0.1% Triton X-100 的 PBS 溶液 50 μl，用于透化处理，室温孵育 5 分钟。
2. 用 PBS 洗去 0.1% Triton X-100 两次（方法同上），然后加入 1% 牛血清白蛋白（BSA）封闭 20 分钟，以避免标记物的非特异性结合。
3. 封闭完成后，吸除 BSA 溶液，并立即加入罗丹明-鬼笔环肽（rhodamine phalloidin）。配制罗丹明染色工作液时，将厂家提供的甲醇溶液 100 μl 加入 5 ml PBS 中（足够处理一块板）。每孔加入 50 μl 工作液，室温孵育 20 分钟。
   注意：按照 步骤 4.4 完成后续洗涤步骤及 DAPI 染色后，细胞即可用于定量分析。

6. 定量分析

1. 使用荧光酶标仪定量吞噬作用时，采用激发波长 λ = 488 nm、发射波长 λ = 518 nm 的滤光片记录绿色荧光，采用激发波长 λ = 355 nm、发射波长 λ = 460 nm 的滤光片记录蓝色荧光。
2. 使用荧光酶标仪定量肌动蛋白聚合时，通过λ = 355 nm激发、λ = 460 nm发射检测蓝色荧光（同上），并通过激发滤光片λ = 584 nm和发射滤光片λ = 620 nm检测红色荧光。
   注意：记录时可采用轨道式或中心检测。某些细胞类型在孔板边缘的分布较中心更为密集，此时采用轨道式记录可能更具优势。特别是，围绕轨道取三个点的平均值，可获得更准确的结果。
3. 将绿色或红色荧光的总相对荧光单位（RFU）除以蓝色荧光读数（来自DAPI），具体取决于颗粒标记或吞噬情况 与 肌动蛋白定量（图1由于板间差异较大，建议使用相对指数（如相对于 t = 0 的对照组）来更准确地反映观察到的趋势，并有助于进行更可靠的统计分析。

结果

通过本方案定量吞噬作用及其后续肌动蛋白聚合的两种主要方法是观察连续性或同步化的吞噬作用。

显微镜分析（图1B）展示了与荧光计所记录结果相类似的荧光图像（另见示意图1）。图1B中显示了肌动蛋白的红色荧光、FITC标记的HKOP E. coli的绿色荧光、细胞核的DAPI染色，以及上述三种荧光染料的合并图像。该图像表明吞噬作用有效发生、肌动蛋白发生聚合，且对未被内化的颗粒实现了有效的锥虫蓝淬灭。

如图2A和图2C所示，J774细胞对调理化和非调理化颗粒的持续吞噬作用相当。有趣的是，调理化吞噬后肌动蛋白聚合增加，但在较晚的时间点增速减缓（图2B），而非调理化颗粒内化后的肌动蛋白聚合则未见增加（图2D）。在今后研究这些过程时需重视这一点，因为与非调理化颗粒的内化相比，调理化吞噬可引发更强的肌动蛋白聚合。通过MTT分析...

讨论

荧光测定技术的主要局限性在于实验变异，以及与大量洗涤和使用非贴壁细胞相关的细胞损失。

观察到的差异主要源于荧光颗粒本身的变异性，因为在配制储备液时，称量和移液操作无法精确保证每次实验所用颗粒数量完全相同。为解决实验间变异的问题，数据可用相对形式表示，例如以吞噬百分率（% phagocytosis）或相对于对照组的倍数变化（fold change from control，对照组 — t = 0；加入颗粒后立即去除）来表示。此类分析方法可产生可重复的趋势，且不同实验之间的对照组吞噬百分率数值相近。采用此类数据分析方式，仅需3至6次实验重复即可实现统计学显著性。尽管荧光测定技术本身存在一定变异性，但通过适当的数据分析，仍可有效检测并重现观察到的趋势。在熟练掌握该技术后，单名科研人员一天内可完成约六块96孔板，即600个处理组的实验操作。

在非贴壁细胞类型的研究中，细胞丢失现象普遍存在。贴壁细胞类型最适合用于此类方法，因为它们能够耐受多次且彻底的洗涤步骤。

为防止荧光组分发生光...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 μm 黄绿色荧光 Fluo-Spheres；	Molecular Probes	F8852	使用前在 37oC 下将 50μl 与 50μl 调理试剂混合孵育 30 分钟
热灭活E. coli 生物颗粒-荧光素偶联物	Molecular Probes	E2861	使用前将 5 mg 溶于 50 μl PBS 中，并与 50 μl 调理试剂混合，在 37 °C 孵育 30 分钟
调理试剂	Molecular Probes	E2870
罗丹明-鬼笔环肽	Molecular Probes	R415
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
台盼蓝	Gibco	15250-061
以下试剂有多个品牌可选，本研究所使用的产品来自以下制造商：
RPMI 细胞培养基	Gibco		添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素；使用前在 37 °C 预热
荧光酶标仪 - Fluostar Omega	BMG Labtech
多聚甲醛（16%）	Fischer Scientific	AA433689M	使用前稀释至 4%
96 孔板	Greiner	655097	透明、黑色或透明底黑色板
多通道移液器（8 - 12 通道）
试剂储液槽
1× PBS
微量离心管（0.6 ml）
锥形离心管（10 ml）