一种方法的开发 体外 用于研究相互作用的模型系统 马属 caballus IgE 及其高亲和力受体 FcεRI

摘要

本研究描述了一种基于将马源FcεRIα基因转染入大鼠嗜碱性白血病细胞而构建的基因工程检测系统的开发与应用。转染后的细胞可表达功能性受体，其过敏反应介质的释放可由IgE和抗原激活。

摘要

IgE与其高亲和力Fc受体（FcεRI）结合后，再经抗原攻击，是介导IgE过敏反应的主要通路。由于IgE与FcεRI之间具有高亲和力结合特性，加之B细胞持续产生IgE，过敏通常终身存在，目前尚无永久性治愈方法。马，尤其是常被近亲繁殖的赛马，是极易发生超敏反应的哺乳动物物种，这些反应可严重影响其运动表现。马对过敏致敏的生理反应与人类和犬类中观察到的相似。本文描述了一种 原位 用于定量评估与马过敏反应相关的介质释放的检测系统。为此，编码马FcεRIα的基因被转染并表达于亲本大鼠嗜碱性白血病（RBL-2H3.1）细胞表面。转染后的马α链基因产物与内源性大鼠β链和γ链形成具有功能性的受体复合物。 ¹该检测系统可评估马源IgE致敏及抗原攻击后，转染了马FcεRIα的RBL-2H3.1细胞分泌介质的量，以β-己糖苷酶释放作为检测指标 ^{2, 3}介质释放率在100 ng/ml时达到峰值，为36.68% ± 4.88%^-1 抗原。该检测方法是在先前用于研究人类和犬类过敏反应的检测方法基础上改进而来的 ^{4, 5}我们还表明，此类检测系统在过敏性疾病诊断工具的开发以及潜在治疗干预策略的安全性评估方面具有多种应用。 ^{6, 2, 3}.

引言

过敏现象已为人所知数千年。古埃及医学文献《埃伯斯纸草书》（约公元前1550年）中记载了哮喘的治疗方法，并讨论了用于治疗该病的草药疗法⁷。

目前，过敏被归类为I型超敏反应，即免疫系统的辅助性T细胞2型（TH₂）介导针对环境抗原（称为变应原）产生免疫球蛋白E（IgE）抗体。这些变应原是多种多样的物质，通常与免疫系统中的细胞相互作用，刺激促炎性细胞因子（包括白细胞介素-4和白细胞介素-13^{8, 9}）的合成与分泌；香烟烟雾颗粒或柴油机尾气颗粒也具有类似作用，可增强IgE的合成¹⁰。

在过去50年中，工业化国家过敏表现的增加被认为是由环境污染物的影响以及环境日益卫生化趋势共同作用所致，这些因素共同促使免疫反应向以TH₂细胞因子为主导的模式偏移，这即是“卫生假说”所提出的内容¹¹。

如上所述，人类并非唯一受过敏困扰的哺乳动物。值得注意的是，马和狗也会产生典型的过敏反应，且一项研究¹²表明，与人类相似，马的过敏也与遗传和环境因素有关。因此，这些动物为研究遗传与环境因素在过敏发生中的相互作用、从致敏发展为疾病的过程，以及在临床症状出现后可能的干预策略提供了良好的模型

1887....

方案

1）细胞系的制备：

1. 构建表达马源 FcεRIα 的 RBL-2H3.1 细胞系：
   1. 采用基本的单层细胞培养技术，使用携带马源 FcεRIα 基因（GenBank: Y18204.1）的 pEE6 质粒对亲本 RBL-2H3.1 细胞进行转染²⁸。将 2 μg μl^-1 质粒 DNA 加入 0.8 ml 浓度为 1.2 × 10⁷ 个细胞 ml^-1 的细胞悬液中。使用 0.4 cm 电穿孔杯在 250 V、960 μF 条件下进行电穿孔，随后立即置于冰上孵育 10 分钟。
   2. 使用含 0.4 g 遗传霉素 G418 硫酸盐的培养基筛选转化细胞，再通过荧光标记的 IgE 抗体对存活细胞进行 FACS 分选。将获得的表达马源 FcεRIα 的 RBL-2H3.1 细胞系用于后续研究^{2, 3}。
2. 检测前抗体致敏：
   1. 从融合生长的培养皿中收获表达马源 FcεRIα 的 RBL-2H3.1 细胞，洗涤后重悬于培养基中，调整细胞密度至 5 × 10⁵ 个细胞 ml^-1。
   2. 向细胞悬液中加入目标 IgE 抗体，使其终浓度为 1 ng ml^-1，随后将 100 μl 细胞悬液加入 96 孔板....

