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方法文章

小鼠胚胎感觉轴突投射的全组织成像

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DOI：

10.3791/52212

⸱

2014年12月9日

 ,  , 
1Brain and Mind Research Institute, Burke Medical Research Institute, Weill Medical College of Cornell University

本文内容

摘要

本文介绍了一种优化的实验方案，用于对胎鼠进行基因分型、染色及样本制备，以实现对整个动物体内周围伤害性感受器轴突投射的成像，从而有效评估遗传工程小鼠发育过程中感觉轴突生长的表型特征。

摘要

在胚胎中可视化全长神经元投射对于理解哺乳动物神经网络的发育过程至关重要。本文描述了一种标记全长神经元投影的方法 原位 利用多种基因操作小鼠品系，研究背根神经节（DRG）轴突投射的一个亚群，以评估其表型特征。TrkA阳性神经元为伤害感受神经元，专门负责传递痛觉信号。我们采用一种 TrkAtaulacZ 小鼠品系以标记完整小鼠胚胎中所有TrkA阳性外周轴突的投射路径。我们进一步培育该 TrkAtaulacZ 线接入 Bax 空白背景，该背景基本消除了神经元凋亡，从而能够在排除遗传操作对神经元存活潜在影响的前提下，独立评估与生长相关的问题。随后，将感兴趣的经遗传修饰的小鼠与 TrkAtaulacZ/Bax 空行，随后即可使用本文所述技术进行研究。本演示文稿包含小鼠繁育方案、解剖时的基因分型、组织制备、染色与透明化处理的详细信息，以实现对整体装片中完整轴突投射路径的可视化观察。

引言

精确神经网络的建立是一个复杂的发育过程，对神经系统功能至关重要。该过程的紊乱会导致神经元功能障碍，这已证实与人类神经系统疾病相关1-3。为研究哺乳动物中轴突生长及靶向支配的潜在分子机制，我们开发了一种实验方案，通过结合两种基因修饰小鼠品系，可视化表达 TrkA 的感觉神经元的轴突投射路径。

TrkA 是神经生长因子 NGF 的受体，也是伤害性感觉神经元的功能标志物4TrkA 在发育早期的伤害感受性神经元中高表达，介导 NGF 依赖性的神经元存活、轴突生长、分支形成及靶组织支配5-9在 TrkAtaulacZ 小鼠，野生型 TrkA 基因被替换为一个 taulacZ 表达盒10，从而可通过β-半乳糖苷酶（X-gal）染色观察到假定TrkA阳性神经元的轴突形态11. 使用杂合子 TrkAtaulacZ/WT 通过该细胞系，我们可以研究可能调控或干扰感觉传入纤维投射发育的相关因素。 体内.

此外，TrkAtaulacZ/taulacZ 纯合小鼠中不存在 TrkA 表达，因此可用于在缺乏 NGF/TrkA 信号传导的情况下评估促进轴突生长的机制。由于伤害感受神经元不仅依赖 NGF/TrkA 信号通路进行轴突生长，还依赖其维持存活，我们采用另一种缺失促凋亡基因 Bax 的小鼠品系，以抑制胚胎期背根神经节（DRG）神经元的凋亡，从而挽救在缺乏 TrkA 信号时通常发生的细胞死亡。Bax-/- 背景12 因此使得能够对特异性影响轴突生长的信号通路进行分子层面的解析7-9,13-15。在 TrkA-/- : Bax-/- 小鼠中，DRG 神经元得以存活，但皮肤中的感觉传入神经支配则完全消失14,15。我们可选择性地激活特定信号通路，以确定其各自在轴突投射发育过程中的作用。该方法的优势在于，允许评估当不同遗传修饰引入 TrkAtaulacZ/taulacZ : Bax-/- 或 TrkAtaulacZ/WT : Bax-/- 背景时，轴突生长表型发生的变化。

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方案

注意：所有操作均符合《美国国立卫生研究院实验动物使用与护理指南》。动物实验方案已由中国台湾康奈尔医学院 IACUC 批准。

1. 组织制备

  1. 通过颈椎脱位法处死妊娠时间明确的雌性小鼠15。从妊娠时间明确的雌性小鼠中分离出胚胎期 E16–E18 的胚胎，并将每个胚胎单独置于6孔板的孔中，孔内预先加入冷的磷酸盐缓冲液（PBS）。
  2. 用冷的 PBS 清洗胚胎。
  3. 取胚胎羊膜的一小部分，放入预先配制好的蛋白酶 K 溶液中，用于后续基因型鉴定。或者，若羊膜已丢失，可取胚胎尾尖的一小部分，放入蛋白酶 K 溶液中。
  4. 使用昆虫针在胚胎全身皮肤上穿刺打孔（每侧至少100个孔）。
  5. 吸除 PBS，缓慢向孔中加入新鲜的 2% 多聚甲醛（PFA），pH 7.4。
  6. 在 4 °C 下轻轻振荡固定 2 小时。
  7. 用 PBS 清洗胚胎两次，随后将胚胎置于 PBS 中，4 °C 保存，待染色时使用。

