在本视频中，我们介绍了一种在活体小鼠背侧脊髓上方植入慢性光学成像窗口的操作流程。将对该成像窗口的结构、手术步骤以及慢性成像过程进行综述并演示。
本文内容
摘要
摘要
通过对活体啮齿类动物进行重复、延时的in vivo成像，哺乳动物新皮层的研究实现了对皮层结构、活动及其对神经退行性损伤反应的前所未有的高分辨率观察。这些研究得益于简便的外科手术技术，使得在无需反复手术的情况下，长时间获得光学通路成为可能。相比之下，以往对脊髓的类似研究仅限于少数几次成像，每次均需进行侵入性手术。如前所述，我们已开发出一种脊髓腔装置，可实现长达8周以上的持续光学通路，保持脊柱的机械稳定性，成像时易于外部固定，且仅需一次手术即可完成。本文将详细回顾该脊髓腔装置及其配套手术器械的设计，并演示手术操作过程。简要而言，本视频将展示手术区域及小鼠术前准备、脊椎暴露与适当组织清创、植入物递送与椎体夹持、腔体构建、递送系统的移除、皮肤封闭以及术后护理。同时还将演示利用非线性显微镜进行慢性in vivo成像的操作流程。最后，将讨论实验结果、局限性、典型变异性以及常见问题的解决指南。
引言
延时 体内 在完整生物体中进行显微成像能够直接观察复杂的生物学过程，而这些过程是传统的单时间点分析方法（如免疫组织化学）所无法触及的。具体而言，多光子显微成像技术（MPM）1 可在散射组织（如啮齿类动物新皮层）中进行成像，成像深度可达2,3 且超过4 已达到1 mm。当与外科手术准备相结合时5-7 通过单一手术实现数周至数月对大脑的光学通路，这些显微成像方法已被用于研究健康与疾病状态下大脑中的动态过程8-11此外，已开发出相关方案12,13 提供 体内 清醒状态下成像（即， 非麻醉动物，可在行为学实验期间实现细胞分辨率的功能成像。这些方案已用于相关神经元活动的比较研究14星形胶质细胞钙信号传导15 在麻醉和清醒动物中，任务特异性神经元簇的鉴定16以及神经元在触须刺激下区分物体位置的能力17.
鉴于该方法在阐明生理与病理机制方面的潜力，时间推移 体内 成像技术应用于小鼠脊髓（SC），从而识别出急性轴突变性（AAD）作为一种疾病机制18后续研究探讨了外周损伤对背根神经节（DRG）轴突再生的影响19, 血管在轴突再生中的作用20，胶质细胞对损伤的趋化性21，实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中的T细胞迁移 22小胶质细胞活性23,24 和星形胶质细胞25 针对肌萎缩侧索硬化症（ALS），STAT-3 在脊髓损伤（SCI）后轴突 sprouting 中的作用 26，以及EAE中轴突丢失与恢复的机制27尽管这些方法已取得成功，但所有这些研究仅限于单次成像会话，因而只能研究短期动态变化；或者需要在每次成像时间点重复进行动物手术开窗，这限制了可获取的时间点数量，并增加了实验干扰因素出现的可能性。这些手术操作的实验方案此前已有发表28,29.
