用于神经保护策略中治疗因子递送的成体干细胞工程化高通量表征

摘要

本研究描述了一个实验平台，可用于在工程化干细胞应用于长期研究之前，快速表征这些细胞及其行为 体内 用于神经系统挽救与修复的移植研究

摘要

骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）是一种强大的细胞资源，已被众多研究用作开发多种疾病治疗策略的潜在候选细胞。本研究的目的是开发并表征经过基因工程改造、可递送治疗因子的MSCs，作为保护受损或病变神经系统的神经保护策略的一部分。在本研究中，我们使用了经慢病毒载体进行基因修饰的小鼠MSCs，该载体编码脑源性神经营养因子（BDNF）或胶质细胞源性神经营养因子（GDNF），同时编码绿色荧光蛋白（GFP）。

在继续进行之前 体内 移植研究中，表征经基因改造的细胞至关重要，以确定基因修饰是否改变了细胞正常行为的某些方面。本研究考察了不同培养基质对四种基因工程间充质干细胞亚群的细胞黏附、增殖、存活及迁移能力的支持作用。进行了高内涵筛选（HCS），并进行了图像分析。

所检测的基质包括：聚-L-赖氨酸、纤连蛋白、I型胶原、层粘连蛋白、 entactin-collagen IV-laminin（ECL）。采用Ki67免疫标记法检测细胞增殖，使用碘化丙啶染色法检测细胞活力。使用高内涵筛选系统上的透射光/环境培养箱系统进行活细胞延时成像。

我们的结果表明，经基因修饰的MSC不同亚群表现出相似的行为，且总体上与原始的未修饰MSC具有可比性。在不同MSC亚型以及培养基质之间，不同培养基质对细胞生长和细胞迁移的影响并无显著差异。

本研究提供了一种实验策略，可在工程化干细胞应用于长期研究之前，快速表征这些细胞及其行为 体内 用于神经系统挽救与修复的移植研究

引言

在治疗神经系统疾病方面，实施有效疗法的一个主要难题在于开发出既能防止进一步退化又能促进功能恢复的有效方法。一种创新的策略是通过基因工程改造干细胞 离体，以产生神经保护因子，然后再进行移植。这种细胞治疗与基因治疗相结合的方法，为治疗神经系统中由疾病或损伤引起的神经元死亡提供了一种强有力的手段。

神经营养因子对于发育中神经元的生长和存活以及成熟神经元的维持和可塑性至关重要。大量研究已证明，神经营养因子在促进中枢和周围神经系统（CNS 和 PNS）中神经元的初始生长和分化方面具有重要作用，并且还能在体外以及神经损伤的动物模型中刺激再生in vitro和在神经损伤的动物模型中¹。脑源性神经营养因子（BDNF）在中枢神经系统中高表达，在调控神经发育、突触可塑性和修复过程中发挥重要作用²。胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）可促进多种类型神经元的存活，包括多巴胺能神经元和运动神经元³。因此，一种重要的神经修复策略是向神经系统受损或病变区域提供外源性的神经营养因子。

多能骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）在向受损或病变的神经系统递送治疗性蛋白方面具有巨大潜力。由于MSCs具有多种优势，其移植在开发患者兼容的细胞治疗策略中已受到广泛关注，这些优势包括：1）分离和培养相对简便；2）具有多向分化潜能；3）伦理问题较少；4）移植后能够存活并迁移；以及5）具备自体移植的潜力^4,5。在多种神经退行性疾病的动物模型中，使用未经修饰的和基因工程改造的MSCs已报道出令人鼓舞的结果，包括脊髓损伤^6,7、脑卒中^8,9、髓鞘缺乏¹⁰以及视网膜变性^11-13。将细胞移植与基因工程干细胞递送神经营养因子相结合，是一种新颖且重要的神经修复策略。

开发基于细胞的治疗因子递送系统时，一个关键步骤是确定工程化细胞的正常健康状况。因此，本研究的主要目的是评估基因工程成体干细胞的一般生长参数。一种快速评估多个细胞参数的重要方法是采用基于细胞成像的高通量筛选（HTS），通常称为高内涵筛选（HCS）技术¹⁴。该技术可实现自动化的图像采集与分析，特别适用于干细胞研究的应用。在本项目中，我们建立了一个分析平台，利用高内涵筛选系统对基因工程成体干细胞的细胞基质偏好性和细胞功能进行快速表征与优化。

