FIM 是一种新型、经济高效的成像系统，旨在追踪小型运动物体，例如 C. elegans、涡虫或果蝇幼虫。配套的 FIMTrack 程序可实现快速高效的数据分析。这些工具结合使用，能够对行为特征进行高通量分析。
方法文章
FIM成像与FIMtrack：两种实现高通量且经济高效运动分析的新工具
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
分析神经网络功能需要对行为特征进行可靠测量。由于自由移动动物的行为在一定程度上具有变异性，因此必须分析大量个体才能获得具有统计学意义的数据。这反过来要求采用计算机辅助的自动化运动模式量化方法。为了获得几乎透明且微小移动物体的高对比度图像，我们开发了一种基于全内反射抑制原理的新型成像技术，称为FIM（ frustrated total internal reflection imaging）。在此装置中，动物仅在与下方爬行表面接触的特定位置被红外光照射，从而产生极高对比度的图像。随后，利用成熟的轮廓追踪算法对这些高对比度图像进行处理。基于此，我们开发了FIMTrack软件，用于提取多种特征参数，以定量描述多种多样的运动特性。在开发该软件包的过程中，我们着重构建了开源架构，便于轻松添加更多模块。该程序可在不同平台上运行，并配备直观的图形用户界面（GUI），引导用户完成数据分析流程。所有运动参数值均以csv文件格式输出，便于进一步的数据分析。此外，集成在追踪软件中的结果查看器（Results Viewer）允许用户交互式地回顾和调整输出结果，尤其适用于刺激整合过程中的修正需求。通过研究黑腹果蝇（Drosophila larvae）的运动行为，充分展示了FIM与FIMTrack技术的强大功能。
引言
大多数动物都具有高度复杂且受控的运动能力。为了破译控制运动行为的遗传基础，必须对不同的行为模式进行定量评估。在这方面，果蝇可作为理想的模型。对自由飞行的果蝇进行追踪极具挑战性1-4，而果蝇幼虫的爬行发生在二维平面，速度相对较慢，因此更容易被监测。基于相机的装置结合适当的照明系统可用于图像采集5。在行为学实验中，可采用入射光或透射光6,7。然而，由于幼虫体壁具有半透明特性，且爬行表面可能产生光线反射，导致幼虫运动的准确记录面临困难。为克服此类问题，研究人员已设计出一些复杂的方法。最近引入了暗场照明技术，以增强前景与背景之间的对比度8。作为基于相机记录的替代方案，无透镜光学成像和无图像传感器的片上采集技术也已被提出9-11。
近年来已推出多种追踪程序，包括商业软件12和定制化解决方案。高通量追踪程序的示例包括多虫追踪系统（Multi Worm Tracker, MWT）13和多动物步态与追踪系统（Multianimal Gait And Track, MAGAT）8。这些系统共同的特点是可在单个开放场环境中同时追踪多个动物，但当动物发生碰撞时会导致生成多个新的个体身份标识。为克服这一局限性，已有研究引入了多孔板装置，将12个动物分别置于独立的孔中进行分离培养14。通过结合显微镜使用可移动追踪平台，可实现对单个个体运动行为的精确量化15。然而，上述所有方法在高通量表型分析中均存在成本效益低、分辨率不足或耗时过长等问题。
为克服上述局限，我们开发了一种基于衰减全反射红外光谱（FTIR）的成像方法 FIM（FTIR-based Imaging Method）16（图1）。这种新型成像技术可提供前所未有的高对比度，甚至能够实现对爬行动物的多色记录16。该方法简便高效，其基本原理如下：将一块亚克力玻璃板用光线（例如，875 nm 红外光）照射。由于亚克力玻璃与空气的折射率不同，光线在玻璃/空气界面处发生全反射。实验中未观察到亚克力玻璃的加热现象16。只有当折射率更高的物体接触被光照照射的玻璃表面时，光才能进入这些物体。当动物接触表面时，光线被反射，并可从下方采集（图1）。因此，仅有动物与表面接触的区域呈现为亮斑，背景整体保持黑色，从而实现高清晰度成像。由此，FIM 成像可为计算机视觉算法提供高质量的视频记录。FIM 方法操作简单且稳定可靠，现可实现对复杂动物行为的高通量详细分析，并可用于研究信息处理过程：例如，嗅觉8, 16、视觉17或温度感知18。
