我们介绍了一种快速、简便测量小鼠肺弥散能力的方法，并证明该方法对多种常见肺部疾病的表型变化具有足够的敏感性。由于弥散能力在人类中同样易于测量，因此该指标使小鼠模型具有直接的转化相关性。
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摘要
摘要
目前，小鼠是用于模拟多种肺部疾病的主要动物模型。为了研究这些病理背后的机制，需要采用能够量化病理变化的表型方法。此外，为了使小鼠模型具有转化医学意义，这类测量方法应当是在人类和小鼠中均易于实施的检测手段。然而，目前文献中很少有肺功能的表型测量方法可直接应用于人类。其中一项例外是一氧化碳弥散量（diffusing capacity for carbon monoxide），这是临床上常规用于人类检测的指标。在本报告中，我们描述了一种在小鼠中快速、简便测量一氧化碳弥散量的方法。该操作包括对麻醉小鼠进行短暂的肺部充气，使用示踪气体，随后进行1分钟的气体分析。我们已测试该方法检测多种肺部病理的能力，包括肺气肿、肺纤维化、急性肺损伤、流感病毒和真菌性肺部感染，以及监测幼鼠肺部的发育成熟过程。结果显示，在所有上述肺部病理状态下，一氧化碳弥散量均显著降低，而在肺部发育成熟过程中则呈现升高趋势。因此，肺弥散量的测定提供了一种肺功能检测手段，具有广泛的应用价值，能够检测现有大多数肺部病理模型中的表型结构改变。
引言
小鼠现已成为用于模拟多种肺部疾病的主要实验动物。为了研究这些病理背后的作用机制，需要采用能够量化病理变化的表型分析方法。尽管已有大量小鼠研究对通气力学进行了测量，但这些测量通常与临床上对人类肺功能的标准评估方法无关。这种情况令人遗憾，因为在小鼠和人类受试者中进行等效测量的能力，有助于将小鼠模型的研究结果更好地转化为对人类疾病的认知。
在人体受试者中，最常见且易于进行的测量之一是一氧化碳弥散量（DLCO）1,2，但在小鼠模型中，该测量却很少被实施。在已有报道的研究中3-7，尚未见后续研究跟进，部分原因在于这些实验操作通常较为繁琐，或需要复杂的设备。另一种方法是采用稳态系统中的一氧化碳重复呼吸法，其优势在于能够对清醒状态的小鼠进行一氧化碳扩散的测量。然而，该方法操作极为繁琐，且测量结果可能因小鼠通气水平以及O2和CO2浓度的变化而产生波动8,9。尽管一氧化碳弥散量检测具有多项优势，但上述困难似乎阻碍了其在小鼠肺部病理检测中的常规应用。
为避免小鼠弥散能力测量中的问题，近期已报道了一种在小鼠中进行该测量的简便方法10。该方法通过快速采集与整个吸入气体体积相等的样本，消除了采集未受污染的肺泡气体这一技术难题。该操作可获得高度可重复的测量值，称为一氧化碳弥散因子（DFCO），其对肺部表型的多种病理变化具有敏感性。DFCO 的计算公式为 1 – (CO9 / COc) / (Ne9 / Nec)，其中下标 c 和 9 分别指注入的校准气体以及在屏气 9 秒后采集的气体中的浓度。DFCO 是一个无量纲变量，取值范围为 0 到 1，1 表示所有一氧化碳被完全摄取，0 表示无一氧化碳摄取。
在本演示中，我们将展示如何进行弥散能力的测定，以及如何将其用于记录几乎所有现有小鼠肺部疾病模型中的变化，包括肺气肿、纤维化、急性肺损伤以及病毒和真菌感染。
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方案
注意：所有动物实验方案均经约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会批准。
1. 动物准备
- 按照下文步骤2.3所述方法，使用氯胺酮和赛拉嗪麻醉6只C57BL/6对照小鼠，以准备进行DFCO测量。
- 采用与对照组相同的操作步骤，准备表1中所列具有不同肺部病理状态的其他小鼠。建立每种模型所需的具体细节参见相关参考文献。对照小鼠及其他病理组小鼠的年龄均为6至12周。
2. 一氧化碳扩散因子（DFCO）的测定
- 设置仪器附带的气相色谱模块，用于检测氮气、氧气、氖气和一氧化碳的峰。本应用中仅使用氖气和一氧化碳的数据。
注意：该仪器使用分子筛色谱柱，载气为氦气，色谱柱膜厚为 12.00 µm，内径为 320.00 µm，长度为 10 m。色谱柱体积为 0.8 ml，但我们使用 2 ml 以确保样品连接管路得到充分冲洗。 - 在每个实验日开始时，在对小鼠样品进行测量之前，直接从含有约 0.5% 氖气、0.5% 一氧化碳及余量为空气的混合气体袋中抽取 2 ml 气体样品，并用此样品校准气相色谱仪。
- 使用氯胺酮（90 mg/kg）和赛拉嗪（15 mg/kg）对小鼠进行麻醉，并通过无反射性运动确认麻醉效果。在小鼠眼部涂抹兽用眼膏以防止干燥。使用短针套管（成年小鼠用 18 G，幼龄小鼠用 20 G）对小鼠进行气管切开术。
注意：DFCO 测量在麻醉后 10 分钟内完成，且在任何机械通气或其他操作之前进行。 - 对于年龄超过 6 周的小鼠，使用 3 ml 注射器从混合气体袋中抽取 0.8 ml 气体。将注射器连接至气管套管，迅速充气使肺扩张。使用节拍器计时 9 秒，然后迅速抽出 0.8 ml（呼出气体）。
- 将抽出的 0.8 ml 呼出气体用室内空气稀释至 2 ml，静置至少 15 秒。然后将整个样品注入气相色谱仪进行分析。
