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基于成像的流式细胞术技术评估粒细胞功能变化 体外

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DOI：

10.3791/52201

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2014年12月26日

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1Applied Physiology Laboratory, University of North Texas

本文内容

摘要

该方法展示了一种通过同时检测细菌吞噬作用和氧化爆发来评估粒细胞功能的技术。基于图像的流式细胞术能够识别出三种不同的活化粒细胞亚群，它们在相对功能能力上均存在差异。

摘要

粒细胞在机体针对细菌和病毒感染的先天免疫应答中发挥关键作用。尽管目前已存在多种检测粒细胞功能的方法，但这些方法在所能提供的信息方面普遍存在局限性。例如，大多数现有检测仅能提供在单一固定孵育时间后被激活的粒细胞所占的百分比。此外，由于检测技术的限制，多数检测仅聚焦于粒细胞功能的某一方面。本报告展示了一种可同时测量粒细胞吞噬细菌能力与氧化爆发活性的技术。通过同时检测这两项功能，共鉴定出三种独特的活化型粒细胞表型：1）低度活化（吞噬作用微弱，无氧化爆发）；2）中度活化（中等程度吞噬作用，部分氧化爆发，但两种功能事件无共定位）；3）高度活化（强烈吞噬作用，强烈氧化爆发，且吞噬作用与氧化爆发存在共定位）。此外，还鉴定出第四类未活化的粒细胞群体。通过设置10、20和40分钟的检测孵育时间，评估了孵育时长对活化粒细胞表型分布的影响。另设一组样本在冰上孵育作为对照。采用连续时间点孵育方式，该检测方法有望揭示某种处理对粒细胞功能在空间上的影响。所有样本均使用配备定量成像（QI）功能、自动进样器及多激光器（488、642和785 nm）的基于图像的流式细胞仪进行检测。

引言

粒细胞是机体先天免疫系统的一个组成部分，可提供抵御入侵抗原的第一道防线。以往评估粒细胞功能的方法主要集中于通过独立的技术分别检测其吞噬能力或氧化爆发能力，因而难以整体评估粒细胞发生的变化1-4。流式细胞术领域的进步已催生出能够以高通量方式对细胞进行高分辨率、多色成像的台式仪器5。将成像技术与传统流式细胞术相结合，代表了一项重要进展，为改进现有流式细胞术方法提供了所需的技术平台，并有助于获取有关免疫系统的新信息。

在过去的十年中，包括本实验室在内的多个研究团队一直高度关注各种营养和运动干预模式对先天免疫功能的影响6-9。本文所展示的方法在临床免疫学领域具有实际应用价值。本方法利用基于成像的流式细胞术，能够同时检测细菌颗粒的吞噬作用和氧化爆发反应。通过该方法，可利用成像分析部分提供的参数将活化的粒细胞进行区分。这些亚群只有在对单个粒细胞的细胞图像进行评估后才能被识别。进一步研究表明，不同检测孵育时间会影响三种活化亚群之间的转化过程10。因此，采用多个孵育时间点可能有助于建立一种检测特定实验干预后粒细胞功能变化的方法。本文的目的是展示一种利用基于成像的流式细胞术同时评估吞噬作用与氧化爆发反应来检测粒细胞功能的方法。

方案

注意：本方法中所述的所有血液采集程序均按照《赫尔辛基宣言》进行，并已获得北德克萨斯大学（UNT）人类受试者机构审查委员会（IRB）的批准。所有受试者均签署了书面同意书，同意采集血液。本方法中使用血液样本以确保受试者明显健康、体重正常且无疾病。

