基于图像的流式细胞仪技术来评估变化粒细胞功能在体外

Summary

该方法通过同时测量细菌的吞噬作用和氧化爆发来展示一种评估粒细胞功能的技术。基于图像的流式细胞术可以识别活化粒细胞的三个不同亚群，这些亚群的相对功能能力都不同。

Abstract

粒细胞在机体对细菌和病毒感染的先天免疫反应中起着关键作用。虽然存在测量粒细胞功能的方法，但一般来说，这些方法在它们所能提供的信息方面是有限的。例如，大多数现有检测仅提供单次固定长度孵育后激活的粒细胞数量的百分比。更复杂的是，由于检测技术的限制，大多数检测只关注功能的一个方面。本报告展示了一种同时测量细菌粒细胞吞噬作用和氧化爆发的技术。通过同时测量这两种功能，确定了活化粒细胞的三种独特表型：1） 低活化（最小吞噬作用，无氧化爆发），2） 中度活化（中度吞噬作用，一些氧化爆发，但两种功能事件没有共定位），以及 3） 高激活（高吞噬作用、高氧化爆发、吞噬作用和氧化爆发的共定位）。还确定了由灭活粒细胞组成的第四个群体。使用 10 、 20 和 40 分钟的测定孵育时间对活化粒细胞表型再分布的影响。作为对照，在冰上完成第四次孵育。通过使用连续时间孵育，该检测可能能够检测处理如何在空间上影响粒细胞功能。所有样品均使用基于图像的流式细胞仪进行测量，该流式细胞仪配备定量成像 （QI） 选项、自动进样器和多个激光器（488、642 和 785 nm）。

Introduction

粒代表人体的先天免疫系统，它提供了抵御入侵抗原的第一行中的一个组成部分。以前的方法来评估粒细胞功能集中在吞噬能力或氧化突发使用独立的方法，从而使得难以确定如何集体粒已经改变^1-4。在流动场进步术已导致在生产以高通量方式⁵能够高分辨率，多色细胞成像台式仪器的。成像与传统的流相结合的能力，流式细胞仪代表进步，提供给现有的流式细胞仪方法在创新和提取有关免疫系统的新信息所需要的技术平台。

在过去的十年里，我们的实验室，等等，已经敏锐地专注于各种营养和运动疗法patte效果RNS先天免疫功能^6-9。在这个手稿证明该方法具有临床免疫学领域内的实际影响。本方法利用基于图像流式细胞仪的同时测量细菌粒子和氧化爆发吞噬的力量。使用这种方法，一个是能够​​分开使用由分析的基于图像的一部分提供的变量激活粒细胞。这些子集是评估对个体粒细胞图像后才辨认。进一步测定温育时间的影响三种激活子集¹⁰之间的过渡。因此，有理由认为使用多个孵育时间可以允许方法测试下面的特定的实验治疗粒细胞功能的变化。这份手稿的目的是通过使用基于图像的流式细胞仪同时测量与吞噬到oxidat演示评估粒细胞功能的方法香港专业教育学院爆裂。

Protocol

注：此方法描述的所有血液采集程序均按照赫尔辛基宣言进行，批准UNT机构审查委员会（IRB）的人类受试者。所有受试者得到的采血，将其用于本发明的方法，以确保它们的正常体重明显健康，和无病的书面同意。