方案

1. 96 孔板的底物准备

1. 创建96孔板的示意图，标明待检测的不同底物和细胞类型（图 1）。
2. 准备不同底物的储存液［聚-L-赖氨酸、纤连蛋白、I型胶原、层粘连蛋白以及entactin-collagen IV-laminin（ECL）］、96孔板，并在无菌细胞培养操作台中设置工作区域。
3. 用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）将各底物储存液稀释至终浓度为5 µg/ml（该浓度此前已通过细胞生长与增殖的底物浓度依赖性实验确定）。在加入无菌储液槽前，使用涡旋振荡器充分混匀。
4. 根据96孔板示意图（图1），向各孔中加入100 µl底物溶液（使用12通道或8通道微量移液器可方便地向96孔板加样）。用Parafilm封口膜将板盖密封，并于4 °C过夜孵育。

2. 细胞铺板与延时成像

注意：小鼠间充质干细胞（MSCs）分离自成年C57BL/6小鼠的骨髓，并以贴壁细胞系形式进行培养。使用慢病毒载体感染MSCs，使其能够分泌脑源性神经营养因子（BDNF；人cDNA）和胶质细胞源性神经营养因子（GDNF；人cDNA），所用慢病毒载体分别编码BDNF（LV-BDNF；CMV-BDNF-IRES-GFP）、GDNF（LV-GDNF；CMV-GDNF-IRES-GFP）以及绿色荧光蛋白（GFP，LV-GFP；CMV-GFP）。
注意：小鼠间充质干细胞（MSCs）的培养基为Iscove改良的Dulbecco培养基，含有10%杂交瘤细胞合格胎牛血清、10%马血清、2 mM L-谷氨酰胺、10,000 U/ml青霉素和10 mg/ml链霉素。五种不同类型的小鼠MSCs（MSCs、GFP-MSCs、BDNF-GFP-MSCs、GDNF-GFP-MSCs和BDNF/GDNF-GFP-MSCs）以约30%汇合度接种于T75细胞培养瓶中。

1. 细胞铺板
   1. 次日，用移液枪吸除各孔中的底物溶液，每孔用约 200 µl 无菌 PBS 洗涤两次。最后一次 PBS 洗涤后，向每孔加入细胞培养基（200 µl/孔）。将 96 孔板置于设定为 37 °C 和 5% CO₂ 的细胞培养箱中₂ 用于平衡。
   2. 在96孔板于培养箱中平衡的同时，收集T75培养瓶中的细胞（收获/铺板时，间充质干细胞在T75培养瓶中的汇合度应约为70%），将生长培养基（称为条件培养基）从T75培养瓶中收集，并在无菌条件下储存于15 ml锥形管中（该条件培养基将在后续步骤2.1.4中使用）。
   3. 向培养瓶中加入 8 ml 无菌 PBS，轻轻摇晃后吸去 PBS，然后加入 1 ml 0.05% 胰蛋白酶和 0.01% EDTA 溶液，以使细胞从 T75 培养瓶的培养表面脱落。使用配备相差光学系统的倒置显微镜观察培养瓶，监测细胞脱落情况。
   4. 当细胞脱落后，立即向培养瓶中加入 8 ml 预先收集的条件培养基（步骤 2.1.2 中收集）。收集细胞悬液并转移至 15 ml 圆锥形离心管中，在 450 × g 条件下离心 4 分钟以沉淀细胞。
   5. 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于200 µl新鲜且预热至37 °C的细胞培养基中。
   6. 使用血细胞计数板通过台盼蓝染色活细胞计数法测定细胞悬液中的细胞数量。将细胞以每孔约300个细胞的密度接种至96孔板的相应孔中。
   7. 对每一群细胞重复上述步骤。
2. 延时成像
   1. 待所有MSCs接种完成后，将96孔板放入培养箱中孵育2小时，以使MSCs贴附于基质。
   2. 启动HCS系统，等待2小时使系统平衡。将环境控制器设置为37 °C，并连接含有5% CO的混合气体钢瓶₂ 向HCS系统环境箱供应恒定气源。
   3. 将96孔板从培养箱中取出，结束2小时的平衡期后，直接放入HCS系统的细胞培养腔内。静置30分钟以平衡因温度变化引起的孔板热膨胀，随后启动成像与分析软件，配置孔板参数设置。
   4. 选择20倍物镜进行成像。每种条件选择两个孔即， 纤连蛋白上的GFP-MSCs 等等。 （6种底物 × 5种MSC亚型，共30种条件 × 2个重复 = 总计60个孔），用于设置延时成像。在每个孔内选择两个成像位点。
   5. 选择成像的合适光波长。
      注意：选择两个不同的波长（相差和GFP荧光）进行延时成像。
   6. 使用激光自动对焦聚焦于孔板底部，并对多个位点和多个孔进行试拍成像，以找到最佳焦平面。
   7. 确定焦点后，对全部60个孔（120个位点）每5分钟采集一次图像，持续48小时。
   8. 每隔24小时更换一次细胞培养液，将96孔板从HCS系统中取出。从每孔中移除75 µl培养基，并向每孔中加入100 µl预热至37 °C、5% CO₂平衡的新鲜培养基。₂).
   9. 延时实验结束后，从高内涵筛选系统中取出96孔板。在无菌条件下，从每个孔中收集条件培养基样本，并将这些样本转移至另一块96孔板中。
      注意：这些样本可用于进一步分析，可通过ELISA检测神经营养因子。
   10. 为后续实验（如Ki67细胞增殖检测或碘化丙啶活/死细胞染色检测）准备接种有培养MSC的96孔板（详见下文）。
   11. 按照所述方法进行细胞迁移/细胞示踪的延时成像分析 第5节 如下。