最近，我们发表了一种技术30，用于植入慢性脊髓观察窗，从而实现在无需重复手术的情况下，对小鼠脊髓（SC）进行持续数周的活体时间序列多光子显微成像。简而言之，该手术操作包括在下胸段脊柱进行椎板切除术，并植入一个四部件组成的观察室。该观察室包含三个定制加工的不锈钢部件，用于夹紧椎板切除区域周围的椎骨，以及一块覆盖在脊髓表面并通过硅胶弹性体固定的玻璃盖片。该技术使得在健康和损伤状态下，均可在术后5周以上常规进行重复成像，且无需再次手术。成像时间点的数量仅受限于动物耐受麻醉诱导的频率。成像的持续时间则受限于脊髓表面逐渐形成的致密纤维组织。此外，我们已证实该手术植入物对运动功能无长期影响。
自从我们首次发表以来，其他研究也已报道了可用于脊髓长期成像的替代方法31-33。本方案展示了我们所开发的脊髓腔植入手术的操作流程。
方案
注意：本文中所有小鼠的饲养和实验操作均经康奈尔大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 手术准备
- 使用高压灭菌器或经批准的灭菌程序对所有所需工具进行灭菌。至少应包括手术刀、剪刀、Vannas剪、镊子、珠宝匠螺丝刀、棉签、一套牵开器、植入物（图1A）及其递送系统（图1D、E）。
- 使用70%乙醇和/或合适的消毒剂擦拭所有表面，包括体视显微镜的旋钮。
- 通过在定制的立体定位仪（图1D）及周围台面上覆盖无菌铺巾来建立无菌区域。应在立体定位仪上方、无菌铺巾下方放置加热垫（建议使用反馈控制型）。
2. 手术前小鼠的准备
- 将小鼠置于诱导室中，使用5%异氟烷/氧气麻醉，直至呼吸频率减慢至约每秒1次。
- 通过鼻罩持续给予异氟烷，将小鼠转移至无菌区域外的操作台，并将异氟烷浓度降低至2%。涂抹眼膏以防止角膜干燥。
- 使用29–30 G针头和3/10 cc注射器，将格隆溴铵（一种抗胆碱能药物）以0.05 mg/100 g小鼠的剂量肌肉注射至后肢，每侧肢体注射约50%的总体积。
注：格隆溴铵用于预防小鼠在麻醉期间肺部积液。 - 使用电推剪剃除小鼠背部一部分毛发，剃毛区域约为3 cm长、2 cm宽，中心位于胸椎隆起处。将剪下的毛发彻底清理远离剃毛区域。
- 使用29–30 G针头和3/10 cc注射器，在剃毛区域远端皮下注射以下试剂：每100 g小鼠注射1 ml生理盐水中含5%葡萄糖（用于补水），酮洛芬5 mg/kg小鼠（非甾体类抗炎药，用于镇痛），地塞米松0.2 mg/kg小鼠（抗炎类固醇，用于减轻炎症）。
- 使用棉签交替进行碘液和70%乙醇各三次清洗，每次清洗间隔1分钟。
- 使用29–30 G针头和3/10 cc注射器，在剃毛区域中心皮下注射100 µl浓度为0.125%的布比卡因（外周神经阻滞剂），以减轻切口部位疼痛。
- 将小鼠转移至定制的立体定位仪（图1D），插入直肠温度计，并等待约10分钟，使布比卡因发挥作用。
3. 暴露并清洁相邻的3个胸椎的背侧椎板
- 使用手术刀片，在目标椎骨上方做一个小切口（5 mm 或更小）（图 2A）。
- 使用镊子或插入手术剪刀尖端并张开手柄，通过钝性分离扩大皮肤切口。
- 使用手术刀或手术剪刀，轻柔地分离皮肤与下方肌肉之间的结缔筋膜。
- 使用牵开器将皮肤牵开，以尽可能提供较大的操作区域（图 2B）。注意避免增加胸部负荷，从而妨碍呼吸。
- 使用一对镊子夹住将要暴露的最前端椎骨。使用手术刀，从全部 3 节椎骨的棘突两侧切开周围组织（图 2C）。
- 结合使用手术刀片、棉签和/或骨刮匙，彻底清除椎板背侧的所有覆盖组织（图 2D）。