2. 基因分型

  1. 根据制造商说明书，将羊膜或胚胎尾部浸入蛋白酶K混合液中。
  2. 在56 °C下孵育10分钟。
  3. 使用市售的DNA纯化试剂盒提取DNA。
  4. 取总共200 µl纯化基因组DNA溶液中的0.5 µl，加入0.5 µl的各基因特异性正向与反向引物（10 µM）、2 µl dNTP混合液（dATP、dCTP、dGTP和dTTP均为2.5 mM）、0.2 µl Taq DNA聚合酶（5 U/µl）和2 µl PCR缓冲液（10×），用H2O补足至总体积20 µl。
    注：引物序列如下（表1）：
    TrkA：TrkA_F: GCG GGC GCC GCC GCG ATG，TrkA_R: GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG；PCR扩增片段长度：400个碱基对（bp）。
    Bax：In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG，Ex5F: TGA TCA GAA CCA TCA TG，NeoR: CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG；PCR扩增片段长度：野生型为304 bp，Bax基因敲除型为507 bp。
    TauLacZ：lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA，lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G；PCR扩增片段长度：360 bp。
  5. 对TrkA进行PCR扩增，程序如下：步骤1：95 °C下1分钟；步骤2：95 °C下10秒；步骤3：68 °C下20秒；步骤4：72 °C下30秒；重复步骤2至4共40个循环。
    1. 对LacZ和Bax进行PCR扩增，程序如下：步骤1：95 °C下1分钟；步骤2：95 °C下10秒；步骤3：54 °C下1分钟；步骤4：72 °C下1分钟；重复步骤2至4共35个循环。
  6. 将PCR样品在1×Tris-乙酸-EDTA缓冲液中，以100 V电压在2%琼脂糖凝胶上电泳20分钟，并设置DNA分子量标记条带以测定扩增片段长度。
  7. 分析胚胎中是否存在野生型TrkA、TrkA-tauLacZ以及Bax基因敲除等位基因。实验胚胎的基因型为TrkAtaulacZ/WT : Bax -/-和TrkAtaulacZ/taulacZ : Bax-/-，具体取决于实验设计。缺乏tauLacZ报告基因的胚胎将不显示轴突染色，因此可作为阴性对照用于校准染色过程。

3. 胚胎染色

  1. 使用商业化的 lacZ 染色试剂盒，并根据下文 第 3.2 - 3.8 节 所述进行部分修改。此处使用 Millipore 试剂盒。
  2. 将胚胎浸入缓冲液 A 中，于室温下轻轻振荡，至少孵育 1 小时。
  3. 将胚胎直接浸入缓冲液 B 中，于室温下轻轻振荡，至少孵育 15 分钟。
  4. 当胚胎处于缓冲液 A/B 中时，将组织基础溶液预热至 37 °C。每枚胚胎使用 5 ml 组织基础溶液。
  5. 当胚胎处于缓冲液 A/B 中时，用 100% 二甲基亚砜（DMSO）配制新鲜的 5-溴-​4-​氯-​3-​吲哚基-α-D-半乳糖吡喃糖苷（X-gal），使其浓度为 40 mg/ml。
  6. 将 X-gal 按 1 mg/ml 的终浓度稀释至预热的组织基础溶液中，并将 5 ml X-gal/组织基础溶液混合液加入玻璃闪烁瓶中。
  7. 将胚胎转移至含有 X-gal/组织基础溶液混合液的玻璃闪烁瓶中，用 Parafilm 封口膜密封瓶盖，在 37 °C 下过夜孵育，并观察蓝色染色的出现情况。
  8. 用新鲜的 4% 多聚甲醛（PFA，pH 7.4）对胚胎进行后固定处理，在 4 °C 下轻轻振荡 4 小时。
  9. 用冷 PBS 缓冲液清洗胚胎两次。