1. 试剂来源与制备

  1. 使用 CD66b-APC（克隆号 G10F5；稀释因子=1:50）和 CD45-APCeFluor780（克隆号 2D1；稀释因子=1:50）进行本实验。
    注意：在研究开始前，已对 CD45 和 CD66b 抗体进行滴定，以确定最佳稀释度，从而清晰区分粒细胞（CD45+/66b+）与其他白细胞（CD45+/66b-） 11加入稀释后的抗体进行染色后，管中最终稀释倍数为875。
  2. 购买并解冻储备液 S. aureus 用pHrodo红染料标记的生物颗粒。将生物颗粒以每毫升1毫克的浓度悬浮于无菌PBS中。分装稀释后的生物颗粒，于-20°C冷冻保存。20 °C 直至用于检测。
  3. 溶解二氢乙啶（DHE），该物质在氧自由基存在下可转化为荧光性的溴化乙啶即， 氧化爆发），在DMSO中配制成终浓度为10 g/ml。
  4. 将N-乙基马来酰亚胺（用于在指定的实验孵育时间后阻止进一步的吞噬作用）与无菌PBS进行两步稀释，浓度分别为200 mg/ml和17.5 mg/ml。在实验中使用15 mM的终浓度。解冻N-乙基马来酰亚胺时，使用一个 37 °C 热块，因为N-乙基马来酰亚胺不会保留在溶液中。
  5. 最后固定步骤完成后，使用 7AAD 对核 DNA 进行染色。染色前，将储存液 7AAD 用无菌 PBS 按 1:10 比例稀释。

2. 血液样本采集

  1. 要求受试者在过夜禁食（>8小时）且未进行体力活动（>12小时）后到达实验室。
  2. 使用酒精消毒片清洁皮肤后，将无菌采血针插入前臂静脉。
  3. 将血液采集至预先加入肝素钠的商用真空采血管中。
  4. 采血完成后，在受试者手臂穿刺部位贴上粘性创可贴。
  5. 轻轻倒置采血管混匀10次，随后置于摇床上直至进行分析。

3. 吞噬作用检测技术

  1. 在室温下解冻 S.aureus 生物颗粒和 DHE，将 N-乙基马来酰亚胺在 37 °C 下解冻。
  2. 在无菌操作台中，向 4 个独立的 1.2 ml 离心管中各加入 20 µL S.aureus 生物颗粒。
  3. 向每支含有生物颗粒的离心管中加入 40 µL DHE。
  4. 轻轻敲击管壁，使试剂沉降至管底。
  5. 向已加入生物颗粒和 DHE 的每支离心管中加入 100 µL 混合全血。
  6. 用棉签擦拭管内壁边缘，去除可能残留的污染血液。
  7. 使用电子移液器在加入血液后，以三循环模式混匀血液与试剂。
  8. 将检测管置于冰桶中，并用铝箔覆盖以避光。
  9. 将检测管分别孵育 10、20 和 40 分钟。从 40 分钟的管开始孵育，以确保所有检测管同时结束孵育。
  10. 将 N-乙基马来酰亚胺置于 37 °C 金属浴中解冻。
  11. 向每支检测管中加入 15 µL 上述步骤 1.4 中所述的 N-乙基马来酰亚胺，孵育 30 分钟。
  12. 向每支检测管中加入 10 µL CD66b-APC 和 10 µL CD45-APCeFluor780 稀释抗体（如上述步骤 1.1 所述），孵育 60 分钟。
  13. 向每支检测管中加入 750 µL 白细胞固定/红细胞裂解液，孵育 60 分钟。
  14. 将检测管以 400 × g 离心 10 分钟，以收集细胞沉淀。
  15. 用真空抽吸法去除白细胞裂解液/红细胞固定液，保留约 100 µL 液体在细胞沉淀上方。
  16. 向每支检测管中加入 10 µL 上述步骤 1.5 中所述的稀释 7AAD 溶液和 50 µL PBS。
  17. 向每支检测管中加入一滴校准微球（约 25 µL），盖上管盖，用铝箔包裹，并置于冰箱中。
  18. 将样本管加载至基于图像的流式细胞仪中，使用预设参数至少采集 3,000 个粒细胞事件：自动进样器，蓝色激光（488 nm；60 mW），红色激光（640 nm；100 nW），侧向散射光 SSC（785 nm；8.5 mW）（图 1）。

流式细胞仪工作站及数据分析；屏幕上显示的细胞分析图和图表。
图 1. 数据采集方法与模板。 样本在基于图像的流式细胞仪上进行采集（A）。采集过程中，使用 INSPIRE v. 100.2.292.0 软件生成明场长宽比（Bright Field Aspect Ratio）与 CD66b-APC 的散点图，以区分粒细胞与添加的校准微球（B）。每个样本通过自动进样器至少采集 5,000 个粒细胞，使用的激光包括蓝色（488 nm；60 mW）、红色（640 nm；100 nW）和侧向散射光 SSC（785 nm；8.5 mW）。请注意，采集过程中会显示多个直方图，用于监测激光设置及其他数据采集参数。所有这些直方图均为可选，仅当实验室标准操作程序要求将其作为质量控制时才需使用。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 样品采集与分析