3. Ki67 细胞增殖与碘化丙啶活/死细胞检测

1. Ki67 细胞增殖检测（免疫细胞化学）
   1. 用 0.1 M 磷酸盐（PO₄）缓冲液冲洗细胞培养物，每次 1 分钟，共冲洗两次。在室温下用 4% 多聚甲醛（PFA）固定培养物 20 分钟。去除 PFA，并用 PBS 冲洗孔板，每次 7 分钟，共三次。
   2. 最后一次冲洗后，向每孔加入 100 µl 阻断液（磷酸盐缓冲液，5% 正常驴血清，0.4% 牛血清白蛋白，0.2% Triton X-100），在室温下孵育 1 小时。将兔抗 Ki67 一抗用阻断液按 1:200 的工作比例稀释后备用。
   3. 去除阻断液，向每孔加入 100 µl 一抗溶液。盖上 96 孔板，在 4 °C 下过夜孵育。
   4. 次日，去除一抗溶液，用 PBS 冲洗 7 分钟，重复三次。
   5. 将二抗（驴抗兔 Cy3）用阻断液按 1:500 的工作比例稀释，并在二抗溶液中加入 DAPI 核染液，稀释比例为 1:100。最后一次 PBS 冲洗后，向每孔加入 100 µl 二抗/DAPI 混合溶液。在室温下避光孵育 90 分钟。
   6. 去除二抗/DAPI 溶液，用 PBS 冲洗每孔，每次 7 分钟，共三次。盖上 96 孔板，于 4 °C 保存直至成像。
2. 碘化丙啶活/死细胞检测
   1. 采用碘化丙啶（PI）排除法检测细胞死亡，具体步骤如下所述。
   2. 在培养基中配制浓度为 1.5 µM 的碘化丙啶染色液。
   3. 向一孔间充质干细胞（MSCs）中加入 100 µl 70% 乙醇，处理 2 分钟以杀死细胞。该孔作为 PI 染色的阳性对照。大多数 MSCs 将被 PI 染色，表明细胞死亡。随后去除乙醇溶液。
   4. 向每孔加入 100 µl 碘化丙啶染色液，在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 20 分钟。
   5. 用 0.1 M 磷酸盐缓冲液冲洗细胞，每次 1 分钟，共两次。在室温下用 0.1 M PO₄ 缓冲液中的 4% PFA 固定细胞 20 分钟。去除 PFA 后，用 PBS 冲洗三次，每次 7 分钟。
   6. 将 DAPI 溶液（1:50 稀释于阻断液中）加入各孔，在室温下孵育 1 小时。用 PBS 冲洗所有孔，每次 7 分钟，共三次。
   7. 去除 DAPI 溶液，用 PBS 冲洗每孔，每次 7 分钟，共三次。盖上 96 孔板，于 4 °C 保存直至成像。