图 1. 集成热刺激的FIM装置及其基本物理原理。(A) FIM装置。照明强度可在前面板调节。(B) 为施加热刺激，在琼脂表面（厚度为2 mm）上方2 mm处放置一块涂黑的铝板，该铝板两侧分别灌注热水和冷水。温度差异在散热铝板和琼脂中建立起温度梯度。(C) 全反射受抑的物理原理：一块丙烯酸玻璃板由红外光照射。θ1、θ2 和 θ3 表示光的反射角。nA、n1、n2 和 n3 分别表示空气、丙烯酸玻璃、琼脂和幼虫的折射率，且满足不等式 nA 1 2 3。由于折射，光线在穿过不同介质时反射角发生变化。当入射角低于临界角时，光不再被完全反射，而是可穿透各层并从下方被检测到。请点击此处查看该图的放大版本。
FIM 可分析的过程范围广泛。无需任何额外调整，FIM 成像即可用于监测果蝇的所有幼虫阶段（图5B），也可用于追踪成年果蝇的足迹19。同样，秀丽隐杆线虫（C. elegans）的运动轨迹或涡虫的移动也可轻松记录（图5C）。甚至对真菌菌丝或根毛生长的分析也具有可行性19。在当前的 FIM 装置中，32 × 32 cm2 的丙烯酸玻璃板内集成了 4 × 16 个红外发光二极管（IR-LEDs），该装置称为追踪台（图1）。IR-LEDs 的强度可根据追踪台上物体的重量进行调节，通过微控制器经由脉宽调制（PWM）连接电路即可轻松实现。FIM 在广泛的照明强度范围内均可获得高对比度图像。重要的是，即使在较低的总体红外照射下，也能产生优异的成像结果。
在追踪平台下方放置一个带有红外滤光片的相机，以便将额外的刺激整合到实验装置中。热刺激可通过加热辐射板轻松施加，光刺激则通过LCD投影仪施加。此外，通过简单的盖子即可使气味物质形成浓度梯度8。在热梯度实验中，加热辐射板两侧分别灌注热水和冷水，并将其置于幼虫上方2 mm处（图1B）。
生成高对比度、高质量的视频为基于计算机的复杂图像分析提供了可能，因此我们采用了 FIMTrack 软件从图像中提取大量特征（图 2）。首先，从动物轮廓中定义了六个初级特征（图 3A）。这些特征为进一步计算六个次级特征提供了基础，次级特征用于描述动物在特定刺激下的形态及其在某一时间点的位置（图 3B）。目前，还计算了九个三级特征，这些特征整合了时间维度信息，从而结合初级和次级特征共同表征动物的运动行为（图 3C）。
图 2. FIMTrack 概览、算法流程及幼虫表征。(A) FIMTrack 的使用方法。首先加载图像，需设置灰度值阈值以及定义单个幼虫的尺寸阈值，幼虫区域必须处于 [最小尺寸, 最大尺寸] 范围内。通过高亮按钮启动追踪。(B) 追踪工作流程。点击开始按钮后，系统计算背景图像（随时间变化的最小强度值）。只要仍有未处理的帧，就基于灰度阈值以及最小和最大尺寸阈值对幼虫进行分割。对所有分割结果计算幼虫表征（参见 (C)）。每个新模型若存在有效轨迹，则将其关联至相应轨迹。当处理至最后一帧时，执行最终的后处理步骤，随后生成输出结果。(C) 幼虫表征。该动物模型由头部和尾部两点（h 和 t）构成。在这两点之间可设置任意奇数个脊柱点 si，每个点具有半径 ri。此外，还计算质心 m 和主躯干弯曲角 γ。若干与运动相关的参数以紫色线条示意。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3. FIMTrack 计算的特征。(A) 基于动物轮廓的初级特征。(B) 基于初级特征的次级特征。(C) 基于连续帧中的初级特征及额外输入的三级特征 请点击此处查看此图的放大版本。