  1. 使用 IDEAS 软件的自动补偿向导对原始图像文件（RIF）应用补偿矩阵，并生成已补偿图像文件（CIF）。
  2. 在 IDEAS 软件中加载各个 CIF 文件，并生成以下图表以鉴定粒细胞亚群：
  3. 使用明场梯度RMS的直方图建立初始门控，以鉴定被认为处于焦点内的细胞图 2A）。以未刺激的对照样本作为参考标准，对每个患者样本进行此项判定。
  4. 使用次级图，通过明场纵横比（细胞高度与宽度的比值）与明场面积的散点图，将单细胞与碎片及双联体分离开来图2B以未刺激的对照样本作为参考标准，对每个患者样本进行此项判定。
  5. 在确定了纯净的细胞群体后，建立 CD45 与 CD66b 的散点图（dot plot）图2C) 以正向鉴定粒细胞（CD45+/66b+）。创建一个子图（图3) 明亮点细节强度的 S. aureus （x轴）与氧化爆发（DHE，y轴）的明亮细节强度对比，以鉴定活化粒细胞亚群。在通道1和通道9采集明场图像，通道2采集生物颗粒，通道4采集DHE，通道5采集7AAD，通道11采集CD66b，通道12采集CD45。

明场图像分析图表，显示频率、长宽比与面积关系以及标志物比较。
图 2. 分析模板。 本图展示了用于识别处于焦平面内的细胞(A)、单个细胞(B)以及粒细胞(C)的一系列图像分析图。此外还使用了其他图表来区分活化状态的三种粒细胞亚群与非活化粒细胞。所有获取的图像文件分析均使用 IDEAS v.6 软件完成。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

利用基于成像的流式细胞术，可将一群均质的活化粒细胞分为三种不同的活化亚群（图3）。在本方法中，区分这三种活化亚群最有效的方式是绘制吞噬作用（S. aureus）的亮细节强度与氧化爆发（DHE）的对比图（图3；图4）。此外，使用IDEAS软件中的共定位向导功能，可定量分析同时发生吞噬作用和氧化爆发的现象，这是高度活化粒细胞的典型特征。

吞噬作用与氧化爆发散点图；10、20、40分钟时的延时显微成像。
图3. 活化粒细胞亚群的鉴定。 在利用细胞表面标志物（CD45+/66b+）鉴定粒细胞后，生成了以吞噬作用的亮细节强度对氧化爆发的亮细节强度作图的子图。通过该方法，确定了非活性（紫色）、低活性（红色，A）、中等活性（蓝色，B）和高活性（黄色，C）粒细胞的百分比。该门控技术还用于评估检测孵育时间对不同活化粒细胞亚群相对丰度的影响。在孵育40分钟后，高活性粒细胞的比例最高。所有获取图像文件的分析均使用IDEAS v.6软件完成。请点击此处查看该图的放大版本。

除了证明存在三种不同类型的活化粒细胞亚群外，研究还表明，检测孵育时间会影响各活化粒细胞亚群的相对丰度。具体而言，40分钟的孵育时间可获得最高比例的“高活性”粒细胞。通过设置至少三个不同的检测孵育时长，可能有助于确定特定临床治疗如何改变粒细胞活化状态的时间动态。这是首个发表的利用基于成像的流式细胞术，通过同时检测吞噬作用和氧化爆发来识别不同活化粒细胞亚群的方法。

荧光显微镜结果；多通道分析、光谱成像、细胞研究。
图 4. 细胞标志物的代表性图像。 本图展示了被分类为高活性 (A)、中等活性 (B) 和低活性 (C) 的细胞图像合集。S.aureus 生物颗粒位于 Ch03，氧化爆发位于 Ch04，细胞核染色 7AAD 位于 Ch05，侧向散射位于 Ch06，CD66b 位于 Ch11，CD45 位于 Ch12。此外，还显示了吞噬作用（Ch03）与氧化爆发（Ch04）的共定位合并图像。合并图像中的黄色区域表示吞噬作用与氧化爆发在同一解剖空间内同时发生。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本方法是对现有利用流式细胞术评估粒细胞功能的方法的改进1,3,4,12-14。该检测的关键步骤通常涉及将血液样本与生物颗粒及二氢乙啶（DHE）充分混匀。混匀不充分会导致结果不准确。尽管充分混匀至关重要，但混匀操作应轻柔进行。建议使用带混匀功能的电子移液器进行混匀，而非涡旋振荡器。检测中的另一个关键步骤是始终确保检测管上半部分无血液污染。可使用无菌棉签去除残留血液。彻底清除非常重要，否则可能导致未裂解的红细胞污染最终的检测样本。