- 使用手术剪刀，小心剪除附着于脊柱两侧椎骨上的肌腱（图 2E）。
- 使用手术刀，尽可能轻柔地清除椎体两侧边缘的组织，以提供一个干净的夹持面。
- 使用骨刮匙和/或棉签，轻柔地清创椎骨上残留的任何软组织。使用手术剪刀修剪其他部位不一致的组织（图 2F）。
注意：无论是夹持还是进行背侧椎板切除术，都必须将椎骨完全暴露。可使用电凝器控制后续出血。 - 调整牵开器，使其不仅牵开皮肤，同时牵开脊柱周围的组织（图 2F）。
- 将植入物侧杆连接至递送柱的齿状端，并将这些部件装入柱固定器中（如 图 1E 所示）。
- 使用侧杆夹持 3 节椎骨，施加刚好足以牢固固定的力度（图 2G、H）。使用镊子辅助确保 3 节椎骨夹持水平一致。注意可能需要多次尝试。在进行椎板切除术前，应确保侧杆既水平又平行。
- 使用棉签仔细清洁并擦干被夹持椎骨的背侧表面。
4. 实施背侧椎板切除术
- 将Vannas剪刀的尖端插入被夹住的椎骨的硬膜外腔，轻轻挤压手柄；如果骨质干燥，应沿椎板背侧长度方向裂开。在对侧重复此操作，以松解椎板。
- 用镊子轻轻夹住椎板背侧突起处的松动椎板，小心剪除椎板头端和尾端的任何结缔组织，并将其提起移除。
- 使用0.9%生理盐水和/或人工脑脊液（ACSF），彻底冲洗覆盖在脊髓上的血液。用棉签吸除多余液体。
- 使用Vannas剪刀，小心修剪骨组织的侧缘，直至与植入物的侧杆齐平。再次使用棉签和生理盐水/ACSF冲洗并控制出血。
- 如果部分骨膜已脱离并覆盖在脊髓表面，应使用棉签和/或29–30 G针头轻柔去除该组织。在此步骤中需特别注意避免损伤脊髓。切勿将松动的骨膜与紧密包裹的硬脑膜混淆。
- 小心地使用牙科丙烯酸树脂和/或氰基丙烯酸酯密封骨组织剩余的暴露边缘（图2I）。特别注意避免胶水流入暴露的脊髓表面。
5. 密封反应室
- 小心放置顶板，使4个槽口与侧杆上的4个孔对齐，且开口覆盖在暴露的脊髓上方（图1B 和 2J）。
- 使用珠宝螺丝刀，小心地旋入第一颗螺丝，同时用另一把镊子固定螺丝刀的杆部。此阶段不要完全拧紧螺丝，只需旋入使前几圈螺纹咬合即可。对另外3颗螺丝重复此操作。
注意：此步骤中建议使用钛制或其他非磁性镊子，以帮助准确定位螺丝。 - 当4颗螺丝均就位后，以小幅度交替逐个拧紧，每次拧紧程度相同，直至螺丝牢固固定（图2K）。请注意，此过程中顶板发生轻微弯曲是正常现象。切勿过度拧紧，否则可能导致螺丝头断裂，或因向下的压力过大而使夹具移位和/或造成脊髓损伤。
- 使用硅胶弹性体填充脊髓与玻璃窗之间的空隙。由于KwikSil品牌弹性体在固化过程中不产生乙酸，建议使用该品牌及其配套的混合尖端。将适量硅胶均匀涂抹在暴露的脊髓上。在将硅胶应用于脊髓前，务必清除混合尖端中含气泡的硅胶。
- 操作需迅速，轻柔地将一块5 mm #0 盖玻片压入顶板的凹槽内。施加适当压力，使液态弹性体逐渐挤出并包裹脊髓，但不得造成脊髓受压（图2L）。弹性体的固化时间约为90秒，因此必须迅速完成盖玻片的放置。
- 若密封失败，需等待弹性体完全固化后，用镊子小心将其从植入物上移除，并重复步骤5.4–5.5。
- 用牙科丙烯酸酯/氰基丙烯酸酯覆盖溢出的弹性体边缘，并尽可能将其粘附至周围骨组织，以防止弹性体在脊髓表面移位。
- 移除牵开器，将皮肤拉起并贴合于植入物边缘。使用氰基丙烯酸酯将皮肤粘附至植入物边缘（图2M、N）。
- 将 #0-80 - 1/4” 固定螺丝插入顶板的翼部（图1C 和 2O）。
- 使用牙科丙烯酸酯密封顶板上螺丝槽中的任何缝隙（图2P）。
6. 术后护理