方案
注意：此处介绍FIM用于在自由移动条件下以及热刺激影响下对幼虫运动进行便捷的高通量分析。其他应用，例如依赖嗅觉刺激的运动分析或对翻滚及其他行为进行高分辨率成像，可能需要对本方案进行细微调整，相关调整可根据要求提供。
1. 实验设置
- 每种基因型总共使用约100条幼虫（所需时间1小时），以获得具有统计学意义的数值。注意：若需在不同日期比较并记录多种基因型，则每天每种基因型记录的幼虫数量应保持一致。
- 大多数应用中，以10 Hz频率进行记录以用于参数分析。对于高分辨率成像应用，可根据需要调整成像速度。
- 为追踪三龄幼虫，应在产卵后约120小时进行实验。确保培养物在实验期间能提供足够的幼虫（见4.3）。
- 对于非刺激应用，制备含有透明琼脂的爬行表面（见第2节）。为使幼虫在热梯度刺激应用中保持在刺激范围内，需在视野周围设置厌恶性盐琼脂屏障（见第3节）。
注意：其他应用可能需要不同的表面。 - 确保使用环境条件恒定的房间（温度、光照、气流、空气湿度） 等等。).
2. 爬行表面制备（透明琼脂）
注意：在FIM装置中，添加琼脂表面以提供湿润的爬行表面，此外还能改善照明特性。
- 将0.8%食品级琼脂在去离子超纯水中煮沸。若用于筛选实验，制备400 ml。
- 在另一块33 cm × 33 cm的丙烯酸玻璃板上倒入50 °C（手感温热）的琼脂。琼脂的表面张力及其温度将决定琼脂板的厚度。在50 °C时，可获得厚度为2 mm的琼脂板。煮沸后不要搅动，并持续倾倒以避免产生气泡。每次约4小时的成像周期均需使用新制备的琼脂板。
- 将剩余的0.8%琼脂溶液倒入标准的6 cm培养皿中，用于实验前对幼虫进行分选、清洗和适应处理（每种基因型使用一个培养皿）。
- 若实验需要使用厌恶性琼脂屏障，请继续进行第3节操作。
- 修剪掉琼脂板边缘约2 cm的外围部分，以获得用于记录的平整方形表面。移除多余的琼脂。
注意：尺寸取决于具体应用。 - 琼脂板冷却后，轻轻将滑动的琼脂推过丙烯酸玻璃板边缘，直接转移至FIM装置中。
3. 可选：在爬行表面添加厌恶性琼脂屏障（盐琼脂）
- 将2.5%食品级琼脂与3 M NaCl在去离子超纯水中煮沸。若需在温度梯度下进行筛选，则制备200 ml。
注意：体积取决于具体应用。 - 在先前浇注的爬行表面（视野范围为22 × 22 cm）周围切出一个宽2 cm的凹槽。
注意：根据具体应用，可能需要不同形状的屏障和视野范围。 - 用盐琼脂填充凹槽，使其高度比追踪表面高出0.1–0.3 cm。
4. 果蝇操作
- 将果蝇饲养于25 °C、65%空气湿度的培养箱中，光照/黑暗循环为12小时，调整至实验所需时间，使用标准果蝇培养基。
- 进行杂交时，用CO2麻醉30只未交配雌蝇和8只雄蝇，并将其转移至含35 ml培养基的130 ml培养瓶中进行杂交。
注意：一个含35 ml培养基的130 ml培养瓶，在4小时的成像时间内可获得约20–30只晚期三龄幼虫。成像与追踪适用于所有幼虫龄期阶段。 - 向培养瓶中滴加少量水以促使晚期三龄幼虫活动，并用小号画笔从瓶壁收集体型最大的幼虫。
- 在开始记录前2–5分钟，将用于单次视频拍摄的幼虫转移至含有0.8%食品级琼脂（溶于去离子超纯水）的培养皿中，使其适应环境并清洁身体。
5. 调整FIM成像系统以进行记录（非刺激条件）
- 根据需要调整相机镜头的焦距和光圈。设置相应相机的曝光时间。
注意：在实验过程中，这些设置无需更改。 - 通过成像一条幼虫来调节照明强度，以获得良好的对比度。
- 在记录期间保持室内环境条件恒定。将房间遮暗，以避免方向性光照干扰幼虫。
6. 可选：调整 FIM 成像装置以进行记录（渐进式温度刺激条件）
注意：热梯度装置是一块42 x 42 x 0.2 cm3的铝板，顶部涂有哑光黑色涂料并覆盖隔热材料。铝板两端分别连接两个由加热器/冷却器和泵组成的独立水循环系统，用于对板体进行水循环控温（见图1B）。温度调节范围为-5至+50 °C。