4. 自动化成像与多波长评分分析

1. 将已进行 Ki67 免疫标记或碘化丙啶染色处理的 96 孔板载入高内涵筛选（HCS）系统，静置平衡 20 分钟，然后打开 HCS 系统的图像采集与分析软件。
2. 选择 10X 物镜的采集参数，相机 binning 设置为 1，增益设置为 2。利用自动曝光功能确定细胞所在的 Z 平面，并计算每个目标波长的偏移量。本分析中需采集 DAPI（W1）、Cy3（W2）和 FITC（W3）的图像。选择在阴性对照孔无信号时的最大强度水平进行图像采集，并确认该设置适用于阳性孔。
3. 开始采集整块板的图像，并将图像存储至图像采集与分析软件的数据库中。
4. 图像采集完成后，打开 HCS 系统的离线图像分析软件，调阅并查看上述采集的图像数据。
5. 选择多波长评分分析模式，为每个波长设置最小和最大强度阈值。
   注意：DAPI 检测应标记每个可见细胞核周围的染色区域。Cy3 应检测出具有 Ki67 免疫反应性（IR）的阳性细胞，而在阴性对照条件下不应出现免疫反应信号。对于 Cy3 标记的 Ki67 免疫反应性，其近似最小宽度为 7 µm，近似最大宽度为 30 µm，信号强度需高于局部背景 150 个灰度级，最小染色面积为 50 µm²。
6. 对所有位置运行分析，将结果数据导出至电子表格中进行查看。

5. 细胞追踪

1. 打开图像采集与分析程序，点击“Review Plate Data [DB]…”，选择目标孔板。
2. 以“时间 vs. 孔”形式查看数据。
3. 在“Sites”部分中，通过左键点击选择其中一个位点。在“Wavelengths:”下选择“Transmitted…”。在96孔板模板中右键点击目标孔，然后点击“Load Images”。
4. 点击“Apps”，然后选择“Track Objects”，以追踪细胞。
5. 使用“动态数据交换 (DDE)”选择数据导出格式，e.g., Microsoft Excel。
6. 选择要导出的追踪数据，e.g., 经过时间、对象编号、移动距离、时间间隔、速度、绝对角度、距原点距离、Δx 和 Δy。
7. 按住“Ctrl键”并左键点击目标细胞，为每个感兴趣的细胞添加标签。
8. 开始细胞追踪。如有必要，按“Esc”键暂停或更正错误的追踪路径，然后调整设置。
9. 细胞追踪完成后，使用“Log Data”保存数据。

结果

通过在不同基质上培养不同群体的间充质干细胞（MSC），检测了MSC的生长参数。如图1所示，将五种不同类型的MSC亚群（MSCs、GFP-MSCs、BDNF-GFP-MSCs、GDNF-GFP-MSCs和BDNF/GDNF-GFP-MSCs）接种于预先包被不同基质的96孔组织培养板中。培养四天后，固定培养板，并使用适当的试剂进行免疫标记和/或染色，随后利用高内涵筛选（HCS）系统进行观察，并通过图像采集与分析软件程序进行数据分析。

图1：实验设计用96孔板模板。 如模板所示，将96孔板用不同基质包被，并接种工程化干细胞。例如，本实验仅使用了B至F行的孔，A、G和H行保持空白。缩写 – MSCs：间充质干细胞；GFP-MSCs：表达绿色荧光蛋白的间充质干细胞；BDNF-GFP-MSCs：表达脑源性神经营养因子-绿色荧光蛋白的间充质干细胞；GDNF-GFP-MSCs：表达胶质细胞源性神经营养因子-绿色荧光蛋白的间充质干细胞；BDNF/GDNF-GFP-MSCs：同时表达BDNF和GDNF-绿色荧光蛋白的间充质干细胞；ECL：层粘连蛋白-IV型胶原-连环蛋白（Entactin-Collagen IV-Laminin）。