- 将动物从麻醉状态中移出，并放入一个较大的清洁笼具中。确保笼具足够大，以免在动物于笼内正常活动时，装置被笼内的物品（如饮水瓶的V形凹槽和/或食物）钩住。
注意：标准大鼠笼具最为理想。 - 将笼子放置在加热表面上，直至动物完全恢复。在小鼠完全恢复之前，不得将其放回与其他动物同笼饲养。
- 术后1-2小时内观察动物行为 疼痛或痛苦迹象及植入物完整性。
注意：在正常情况下，动物应能够在运动受到轻微干扰时仍保持行走能力。 - 在前72小时内，每8–12小时检查动物一次，测量体重并监测行为。观察动物在夜间是否活跃且具有活动能力。 应于地面水平提供以水或营养凝胶混合的湿粮饲料、颗粒饲料及饮用水。 必要时应通过皮下或腹腔注射给予额外补液。
- 术后24小时和48小时，分别皮下注射5 mg/kg小鼠剂量的酮洛芬和0.2 mg/kg小鼠剂量的地塞米松。 此外，应以每8小时一次、持续72小时的频率，通过皮下注射方式给予小鼠0.005–0.010 mg/100 g。
7. 体内 成像
- 将小鼠置于诱导室中，使用5%异氟烷/氧气麻醉，直至呼吸频率减慢至约每秒1次。
- 将小鼠转移至定制的立体定位仪（图1D），使用带反馈控制的加热垫，并插入直肠温度计。将异氟烷浓度降低至2%。
- 使用29–30 G针头和3/10 cc注射器，将0.05 mg/100 g小鼠剂量的格隆溴铵经肌肉注射至后肢，每条后肢注射约50%的总体积。
- 每小时一次，皮下注射5%葡萄糖溶液1 ml/100 g小鼠（用于补水）。
- 将螺纹状腔室支架插入手术用的支架杆中（图1F）。调节高度，并将支架杆旋紧至顶板的固定螺钉上。
- 在两个支架均安装完毕后，将支架在支架杆中抬高，直至小鼠胸部可在吸气时自由扩张。
注意：支架的牢固固定以及胸部的自由扩张可显著减少因呼吸引起的运动伪影。 - 按需进行成像。
- 成像完成后，降低支架杆，旋下腔室支架，取出直肠温度计，并将小鼠置于加热表面以恢复意识。在小鼠完全恢复前，不得将其放回与其他动物共同饲养的环境中。
结果
按照上述步骤操作时，手术的每个阶段都应与图2中所述手术各阶段的结果保持一致。涂抹硅胶弹性体时需格外小心，以消除玻璃下方的气泡，或至少确保气泡位于感兴趣区域的边缘（图2L）。对于经验丰富的手术操作者而言，手术过程中或术后24小时内因严重并发症需实施安乐死的情况约占手术总数的20%。这些并发症最常源于软组织过度出血，或未能将观察窗牢固地固定于脊柱上。
在成功植入的腔室中，窗口通常在数周内保持光学透明（图3）。尽管尽最大努力，数天内仍常出现不透明的纤维性或肿瘤样增生，导致窗口部分被遮蔽（图3C - F，黑色虚线）。在此类纤维组织下方，使用双光子激发荧光显微镜难以观察到荧光结构。我们发现实验结果呈双峰分布：约50%成功植入的窗口在术后超过5周仍保持清晰，而约50%的窗口在术后1至3周内变得模糊。对于保持清晰的窗口，观察区域内大部分位置在硬脑膜内或其上方仅出现轻度新生血管化（图3D - F，绿色星号），这并不影响双光子激发荧光成像。我们先前的研究30显示，窗口及相邻椎骨下方的小胶质细胞密度增加，但星形胶质细胞密度未见增加，表明存在轻度炎症反应，类似于颅窗制备中所见的炎症表现5。