- 在实验开始前1小时打开热梯度装置，并将其放置在实验装置上方，以建立所需的温度分布，并使各组件达到平衡。
- 将带有盐屏障的爬行表面琼脂转移至实验装置上。
- 将散热板置于琼脂上方，并调节板与爬行表面之间的间距至2 mm（约在幼虫上方1 mm处）。
- 通过调节水循环系统的温度至1 °C和45 °C，在视野中距屏障约2 cm处从34 °C到相对一侧距屏障约2 cm处18 °C的范围内，建立至少0.8°C/cm的线性梯度。
注意：不同金属板的梯度特性需要不同的温度设置，需通过实验经验确定。这些设置在实验过程中无需更改。 - 按照第5节所述调整设置。
- 实验前让爬行表面在梯度中平衡20分钟。使用红外测温仪检测温度梯度。
- 继续进行第8节操作。
7. FIM 成像（非刺激条件）
- 使用小的湿润画笔轻轻收集驯化培养皿中的 15 条幼虫，并将其转移至追踪表面的中心。避免转移食物残渣或过多水分（参见 7.8）。
- 在 22 cm × 22 cm 的追踪区域内记录 1–50 条幼虫。大多数筛选实验建议每段视频使用 15 只动物（出于统计学考虑，每基因型至少使用 100 只个体）。
- 轻轻分开幼虫，等待约 10–20 秒，直至所有幼虫开始直线运动后再开始记录。
- 在无刺激条件下以每秒 10 帧的速度记录幼虫运动 2 分钟。输出格式采用未压缩的 tif 图像。
- 记录过程中，从试剂瓶中收集下一批用于记录的幼虫进行驯化。关键步骤：记录时切勿用光照干扰正在记录的幼虫。
- 记录完成后，使用大号画笔移除幼虫，并根据当地安全规范和法律法规进行处理。
- 移除幼虫后，使用画笔蘸超纯去离子水清洁并润湿爬行表面。
- 关键步骤：始终维持表面湿润，但避免水分过多，过多水分会在录像中表现为幼虫周围的光晕或水滴，干扰追踪效果。
8. 可选：FIM 成像（梯度温度刺激条件）
- 在建立温度梯度后（见第6节），应在将幼虫放置于爬行表面后的20秒内准备好记录软件，立即开始记录（见8.2）。 例如， 设置每个视频的帧数并定义保存路径。
- 轻轻抬起散热板，将幼虫放置在距离盐屏障2 cm处，温度为33 °C的位置。有关进一步的常规操作说明，请参见步骤6和7。再次放下散热板，并在幼虫开始直线移动后立即开始记录，持续3-4分钟。
- 记录完毕后，立即移除幼虫，清洁并润湿表面。避免触碰盐琼脂，以防氯化钠扩散。
- 关键： 始终保持表面湿润，但避免过度潮湿，过度潮湿会在记录中表现为幼虫周围的光晕或液滴，并干扰追踪。
- 在润湿后静置1-2分钟，使琼脂表面再次达到平衡，同时保存图像并准备新的动物样本，以进行下一段视频录制。每录制5段视频后，使用测温仪检查温度梯度，并根据需要调节温控设备（包括水温、高度以及相对于追踪表面的x-y方向位置）。
9. 幼虫运动行为的追踪
注意：更多详细信息请参见随附的 FIMTrack 使用手册（补充材料）。程序流程图见图2。
- 使用预览功能根据各自的实验调整追踪参数。
- 根据相机和视野调整每厘米像素数。
- 根据相机设置调整每秒帧数。
- 调整亮度阈值，确保所有动物均被正确检测（预览中会提供反馈）。
- 调整幼虫区域大小的阈值。注意预览中的反馈选项：单个个体以黄色高亮显示，发生碰撞的幼虫以红色高亮显示，每个个体的面积以蓝色数字标出。
- 使用右下角的按钮开始跟踪。
注意：成功追踪后，包含幼虫运动轨迹的图像以及含有计算所得运动和姿态特征的 csv 文件将被存储在图像目录中。 - 使用 FIM 结果查看器模块（编辑 >结果查看器……）以查看并手动调整追踪结果。如有需要，定义刺激区域，以便根据刺激方案评估数据 例如， 相对于热梯度的爬行方向或距气味源的距离。有关更详细的描述，请参阅使用手册（补充材料）。
10. 数据评估