4. 组织脱水与透明

  1. 将胚胎置于50%甲醇/50% PBS混合液中，在室温下于玻璃小瓶中振荡30分钟。
  2. 继续在75%甲醇/25% PBS中于室温下振荡30分钟，进行脱水处理。
  3. 继续在90%甲醇/10% PBS中于室温下振荡30分钟，进一步脱水。
  4. 继续在100%甲醇中于室温下振荡30分钟（两次），完成脱水。
  5. 在胚胎脱水的同时，配制体积比为1:1的苯甲醇与苯甲酸苄酯混合液。
    注意：苯甲醇和苯甲酸苄酯具有毒性。
  6. 将胚胎浸入100%甲醇与100% BABB按体积比1:1配制的混合液中，孵育15分钟。仅可使用玻璃器皿，因为BABB会溶解塑料。
  7. 将胚胎浸入100% BABB中，直至组织完全透明，以便观察透明化胚胎中的X-gal染色结果。
    注意：应尽快成像，因为X-gal染色会随时间逐渐褪色。

5. 全组织成像

  1. 使用金属镊子将浸没在100% BABB中的胚胎固定在适合摄影的角度。采用透射光和反射光光源组合进行照明。
  2. 使用配备数字相机的体视显微镜采集图像。沿Z轴方向，每隔0.5 mm选取一个焦平面，连续获取五个焦平面的多张明场曝光图像。曝光时间和光圈值可根据照明条件和相机参数进行调整，并需针对每个实验装置优化设置。
  3. 使用标准图像处理软件对叠加图像进行处理，并生成拼接图。

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结果

TrkAWT/taulacZ : Bax-/- 和 TrkAtaulacZ/taulacZ : Bax-/- 胚胎的基因型可通过标准PCR基因分型明确确定（图1）。X-gal染色可在常规染色的胚胎中显示详细的外周轴突分支结构（图2、图3a），经组织透明化处理后则可观察整个胚胎内的轴突分布（图3b、图4）。

我们已培育出 TrkAWT/taulacZ Bax-/- 携带组成型激酶激活型B-RAF（V600E）突变（LSL-kaBraf）的小鼠品系16在神经元特异性巢蛋白启动子的调控下17，以获得 LSL-kaBraf : TrkAtaulacZ/taulacZ Bax-/- 小鼠。在这些完全缺乏 TrkA 信号传导的胚胎中，伤害性感受器外周投射的形态仍然几乎正常地发育...

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讨论

上述胚胎X-gal染色步骤 TrkAtaulacZ 小鼠胚胎能够在完整固定的标本中实现长距离轴突投射的快速且详细的可视化。由于 Bax null背景的小鼠可用于探究可能参与轴突生长和神经元存活的信号机制。与感兴趣的转基因或基因敲除小鼠进行杂交，可对轴突表型进行全面评估，并可为未来更深入地研究轴突生长信号通路提供有用的指导。. 一个主要挑战是 体内 轴突生长研究中，制备组织切片并评估生长轴突的复杂表型所需的时间，是可能受到任何单一基因操作多方面影响的关键因素。 TrkAtaulacZ/taulacZ Bax-/- 该品系可用于全面评估目的基因对周围伤害性感受器轴突发育的全部影响。

该技术仅限于可视化在早期发育阶段正常表达 TrkA 的伤害性感受器轴突轨迹。除了外周伤害性感受器外，还可能可视化交感神经和基底前脑胆碱能投射；然而，这需要对染色技术进行特定的优化。<...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

作者谨此感谢 Louis Reichardd 博士提供的 TrkAtaulacZ 小鼠，以及 Annette Markus 博士富有见地的讨论和建议。本研究得到了 Burke 基金会的启动资金，Whitehall 基金会研究资助（2010-08-61），Wings for Life 基金会研究资助（WFL-US-028/14），Christopher & Dana Reeve 基金会资助（ZB1-1102-1），以及美国国立眼科研究所资助（1R01EY022409 和 3R01EY022409-01S1）对 JZ 的支持。KJO 是 Goldsmith 研究员。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PFASigma-AldrichP6418
PBSLife Tech10010-023
组织清洗液 AMilliporeBG-6-B
组织清洗液 BMilliporeBG-7-B
组织染色基础溶液MilliporeBG-8-C
X-galSigma-AldrichB4252
玻璃闪烁小瓶Kimble Chase74500-20
培养箱LablineModel 120
昆虫针FST26000-30
DMSOSigma-AldrichD8418
6 孔板USA ScientificCC7672-7506
引物IDT定制 DNA 引物
Takara dNTP 混合物Takara4030
Takara LA 缓冲液TakaraRR002A
Takara LA Taq 酶TakaraRR002A
PCR 仪Bio-RadDNA Engine Dyad
苯甲醇Sigma-AldrichB-1042
苯甲酸苄酯Sigma-AldrichB-6630
体视显微镜LeicaM205A
相机LeicaDFC310FX
环形光源Leica MEB110
PhotoshopAdobePhotoshop 4.0

参考文献

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