在背根神经节（DRG）神经元亚群中表达黄色荧光蛋白（YFP）的转基因小鼠（YFPH品系；Jackson Labs）中，术后数周内轴突清晰可辨（图4A 和 b），其中一只动物甚至可持续观察长达四个月（数据未显示）。通过眶后注射将荧光标记的Texas Red葡聚糖注入血浆，可使血管显影（图4A 和 B）。在CX3CR1基因敲入并表达绿色荧光蛋白（GFP）的小鼠（CX3CR1-GFP；Jackson Labs）与YFPH品系杂交后，也可观察到小胶质细胞（图4C）。随着时间推移，成像的对比度和分辨率出现轻微下降（图4C），这归因于先前报道的纤维组织增生30。我们通常在单次实验中连续成像3小时，且可频繁至每12小时进行一次。实验时长与频率受限于动物对麻醉诱导的耐受程度，同时也需考虑伴随的实验动物疼痛与不适所带来的伦理问题。
图1. 定制的手术装置可在植入过程中辅助腔室递送，并在后续成像过程中稳定腔室。 两个侧板和一个顶板 （A） 组装 （B） 使用小螺钉固定于脊髓腔内 (C)带有可延伸支柱的手术台 （D） 可利用固定针将侧杆输送并夹紧至椎骨 (E)后续成像实验则使用内螺纹螺柱，通过植入物翼部的紧定螺钉将其连接到成像舱。 (F)图b已根据Farrar的资料修改 等, 《自然方法》, 201230 经自然出版集团许可。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 2. 进行背部椎板切除术，并植入慢性成像舱，以实现对脊髓的光学通路。 该操作流程以连续图示形式展示。首先，将皮肤（图 A、B；方案第 3.1–3.4 节）和肌肉（C；第 3.5 节）向两侧牵开，以暴露下方的三节椎骨。去除覆盖在这三节椎骨上的组织（D、E、F；第 3.6–3.10 节），清理两侧横突，并用夹具从两边固定（G、H；第 3.12 节）。随后，小心去除中央椎骨的背侧椎板，并对骨边缘进行封闭处理（I；第 4.6 节）。安装顶板（J；第 5.1 节），并将螺钉固定到位（K；第 5.3 节），以固定成像舱，随后使用硅酮弹性体和盖玻片密封舱体（L；第 5.5 节）。移除定位销后（M；第 5.8 节），将皮肤用胶粘剂固定于成像舱两侧（M、N；第 5.8 节），并将紧固螺钉插入翼状结构中（O；第 5.9 节）。最后，使用牙科丙烯酸树脂封闭螺钉槽（P；第 5.10 节），并将小鼠置于洁净笼具中恢复。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3. 慢性脊髓窗在数周内保持光学透明。脊髓的白光图像，时间范围从术后数分钟 (A) 至三周 (F)。在所有时间点均可识别血管解剖标志（黄色箭头）。术后一天时变化甚微 (B)。术后三天起即可观察到致密的纤维组织增生（C–F，右下方虚线框内），导致成像区域部分被遮蔽。同时可见轻度新生血管形成（D、E、F，绿色星号标记），但在白光或双光子激发荧光（2PEF）成像中均未遮蔽原有血管结构。请点击此处查看该图的放大版本
图4. 慢性脊髓窗技术可实现多次多光子成像，无需重复手术。 对在背柱脊髓中表达YFP（绿色）的部分DRG轴突以及通过血管内染料注射标记的血管系统（红色）进行重复成像（A，B）。在Thy1-YFP/CX3CR1-GFP双转基因小鼠中，小胶质细胞（紫红色）的活动也可随时间推移被追踪（C）。尽管轴突和小胶质细胞仍保持可见，但对比度和分辨率随时间有轻微下降（C）。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
此处演示的技术可实现重复、延时 体内 术后数周内无需进行后续手术即可对小鼠背侧上丘进行成像。该方法相较于需要重复手术的成像研究或死后组织学方法具有显著优势，因后者会丢失细胞动态变化的信息。我们此前30 展示了该技术在研究脊髓损伤病理学中的价值 体内.