- 将 CSV 文件导入 Excel、Matlab 或其他任何程序，以进行进一步的统计分析。
结果
为进行成像，测试了多款具有不同分辨率特性的相机（图4）。所有相机均配备了适当的红外滤光片。根据本次测试中价格最低的相机分辨率较低的特点，其视场被限制在10 cm × 10 cm。使用400万像素（MP）相机时获得了最佳结果。该配置可实现每三龄幼虫体长100像素的分辨率，能够清晰识别内部结构。此外，动物的蠕动运动也可被轻松提取（图4A）。然而，使用价格较低的相机仍可获得高对比度的视频，这些视频同样可由FIMTrack软件进行分析。使用一款140万像素（MP）、8位深度、分辨率为1,392 × 1,040像素的相机，价格约为前者的一半，可在视场中实现每三龄幼虫体长45像素的分辨率。此时仅能识别头部结构，无法辨识其他内部结构（图4B）。尽管仍可进行运动追踪和蠕动检测，但准确性有所降低（图4B）。
使用空间分辨率与1.4 MP相机相当但价格更低廉的0.8 MP相机时，幼虫头部已无法被准确识别（图4C）。虽然仍可进行追踪和蠕动分析，但由于噪声增加，结果会包含更多抖动。令人意外的是，即使使用低分辨率USB网络摄像头（0.3 MP相机，价格低于20欧元），也能获得足够质量的视频以计算幼虫运动轨迹（图4D）。蠕动可通过面积变化进行计算，但测量结果噪声较大。
在我们的实验装置中，我们常规使用4 MP相机。用于筛选时，该相机可监测22 cm × 22 cm的实验区域，显然能够同时分析大量动物，从而实现高通量分析。采用此设置时，幼虫体长以40个像素表示，仍可实现对收缩运动的记录与分析。图5A展示了在温度梯度中15条幼虫运动轨迹的示例图像。此外，使用微距镜头可对幼虫进行极高分辨率成像，许多内部器官清晰可见，头部识别精度进一步提高（图5B）。这些图像还可用于对多种行为进行更详细的分析20。同一装置也可轻松用于成像爬行的C. elegans线虫（图5C）。
图4. 不同相机的FIM成像与追踪结果。（A）左侧：使用4 MP相机以10 fps拍摄的三只幼虫在10 cm × 10 cm追踪平台上爬行的FIM成像。中图：单只幼虫的剪裁图像及其质心轨迹，图中显示了动物的面积。右侧：幼虫面积在100帧时间内的变化曲线，红色箭头指示剪裁图像对应的时间点。（B）与（A）相同，但使用1.4 MP相机拍摄。（C）与（A）相同，但使用0.8 MP相机拍摄。（D）与（A）相同，但使用0.3 MP相机拍摄。请点击此处查看该图的高清版本。
图 5. 热刺激及高分辨率应用。（A）热刺激应用（与图 1对比）。轨迹通过 FIMTrack 计算得出。（B）使用宏镜头拍摄的三龄、二龄和一龄幼虫的高分辨率应用图像。在 2.5 × 2.5 cm 视野中，三龄幼虫的长度对应 400 个像素。（C）利用 FIM 成像技术捕获的C. elegans线虫图像。图中已标出比例尺。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
在行为神经科学中，必须对复杂的行为特征进行定量解析。因此，需要以高分辨率观察大量个体，并需要自动化程序来进行统计分析。本文介绍了一种新型、简单且稳健的成像装置——FIM 成像系统，该系统可用于监测多种动物的运动行为。通过果蝇幼虫、涡虫和C. elegans线虫验证了 FIM 成像系统的有效性。FIM 技术具有本征的高对比度，能够检测动物的内部结构，例如脑、气管、肠道或贲门胃。尤为重要的是，这些内部结构可被稳定识别，因而可用于自动确定动物的方位19。
爬行表面水分过多可能影响影片质量。因此，控制琼脂的湿度至关重要。琼脂过老或表面水分过多均可能导致伪影。同样，应确保爬行表面不含气泡。通常情况下，制备良好的琼脂表面可支持长达4小时的录像记录。
