小鼠胚胎感觉轴突投射的全组织成像

摘要

本文介绍了一种优化的实验方案，用于对胎鼠进行基因分型、染色及样本制备，以实现对整个动物体内周围伤害性感受器轴突投射的成像，从而有效评估遗传工程小鼠发育过程中感觉轴突生长的表型特征。

摘要

在胚胎中可视化全长神经元投射对于理解哺乳动物神经网络的发育过程至关重要。本文描述了一种标记全长神经元投影的方法 原位 利用多种基因操作小鼠品系，研究背根神经节（DRG）轴突投射的一个亚群，以评估其表型特征。TrkA阳性神经元为伤害感受神经元，专门负责传递痛觉信号。我们采用一种 TrkA^taulacZ 小鼠品系以标记完整小鼠胚胎中所有TrkA阳性外周轴突的投射路径。我们进一步培育该 TrkA^taulacZ 线接入 Bax 空白背景，该背景基本消除了神经元凋亡，从而能够在排除遗传操作对神经元存活潜在影响的前提下，独立评估与生长相关的问题。随后，将感兴趣的经遗传修饰的小鼠与 TrkA^taulacZ/Bax 空行，随后即可使用本文所述技术进行研究。本演示文稿包含小鼠繁育方案、解剖时的基因分型、组织制备、染色与透明化处理的详细信息，以实现对整体装片中完整轴突投射路径的可视化观察。

引言

精确神经网络的建立是一个复杂的发育过程，对神经系统功能至关重要。该过程的紊乱会导致神经元功能障碍，这已证实与人类神经系统疾病相关^1-3。为研究哺乳动物中轴突生长及靶向支配的潜在分子机制，我们开发了一种实验方案，通过结合两种基因修饰小鼠品系，可视化表达 TrkA 的感觉神经元的轴突投射路径。

TrkA 是神经生长因子 NGF 的受体，也是伤害性感觉神经元的功能标志物⁴TrkA 在发育早期的伤害感受性神经元中高表达，介导 NGF 依赖性的神经元存活、轴突生长、分支形成及靶组织支配^5-9在 TrkA^taulacZ 小鼠，野生型 TrkA 基因被替换为一个 taulacZ 表达盒¹⁰，从而可通过β-半乳糖苷酶（X-gal）染色观察到假定TrkA阳性神经元的轴突形态¹¹. 使用杂合子 TrkA^taulacZ/WT 通过该细胞系，我们可以研究可能调控或干扰感觉传入纤维投射发育的相关因素。 体内.

此外，TrkA^{taulacZ/taulacZ} 纯合小鼠中不存在 TrkA 表达，因此可用于在缺乏 NGF/....

方案

注意：所有操作均符合《美国国立卫生研究院实验动物使用与护理指南》。动物实验方案已由中国台湾康奈尔医学院 IACUC 批准。

1. 组织制备

1. 通过颈椎脱位法处死妊娠时间明确的雌性小鼠¹⁵。从妊娠时间明确的雌性小鼠中分离出胚胎期 E16–E18 的胚胎，并将每个胚胎单独置于6孔板的孔中，孔内预先加入冷的磷酸盐缓冲液（PBS）。
2. 用冷的 PBS 清洗胚胎。
3. 取胚胎羊膜的一小部分，放入预先配制好的蛋白酶 K 溶液中，用于后续基因型鉴定。或者，若羊膜已丢失，可取胚胎尾尖的一小部分，放入蛋白酶 K 溶液中。
4. 使用昆虫针在胚胎全身皮肤上穿刺打孔（每侧至少100个孔）。
5. 吸除 PBS，缓慢向孔中加入新鲜的 2% 多聚甲醛（PFA），pH 7.4。
6. 在 4 °C 下轻轻振荡固定 2 小时。
7. 用 PBS 清洗胚胎两次，随后将胚胎置于 PBS 中，4 °C 保存，待染色时使用。

2. 基因分型

1. 根据制造商说明书，将羊膜或胚胎尾部浸入蛋白酶K混合液中。
2. 在56 °C下孵育10分钟。
3. 使用市售的DNA纯化试剂盒提取DNA。
4. 取总共200 µl纯化基因组DNA溶液中的0.5 µl，加入0.....

结果

TrkA^WT/taulacZ : Bax^-/- 和 TrkA^{taulacZ/taulacZ} : Bax^-/- 胚胎的基因型可通过标准PCR基因分型明确确定（图1）。X-gal染色可在常规染色的胚胎中显示详细的外周轴突分支结构（图2、图3a），经组织透明化处理后则可观察整个胚胎内的轴突分布（图3b、图4）。

我们已培育出 TrkA^WT/taulacZ Bax^-/- 携带组成型激酶激活型B-RAF（V600E）突变（LSL-kaBraf）的小鼠品系¹⁶在神经元特异性巢蛋白启动子的调控下¹⁷，以获得 LSL-kaBraf : TrkA^{taulacZ/taulacZ} Bax^-/- 小鼠。在这些完全缺乏 TrkA 信号传导的胚胎中，伤害性感受器外周投射的形态仍然几乎正常地发育.......

讨论

上述胚胎X-gal染色步骤 TrkA^taulacZ 小鼠胚胎能够在完整固定的标本中实现长距离轴突投射的快速且详细的可视化。由于 Bax null背景的小鼠可用于探究可能参与轴突生长和神经元存活的信号机制。与感兴趣的转基因或基因敲除小鼠进行杂交，可对轴突表型进行全面评估，并可为未来更深入地研究轴突生长信号通路提供有用的指导。. 一个主要挑战是 体内 轴突生长研究中，制备组织切片并评估生长轴突的复杂表型所需的时间，是可能受到任何单一基因操作多方面影响的关键因素。 TrkA^{taulacZ/taulacZ} Bax^-/- 该品系可用于全面评估目的基因对周围伤害性感受器轴突发育的全部影响。

该技术仅限于可视化在早期发育阶段正常表达 TrkA 的伤害性感受器轴突轨迹。除了外周伤害性感受器外，还可能可视化交感神经和基底前脑胆碱能投射；然而，这需要对染色技术进行特定的优化。<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PFA	Sigma-Aldrich	P6418
PBS	Life Tech	10010-023
组织清洗液 A	Millipore	BG-6-B
组织清洗液 B	Millipore	BG-7-B
组织染色基础溶液	Millipore	BG-8-C
X-gal	Sigma-Aldrich	B4252
玻璃闪烁小瓶	Kimble Chase	74500-20
培养箱	Labline	Model 120
昆虫针	FST	26000-30
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
6 孔板	USA Scientific	CC7672-7506
引物	IDT	定制 DNA 引物
Takara dNTP 混合物	Takara	4030
Takara LA 缓冲液	Takara	RR002A
Takara LA Taq 酶	Takara	RR002A
PCR 仪	Bio-Rad	DNA Engine Dyad
苯甲醇	Sigma-Aldrich	B-1042
苯甲酸苄酯	Sigma-Aldrich	B-6630
体视显微镜	Leica	M205A
相机	Leica	DFC310FX
环形光源	Leica	MEB110
Photoshop	Adobe	Photoshop 4.0