在使用本方法之前，应设置适当的补偿对照，以校正用于识别粒细胞功能不同方面的试剂之间存在的光谱重叠。本方法中的补偿对照包括采集经过40分钟检测孵育处理的血样，然后用单一标记物（即 E. coli、DHE等）进行标记。标记完成后，采集单阳性事件，并利用IDEAS分析软件中的自动向导生成补偿矩阵。若使用本检测方法，必须完成适当的补偿对照，以确保检测结果的准确性。

通过使用特征查找器和共定位向导进行分析，确定亮细节强度是区分细胞群的最佳变量，并明确氧化爆发与吞噬作用信号之间的重叠程度。具体而言，基于图像的细胞计数技术能够将活化的粒细胞分为三个亚群。该亚群划分依据的是吞噬作用与氧化爆发过程中亮细节强度的差异。除了分析这些单一细胞功能外，还鉴定了在同一解剖位置同时发生两种事件（即共定位）的细胞。只有归入“高活性”亚群的粒细胞表现出吞噬作用与氧化爆发之间持续且一致的共定位现象。对活化粒细胞亚群的识别是实验中最需要进行问题排查的关键环节。新用户必须花时间熟悉IDEAS软件中的样本处理工作流程，并掌握利用成像组件对细胞群进行设门的操作原理。用户可能考虑的其他优化包括选择不同的或更长的检测孵育时间。当前方法建议孵育时间为10–40分钟；然而，根据该方法所应用的具体实验模型，可能需要选择更长的孵育时长。此类调整需根据具体实验条件单独评估。

此外，研究确定了检测孵育时间对三种活化亚群出现具有显著影响。本报告所述方法拓展了此前关于粒细胞功能所能获得的信息3,4,13,15。其他实验室已证明，在全面评估免疫功能与疾病时，检测粒细胞功能变化具有重要意义15-17。尽管该检测具有潜力，但仍存在局限性。其中一个主要局限是高通量样本处理所涉及的成本和时间消耗。当研究设计要求在一天内处理大量样本时，这些样本可能难以完成处理。虽然电子移液器和分液器的使用可使处理流程更高效，但这些设备通常价格昂贵，并非所有实验室都具备。

我们的研究领域聚焦于探讨运动和饮食习惯如何影响免疫系统的健康与功能6,8-10,18-20。此类研究目标对人类健康的多个领域具有重要的实际意义。除了运动与营养效应的研究之外，本文所展示的吞噬作用检测方法在其他临床免疫学领域也可能具有应用价值，特别是在吞噬功能的监测对治疗效果至关重要的情况下。本实验方法是众多免疫学检测方法中的首个范例，未来有望借助基于图像的流式细胞仪所提供的独特成像信息，对这类检测进行重新设计与革新。

披露

作者无任何利益冲突披露。

致谢

本研究部分得到了德克萨斯大学北部分校向 McFarlin 博士提供的研究启动资助（RIG）。作者未获得完成本研究的直接资助，且不存在利益冲突。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
真空采血管BD Life Sciences用于血液采集
白细胞固定剂/红细胞裂解液eBioscience00-5333-57
CD66b-APCeBioscience克隆号 G10F5
CD45-APCeFluor780eBioscience克隆号 2D1
S. aureus 生物颗粒Life TechnologiesA10010
二氢乙啶Sigma-AldrichD7008
N-乙基马来酰亚胺Sigma-Aldrich4259
7AADEMD Millipore
血细胞分析仪MindrayBC-3200
96通道移液器Integra BiosciencesViaFlo
珠浴孵育器LabArmourBeadBath
成像流式细胞仪EMD MilliporeAmnis FlowSight
INSPIRE 软件EMD MilliporeAmnis INSPIRE
IDEAS 软件EMD MilliporeAmnis IDEAS
X-Pierce 可穿刺板封膜Excel Scientific, Inc.X-Pierce
Dell Precision 工作站Dell ComputersVarious用于 IDEAS 分析

参考文献

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