成像的最大纵向范围由脊髓背侧表面致密纤维组织的生长决定。随着时间推移，这种生长会导致图像对比度和分辨率的丧失。在其他手术制备方法中也观察到此类生长现象31。据经验观察，通过仔细清洗脊髓背侧表面以去除血液产物、使用氰基丙烯酸酯封闭切割骨表面、用硅酮弹性体密封腔室边缘，以及尽量减少脊髓背侧与盖玻片之间的间隙空间，可减少此类组织生长。
最近，已有研究展示了一种与我们类似、使用聚碳酸酯腔室的方法32。使用聚碳酸酯具有优势，因为它与X射线和声学成像方式兼容，而我们的不锈钢部件则不具备这一特性。然而，随着如今3D打印技术的广泛应用，腔室部件可以由多种材料制成，以满足特定需求。我们最近已将所有部件使用透明光敏聚合物进行打印。
封闭式腔室的一个主要缺点是无法重复给予适合皮肤成像的药物或外源性染料34。然而，得益于当前系统所具备的机械稳定性，我们已成功利用现有的腔室固定连接至皮下植入式注射端口的鞘内导管，从而实现了即使在封闭式腔室系统中也能在多个时间点进行药物递送（未发表工作）。此外，由于顶板具有模块化设计，未来版本的装置将包含可重新密封的腔室，以允许反复施用治疗剂和荧光标记物。还可以设想在顶板上集成记录电极、光学插件以及药物递送端口的安装位点。此类改进在Fenrich 等人et al.31所采用的更为简约的系统中可能更难实现。总之，我们的腔室提供了一个可作为多种实验基础的通用平台。
披露
作者无任何披露事项，且无竞争性财务利益。
致谢
我们感谢 Joseph R. Fetcho 博士在本实验方案开发过程中提供的指导。我们感谢美国国立卫生研究院（R01 EB002019 项目资助 C.B.S.，DP OD006411 项目资助 Joseph R. Fetcho）以及加拿大国家科学与研究委员会（资助 M.J.F.）提供的经费支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 万纳斯剪刀 | 精细科学工具公司 | 15000-04 | |
| 镊子、剪刀、手术刀等 | 精细科学工具公司 | 多种 | |
| 牵开器套装 - 磁性固定器 | 精细科学工具公司 | 18200-02 | |
| 牵开器套装 - 牵开器 | 精细科学工具公司 | 18200-09 | 也可使用其他类型的牵开器 |
| 牵开器套装 - 弹性体 | 精细科学工具公司 | 18200-07 | |
| 反馈控制加热毯 | CWE 公司 | 型号：TC-1000 小鼠 部件号：08-13000 | |
| 立体定位仪 | 参见 Farrar 等，Nat. Meth., 9, 297, 2012，补充材料（在线） | ||
| 脊髓腔室 | 参见 Farrar 等，Nat. Meth., 9, 297, 2012，补充材料（在线） | ||
| 脊髓腔室固定架 | 参见 Farrar 等，Nat. Meth., 9, 297, 2012，补充材料（在线） | ||
| 氰基丙烯酸酯胶水 | 乐泰 | 乐泰 495 | 多家供应商 |
| 蒂茨冷固化珊瑚粉（牙科丙烯酸粉末） | 蒂茨 | 制造部件号：8101 | 多家供应商 |
| 蒂茨冷固化液体（牙科丙烯酸液体） | 蒂茨 | 制造部件号：8501 | 多家供应商 |
| 格隆溴铵 | MWI 兽用供应公司 | MWI 货号：29706（Baxter 1001901602） | |
| D-(+)-葡萄糖 | 西格玛-奥德里奇 | G5767 | |
| 布比卡因 | MWI 兽用供应公司 | MWI 货号：029841（Hospira 116301） | |
| 酮洛芬 | MWI 兽用供应公司 | MWI 货号：002800（辉瑞 2193） | |
| 地塞米松 | MWI 兽用供应公司 | MWI 货号：501012（VetOne 1DEX032） | |
| KwikSil 弹性体 | 世界精密仪器公司 | KWIK-SIL | |
| KwikSil 混合头 | 世界精密仪器公司 | KWIKMIX |
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