1.试剂来源及制品

1. 使用CD66b-APC（克隆＃G10F5; DF = 1：50）和CD45-APCeFluor780（克隆＃2D1; DF = 1：50），用于该测定。
   注意：在此之前的研究中，CD45和CD66b的抗体滴度，以确定最佳稀释，从其它白细胞清楚地分辨粒（CD45 + / 66B +）（CD45 + / ^66b-）11。在加入稀释的抗体的染色在管的最终稀释度为875。
2. 购买和解冻的股票S.金黄色葡萄球菌生物粒子标记盒pHrodo红色染料。暂停在1米的浓度克无菌PBS每毫升生物粒子的。等分试样稀释生物粒子和储存冷冻在-20℃直至在测定中使用。
3. 溶解二氢乙（DHE），它被转换为荧光的溴化乙锭中的氧自由基（ 即氧化突发）的存在下，在DMSO中，10微克/毫升的最终浓度。
4. 混合N-乙基马来酰亚胺（用于防止附加吞噬下列指定的测定温育持续时间）用无菌PBS以2步稀释200毫克/毫升和17.5毫克/毫升分别。在测定中，使用15mM的终浓度。当解冻N-乙基马来酰亚胺，使用37℃的热块，作为N-乙基马来酰亚胺不会留在溶液中。
5. 最终固定步骤后，用7AAD染色的核DNA。然后加入稀库存7AAD 1:10的用无菌PBS。

2.采血

1. 要求受试者在实验室下面的O / N高速（> 8小时），并abstenti到达从身体活动（> 12小时）。
2. 清洗用酒精消毒片皮肤后，将无菌采血针到外围手臂静脉。
3. 采集血液注入真空管被商业化充满了肝素钠。
4. 收集后，取粘性绷带被摄对象的手臂。
5. 反转血液试管混合10次，然后放在一个摇杆直至分析。

3.吞噬分析技术

1. 解冻葡萄球菌生物粒子（RT）下，DHE（RT），和N-乙基马来酰亚胺（37℃）。
2. 加入20升生物粒子金黄色葡萄球菌的4个人1.2毫升管在无菌罩工作时。
3. 添加40升DHE的含有该生物粒子每个管。
4. 轻轻拍打在板凳面管收集试剂的试管底部。
5. 添加100μL的混合全血到已填充有生物粒子和DHE每个管。
6. 擦拭管的内侧边缘与一棉签以除去任何污染的血液。
7. 混合血液和试剂与电子移液器设置为混合血液和试剂的血液加入后三个周期。
8. 将试管在冰桶和盖由轻保护。
9. 孵育测定管10，20和40分钟。先从40分钟管，以确保所有试管在同一时间完成。
10. 解冻N-乙基马来酰亚胺在37℃水浴珠。
11. 吸管15升N-乙基马来酰亚胺（上面1.4中描述）到每个测试管的，孵育30分钟。
12. 吸管10升CD66b-APC和10μlCD45-APCeFluor780稀释抗体（上述1.1中所述）的，孵育60分钟。
13. 吸取750升的WBC修复/ RBC裂解液到每个测试管，孵育60分钟。
14. 离心（10分钟，400×g离心）测定管，收集细胞沉淀。
15. 真空吸出WBC裂解/ RBC修复方案，留下的残余FLUID体积（100μL）中的细胞沉淀。
16. 吸管10μL的稀释7AAD溶液（上述1.5中所述）和50升的PBS到每个测试管。
17. 添加的校准珠（〜25L）向每个测试管，代替帽一滴上测定管，包裹管中的箔片，并在冰箱中的地方。
18. 装载样品管插入基于图像流式细胞仪和收集至少使用预先定义的参数3000粒事件：自动进样器，蓝色（488纳米; 60毫瓦），红（640纳米; 10​​0 NW），SSC（785纳米; 8.5毫瓦）的激光器（ 图1）。

图1.采集方法和模板。被收购上的图像为基础的流式细胞仪（A）样品。在采集过程中，散点图的亮场宽高比与CD66b-APC生成从尖刺校准珠全光照分离粒克INSPIRE诉100.2.292.0软件（B）。 ，红色（640纳米，100 NW），SSC（785纳米; 8.5毫瓦）的激光器;使用自动进样器，蓝色（60毫瓦488纳米）分别获得每个样品最少5000粒。请注意，一些直方图是收购来监控激光设置和数据等方面收集时在座。所有这些直方图是可选的，只有在实验室标准操作程序要求他们作为质量控制的需要。 请点击此处查看该图的放大版本。