采用抗Ki67免疫标记结合DAPI复染，以评估不同基质是否影响各类型基因工程间充质干细胞（MSCs）的增殖能力（图2A）。Ki67抗原的表达主要发生在细胞周期的晚G₁期、S期、G₂期和M期，而在静息期（G₀）细胞中不可检测，因此可作为细胞增殖的有效标志物¹⁵。4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）是一种常用的细胞核和染色体复染剂，与DNA的AT区域结合后可发出蓝色荧光¹⁶。通过计数DAPI染色的细胞核数量，可确定视野中的细胞总数。如图2B所示，尽管不同MSC亚型中增殖细胞的比例存在差异，但所有基质均能支持各MSC亚型的显著增殖。

图2：Ki67细胞增殖检测。（A） Ki67免疫标记（红色）与DAPI核染色（蓝色）的融合双荧光图像。许多间充质干细胞被Ki67抗体免疫标记（红色）。比例尺＝50 µm。 （B） 柱状图显示在聚苯乙烯（PS）、聚-L-赖氨酸（PLL）、纤连蛋白、I型胶原、层粘连蛋白或 entactin-collagen IV-laminin（ECL）基质上培养5天的Ki67免疫标记MSC亚型的百分比 体外 （体外培养天数）。N = 一次实验。每根柱代表每种条件下来自2个孔中8个成像位点的平均合并数据。 请点击此处以查看此图的放大版本。

采用碘化丙啶（PI）染色法评估不同基质是否影响细胞存活（图3）。碘化丙啶是一种常用的红色荧光细胞核和染色体复染染料。碘化丙啶不能穿透细胞膜，通常被活细胞排除在外，因此可用于检测群体中的死亡细胞。当与DAPI等通用细胞核标记物结合使用时，可确定特定视野中所有细胞内的死亡细胞比例。在所检测的所有基质上，PI阳性细胞的比例均较低（图3）。为验证PI试剂的有效性，将部分含有MSC的孔用已知可杀死大多数细胞的70%乙醇处理作为阳性对照，结果显示PI标记细胞比例显著升高，如图3B和3C所示（乙醇处理阳性对照）。

图3：碘化丙啶细胞死亡检测。(A) 碘化丙啶（红色）与 DAPI（蓝色）染色的融合双荧光图像。尽管所有活细胞的细胞核均被 DAPI（蓝色）染色，但在间充质干细胞（MSCs）中未检测到碘化丙啶染色信号。 (B) 几乎所有MSCs在接触70%乙醇后均被碘化丙啶染色。A和B中的比例尺 = 100 µm。 (C) 柱状图显示在聚苯乙烯（PS）、聚-L-赖氨酸（PLL）、纤连蛋白、I型胶原、层粘连蛋白或 entactin-collagen IV-laminin（ECL）基质上培养5天的碘化丙啶（PI）染色MSC亚型的百分比 体外 （体外培养天数）。乙醇对照：该条件作为PI染色试剂的阳性对照。经乙醇处理后接受PI染色的大多数细胞已死亡，因此对PI试剂呈阳性染色。N = 一次实验。每根柱状图代表每种条件下来自2个孔中8个成像位点的合并数据的平均值。 请点击此处以查看此图的放大版本。

为了研究不同基质对基因工程改造的间充质干细胞（MSCs）行为的可能影响，采用延时数字显微镜结合HCS系统上的透射光/环境培养箱系统分析细胞迁移（参见补充视频1）。对每个孔中的多个位点进行延时成像，并利用图像采集与分析软件计算在不同基质上生长的MSC各亚群的细胞迁移速率。总体而言，如图4C所示，所有MSC亚型在细胞外基质包被表面（纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白和ECL）上的迁移速度最快，而在未包被的聚苯乙烯表面迁移最慢。