由于其基本的物理原理，FIM成像几乎不产生 噪声，从而获得极佳的图像质量。这进一步有利于后续的计算机图像分析，并实现高通量检测。然而，该方法仅限于分析直接接触琼脂表面的动物。当动物形成环状（甜甜圈形状）时，追踪软件会面临挑战。尽管二值化指标能够识别环状形态，但仍可能计算出错误的中轴线。
由于追踪表采用模块化设计，可实现双色和三色成像。此外，可轻松从上方施加额外的刺激（如光、气味分子、电或机械刺激）。专为充分发挥FIM成像能力而设计的FIMTrack程序，可便捷地用于追踪果蝇幼虫、C. elegans 或涡虫。因此，加之其结构简单且成本低廉（详见 http://FIM.uni-muenster.de），FIM成像技术适用于广泛的生物医学应用，尤其能够实现迫切需要的高通量研究。
披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
我们感谢 S. Thomas 发起了该项目，感谢 J. Hermann 和 U. Burgbacher 在构建 FIM 装置过程中提供的帮助。本工作由德国研究基金会（DFG，SFB 629 B6）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| FIM 装置设置 | Custom | 装置的构建或采购详情可应要求提供 | |
| 亚克力玻璃板 | Custom | 额外用于倾注琼脂 | |
| 散热板 | Custom | 铝制板（哑光黑色喷涂），相对两侧可通水，带可调节安装装置 | |
| 水加热/冷却泵及软管 | Custom | 基于 GE Healthcare MultiTempIII（编号：18-1102-78）和 Dr Bruno Lange GmbH（型号：LTG013） | |
| 标准相机（4 MP） | Basler | acA2040-25gm | FIM 装置默认使用的相机 |
| 测试相机（1.4 MP） | QImaging | 1394 火线（01-QIC-F-M-12 MONO） | 用于比较的相机 |
| 测试相机（0.8 MP） | Point Grey | Dragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS) | 用于比较的相机 |
| 测试相机（0.3 MP） | Sony | PS Eye USB2.0 相机 | 用于比较的相机 |
| 计算机 | Custom | 配备至少 i5 Intel 处理器或更高配置、16 GB 内存以及充足的硬盘存储空间 [>1TB] | |
| 标准果蝇食物 | Custom | ||
| 标准果蝇管（135 ml） | Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany | 78,895 | |
| 培养皿（9 cm） | Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany | 821,473 | |
| 超纯去离子水 | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | Synergy | |
| NaCl | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 3957.2 | |
| 食品级琼脂 | AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany | A0917,5000 | |
| 画笔（小号和大号） | Milan | Aquarell 310 0 号和 2 号 | |
| 红外测温仪 | Trotec | BP20 |
参考文献
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