4.样品采集与分析

1. 使用IDEAS软件的自动化软件补偿向导申请补偿矩阵原始图像文件（RIF），并创建补偿成像文件（CIF）。
2. 加载单独的CIF文件IDEAS软件，并生成以下地块以确定粒子集：
建立初始门来识别被认为是在焦点使用直方图对明场梯度的RMS（ 图2A）的细胞。做出此判断，使用无刺激控制作为参考标准每个病人的样本。
3. 使用辅助图来从碎屑和双峰分离单细胞使用的明场纵横比（单元高度与宽度的比值）与明视场区域（ 图2B）的点积。做出此判断，使用无刺激控制作为参考标准每个病人的样本。
4. 一旦细胞干净人口已确定，建立的CD45与CD66b（ 图2C）的一个点图来正确识别粒（CD45 + / 66B +）。共创美好的细节强度S.的女儿图 （ 图3） 金黄色葡萄球菌 （x轴）与明亮的细节强度为氧化爆发（DHE，y轴）来识别激活的粒细胞的子集。收集BR在通道1和9飞行场图像，在通道2生物粒子，DHE在第4频道，7AAD在5频道，CD66b在11频道，和CD45在12频道。

图2.分析模板，这个数字的系列被产生，以确定细胞分别在聚焦（A）中的曲线，单细胞（B），粒细胞（C）。附加地块被用来确定激活的粒与无活性的粒细胞的三个子集。获取的图像文件的所有分析使用IDEAS第6节软件完成。 请点击此处查看该图的放大版本。

Results

使用基于图像的流式细胞术使我们能够激活的粒的均匀种群分离成三种不同的激活子集（ 图3）。在该方法中，最有效的方法，以解决这三个子集的激活是通过绘制亮度细节强度为吞噬作用（ 金黄色葡萄球菌 ）与氧化爆发（DHE）（ 图3;图4）。另外，在IDEAS软件使用的共定位向导将允许同时吞噬作用和氧化爆发的存在，这是高度活化的粒细胞的标志符号的量化。

图3.识别激活粒细胞亚群。通过细胞表面标记（CD45 + / 66B +），粒细胞的识别后，女儿的情节与细节鲜艳产生INTENsity的吞噬与明亮细节强度氧化爆发。使用这种方法，不活动（紫色），低活性的百分比（红色的A），中等活性（蓝色，B）和高活性（黄色，C）的粒进行测定。这种门控技术也被用于评价测定孵育时间上的各种活性粒子集的相对丰度的影响。 “高活性”粒细胞比例最高的是目前继40分钟孵化。获取的图像文件的所有分析使用IDEAS第6节软件完成。 请点击此处查看该图的放大版本。

除了演示活化粒细胞的三个不同的亚群的存在，证实了该测定的温育时间的影响的每个激活的粒子组的相对丰度。具体地，40分钟增量ubation导致的“高活性”粒细胞百分比最大。通过包括至少三个测定孵育持续时间有可能来确定如何在给定的临床治疗改变粒的瞬时激活状态。这是使用基于图像的流式细胞仪，以确定不同的活化的粒子集作为吞噬作用和氧化爆发的同时测量的函数的所述第一发布的方法。

细胞标记的 ，中等活性的（B）和低活性（C）的图4的代表图像。列为高活性（A）中的细胞的图像画廊示于该图中。 金黄色葡萄球菌生物粒子是CH03 ，氧化爆发是在CH04，7AAD的核心是CH05，边撒在CH06，CD66b是CH11和CD45是CH12。此外，被显示的吞噬（CH03）与氧化爆裂（CH04）的共定位合并图像。黄在合并图像区域表示的吞噬作用和氧化爆发都发生在同一时间同一解剖空间。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

本发明的方法代表了用于使用流式细胞^1,3,4,12-14粒功能的评估现有方法细化。该测定过程的关键步骤往往会涉及到血液样品与所述生物粒子和DHE的适当的混合。不完全的混合会导致不准确的结果。而完全混合是非常关键的，混合方法应该是温柔的性质。有人建议，混合使用电子移液器具有混合功能，而不是一个涡流混合器来完成。在测定另一关键步骤是始终确保没有污染的血液测定管的上半部分。该残留的血液可以使用无菌棉签除去。完全除去是重要的，因为如果不这样做有可能污染最终测定制剂与未裂解的红细胞。