结果

将亲代 RBL-2H3.1 细胞及转染了马源 FcεRIα 受体基因的细胞首先用小鼠抗 DNP-HSA IgE 致敏，随后以 DNP-HSA 抗原进行激发。小鼠 IgE 可结合两个细胞系中内源性的大鼠受体，因此可作为对照，用于检测两个细胞系释放介质的能力（图 1 A）。该对照至关重要，应常规进行，因为在细胞培养中长期传代（> 10 周）后，RBL-2H3.1 细胞会逐渐向非分泌表型漂移²⁷。亲代细胞介导物释放峰值为 51.54% ± 4.79%，而表达马源 FcεRIα 受体的细胞介导物释放峰值为 45.99% ± 5.76%。随后，这两个相同的细胞系用马源抗 NIP-HSA IgE 致敏，并以 NIP-HSA 抗原进行激发（图 1 B）。亲代细胞未发生介质释放，因为马源 IgE 无法结合内源性大鼠受体。相反，如预期所示，表达马源 FcεRIα 受体的 RBL-2H3.1 细胞在用马源抗 NIP-HSA IgE 致敏并以 NIP-HSA 抗原激发后，发生了介质释放，其峰值释放率为 36.68% ± 4.88%。

讨论

总之，本研究的结果表明，当表达马源 FcεRIα 的 RBL-2H3.1 细胞经马源 IgE 致敏并受到抗原刺激时，其释放的介质峰值达到细胞内介质总量的 36.68% ± 4.88%，而未表达马源 FcεRIα 的 RBL-2H3.1 亲本细胞则无此反应。

因此，该检测方法为研究马类过敏反应提供了一种有用的工具 体外它能够测定肥大细胞/嗜碱性粒细胞谱系细胞释放的介质数量，因此有望推动马类过敏症的研究，无论是在评估致敏原方面，还是在研究IgE/受体阻断剂方面。

该检测方法经修改后用于研究马的过敏反应，此前已有文献报道其被用于研究人类和犬类的过敏反应。 ⁴⁵²⁹ 出于相同目的，采用表达人和犬 FcεRIα 的基因工程细胞系来研究过敏阻断剂（如以抑制 IgE/受体相互作用为靶点的疫苗）的有效性和安全性 ³⁰研究发现，包含完整Cε3结构域的免疫原具有过敏毒素样副作用，其他研究者曾提议将此类免疫原作为疫苗用于减弱犬类IgE介导的过敏反应 ²⁴根据我们的研.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
表达马FcεRIα的RBL-2H3.1细胞	-	-	实验室制备
抗NIP-HSA的马IgE	-	-	实验室制备
96孔板	Sigma	CLS3595	-
多通道移液器	Anachem	-	-
培养箱	Galaxy R	-	-
4-羟基-5-碘-3-硝基苯乙酸	Cambridge Research Biochemicals	N-1070-1	NIP-OH在实验室中与人血清白蛋白偶联制备NIP-HSA
二硝基苯偶联人血清白蛋白	Sigma	A6661	缩写为DNP-HSA
酶标仪	Anthos Labtec HT2	-	-
PIPES	Sigma	P1851	-
氯化钠	Sigma	S7653	-
氯化钾	Sigma	P9333	-
氯化镁	Sigma	M2670	-
氯化钙	Sigma	C1016	-
Triton X-100	Sigma	X100	-
4-硝基苯基 N-乙酰-β-D-葡糖胺	Sigma	N9376	储存液称为β-己糖胺酶底物，用DMSO配制成50 mM
二甲基亚砜	Sigma	D2650	-
柠檬酸	Sigma	251275	-
乙酸钠	Sigma	S7670	-
Tris	Sigma	T5941	-