- 在分析第一个 DFCO 样品的同时，用混合气体袋中的另一份 0.8 ml 气体再次充盈小鼠肺部，随后以与第一个样品相同的方式处理该样品。取两次 DFCO 测量值的平均值。
注意：对于低至 2 周龄的小鼠，应使用 0.4 ml 的体积，因为 0.8 ml 对幼龄小鼠肺部而言体积过大。建议对 6 周龄以上小鼠使用 0.8 ml 体积；若某些小鼠需使用 0.4 ml 体积，则在同一研究队列中所有小鼠均应一致使用该体积。 - DFCO 的计算公式为 1 – (CO9 / COc) / (Ne9 / Nec)，其中下标 c 和 9 分别表示注入的校准气体和经过 9 秒屏气后采集气体的浓度。
- 使用单因素方差分析（one-way ANOVA）分析并比较各组小鼠之间的差异，并采用 Tukey 校正法评估多重比较的显著性水平。将 p <0.05 视为具有统计学意义。
注意：本研究所使用的所有小鼠均参与了涉及后续多次肺通气、肺力学、肺灌洗或组织学检测的实验研究，但这些内容未在此报告。此外，由于所有实验模型中的方法均与对照组小鼠所用方法相同，此处仅展示各种病理模型的结果。有关这些模型的更多信息见补充表格。 - 通过深度麻醉过量后实施颈椎脱位或断头法处死动物。如需进一步生物学或组织学处理与分析，可从死亡小鼠中取出肺细胞和/或肺组织。
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结果
图1展示了A、B、C、D、E和F组成年小鼠的DFCO测量结果。在曲霉菌和流感感染模型中，DFCO均出现显著下降，纤维化、肺气肿及急性肺损伤模型中也观察到显著降低。图2显示了G组小鼠在2至6周龄期间随着肺部发育，DFCO随时间变化的发育趋势。在此期间，随着肺的发育，DFCO呈现轻微但显著的升高。在6周时间点，使用较小充气容积的影响也十分明显。雌性小鼠的DFCO倾向于略高，但这种差异仅在5周时间点具有统计学意义。
| 组别 | 病理或状况 | 备注 |
| A | C57BL/6 对照组（8–10 周），n = 6 | 健康小鼠 |
| B | 经鼻内接种 25 TCID50 流感病毒 A 型（P... |
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讨论
在本研究中，我们定义了一种新的指标，用于量化小鼠肺部的气体交换能力。该指标类似于弥散能力，后者是一种常见的临床检测指标，用于测量肺的主要功能，即气体交换能力。弥散能力是唯一一种可在小鼠和人类中均能快速、简便完成的肺功能检测方法。在小鼠肺部疾病检测中，一个主要目标是量化对照组与实验组之间肺功能的变化。为实现这一目标，我们定义并应用了DFCO，以证明其在大多数常见小鼠肺部疾病模型中量化表型变化的能力，包括肺发育过程中的功能变化。
简化小鼠DFCO测量方法所固有的一项假设是，忽略了解剖死腔和器械死腔中未混合吸入气体的影响。然而，如先前所述10，使用0.8 ml的充气容积会在所有测量中引入虽小但一致的误差。该误差的大小取决于充气容积与死腔容积的相对比例。在本方法中，通过消除三通阀或T型连接管中的死腔，并如视频所示，仅用指尖封闭注射器以促进气体转移，从而将此误差降至最低。该操作使各次测量之间具有高度的可重复性。幼龄小鼠所需较小充气容积的影响在图2所示的6周龄小鼠中表现得尤为明显，其中每只小鼠先立即进行0.4 ml的测试，随后紧接着进行0...
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披露
无利益冲突，无可披露内容。
致谢
本工作由 NIH HL-10342 资助
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 气相色谱仪 | Inficon | Micro GC Model 3000A | Agilent 提供类似型号 |
| 18 G 鲁尔短针头 | Becton Dickenson | 其他多个供应商也可提供 | |
| 3 ml 塑料注射器 | Becton Dickenson | 其他多个供应商也可提供 | |
| 聚丙烯气体采样袋 | SKC | 1 或 2 L 容量效果良好 | 其他气密性采样袋也可使用 |
| 气体钢瓶，含 0.3% Ne、0.3% CO，余量为空气（ME 规格） | Airgas, Inc | Z04 NI785ME3012 | 此为人类 DLCO 检测中使用的标准混合气体 |
| 稀释于磷酸盐缓冲液中的流感病毒 A/PR8，剂量为每只小鼠 25 TCID50 | |||
| 猪胰弹性蛋白酶 | Elastin Products, Owensville, MO | 5.4 U | |
| 博来霉素 | APP Pharmaceuticals, Schaumburg, IL | 0.25 U | |
| Escherichia coli LPS | Sigma L2880 | 每克体重 3 μg；O55:B5 | |
| Aspergillus fumigatus （分离株 Af293）分生孢子取自马铃薯葡萄糖琼脂培养基上成熟的菌落 |
参考文献
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