之前使用该方法适当补偿控制应加以控制对菌ectral重叠之间用于识别粒功能的各个方面的试剂。对于此方法，补偿控制涉及采集血液样本已被提出的40分钟测定孵育，然后用单个标记标记（ 即，大肠杆菌，DHE等）。标记后，单阳性事件的收集和使用的IDEAS分析软件的自动向导生成的补偿矩阵。至关重要的是，如果该测定的情况下，适当的补偿控制被完成，以确保适当的检测性能。

分析使用该功能查找和共定位向导来确定亮度细节强度分离人口的最好变量，还确定了如何氧化爆发和吞噬信号之间存在很多重叠完成。具体地，使用基于图像的细胞计数提供给分离激活的粒成三个亚群的能力。牛逼他的子集分类用吞噬作用与氧化爆发的亮度细节强度决定的。除了研究这些奇异细胞功能，细胞是在同一时间在相同的解剖学位置（共定位）显示出两个事件进行了鉴定。粒落在进入“高活性”的子集是该证明吞噬作用和氧化爆发之间是一致的共定位的唯一的表型。这种识别激活粒子集是在需要排除故障的最大面积。新用户花时间去了解IDEAS样品工作流程，并了解使用成像组件选通细胞群的机制是非常重要的。该用户可以寻求使其他修饰包括交替或额外测定的孵育时间的选择。当前的方法建议使用10-40分钟持续时间;然而，根据不同的实验模型，其中该方法是要使用时，它可能需要选择较长的测定持续时间。这样的修改将需要一个单独的基础上进行评估。

此外它被确定在测定孵育的持续时间，对三种活性子集的外观的显著效果。本报告中所描述的方法表示什么样的信息可以关于粒细胞功能^3,4,13,15预先获得的扩展。其他实验室已经证明评估变化粒功能免疫力和抗病^15-17全面评估的一部分的重要性。尽管该测定的电势也不是没有局限性。其中一个主要的限制是与高样品通量处理相关联的成本和时间的需求。当研究设计需要大量的在给定的一天的样品，这些可能难以处理。处理是通过使用电子吸管和掌柜精简，但这些往往是昂贵的，并且不一定可用在每一个实验室。

我们的研究领域集中在如何锻炼和饮食习惯影响免疫系统的健康和功能^6,8-10,18-20研究。这些目标对多种人类健康领域显著实际影响。除了锻炼和营养作用的研究，在吞噬功能的监测是治疗效果的关键在这个手稿展示了吞噬的方法可能是在临床免疫学等领域非常有用。本试验是在第一许多与免疫学测定用潜力可重新发明通过取，可以是可以从图像的基于流式细胞仪的独特的成像信息的优点。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
真空采血器	BD 生命科学		用于血液采集
WBC 固定剂/红细胞裂解液	eBioscience	00-5333-57
CD66b-APC	eBioscience	克隆 G10F5
CD45-APCeFluor780	eBioscience	克隆 2D1
S. aureus 生物颗粒	Life Technologies	A10010
二氢乙锭	Sigma-Aldrich	D7008
N-乙基马来酰亚胺	Sigma-Aldrich	4259
7AAD	EMD Millipore
血液分析仪	迈瑞	BC-3200
96通道移液	管 Integra Biosciences	ViaFlo
珠浴培养箱	LabArmour	BeadBath
成像 流式细胞仪	EMD Millipore	Amnis FlowSight
INSPIRE 软件	EMD Millipore	Amnis INSPIRE
IDEAS 软件	EMD Millipore	Amnis IDEAS
X-Pierce 穿孔板密封机	Excel Scientific， Inc.	X-Pierce
Dell Precision 工作站	Dell Computers	各种	用于 IDEAS 分析