图4：细胞示踪与迁移。 使用图像采集与分析软件追踪MSCs。透射光与荧光图像的叠加图像 （A） 延时成像的开始 (B) 29小时后，在延时成像实验结束时（参见 补充视频 1细胞迁移轨迹由彩色线条标示。比例尺：50 µm。 (C) 柱状图显示了间充质干细胞亚型在聚苯乙烯（PS）、聚-L-赖氨酸（PLL）、纤连蛋白、I型胶原、层粘连蛋白或 entactin-collagen IV-laminin（ECL）基质上培养2天后的平均迁移速率（以 µm/hr 表示） 体外 （体外培养天数）。N = 一次实验。每组条件下每个时间点的数据来自2个孔中至少10个成像细胞的平均值。 请点击此处以查看此图的放大版本。

综上所述，这些结果提供了初步证据，表明这些基因工程改造的MSC亚群具有相似的生长特性。这些结果有力地证明，通过慢病毒介导的基因修饰对这些MSC进行改造后，对该筛选平台所检测的生长参数未引起明显可察觉的有害影响。

补充视频 1。 使用图像采集与分析软件程序对间充质干细胞（MSC）进行追踪的延时数字视频。图中展示了两个间充质干细胞的迁移路径［分别标记为 1（绿色追踪线）和 2（蓝色追踪线）］。视频记录时长为 29 小时，每 5 分钟采集一次图像。制备该视频时采用表达 GFP 的间充质干细胞的荧光图像进行延时成像。标尺 = 50 µm。此类分析可用于研究细胞行为，包括细胞迁移和细胞分裂。

讨论

成体间充质干细胞（MSCs）是一种理想的细胞类型，可用于开发结合细胞治疗与基因递送治疗的实验策略。MSCs具有多向分化潜能，能够分化为中胚层谱系的细胞，并表现出显著的可塑性，在适当的诱导条件下可分化或转分化为神经元和胶质细胞谱系^17,18。此外，MSCs已在多种疾病的临床前研究中被移植并证明有效，包括神经退行性疾病¹⁹。MSCs的治疗效果广为人知，主要归因于其有益的抗增殖、抗炎和抗凋亡活性²⁰。MSCs还被证实能够产生并分泌多种神经营养因子和生长因子，这可能有助于在损伤或疾病部位移植后，未修饰MSCs所表现出的神经保护特性²¹。重要的是，MSCs可通过基因修饰实现神经营养因子的持续递送，从而用于细胞治疗与基因治疗相结合的应用，并已在多种中枢神经系统损伤或疾病的动物模型中得到应用^11,19,22。

在开发联合细胞治疗与基因治疗策略的过程中，至关重要的是在细胞广泛用于体外（in vitro）尤其是体内（in vivo）应用之前，仔细评估其健康状态。作为概念验证，我们研究了多种经基因工程改造的间充质干细胞（MSC）系及对照组MSC系，以利用高内涵筛选（HCS）方法评估基因修饰对细胞健康与适应性的影响。通常而言，HCS指基于细胞成像的高通量筛选¹⁴。该筛选方法可在多种实验条件下，对细胞表型在空间（从细胞到亚细胞水平）和时间（从毫秒到数天）尺度上进行定量评估。通过该方法，我们检测了不同培养基质对以下参数可能产生的影响：细胞增殖、绿色荧光蛋白（GFP）表达、细胞死亡以及细胞运动性/迁移能力。实验采用96孔细胞培养板设计。在单个培养板内，我们常规性地比较了不同慢病毒转导的MSC群体在各参数上可能存在的基质相关差异，并将基因工程改造的MSC与原始未转导的MSC进行对比。这使得我们能够通过一系列体外（in vitro）检测方法直接比较不同MSC亚型的结果，例如利用Ki67免疫标记检测细胞增殖、采用碘化丙啶染色进行活/死细胞活力检测，以及通过延时数字成像分析细胞行为。在此HCS基础上，还可对从各个孔中收集的条件培养基样本进行ELISA检测，以定量测定神经营养因子的分泌水平。不同MSC亚型的条件培养基也可用于体外（in vitro）生物活性检测，以评估分泌因子的生物学功能^11,23。此类HCS平台还可用于检测原代神经元培养物及神经干细胞系的体外（in vitro）神经突生长情况²⁴。总体而言，我们的结果表明，经基因修饰的MSC亚群在行为表现上与未经修饰的MSC相似。不同MSC亚型之间，以及不同培养基质之间，对细胞生长和迁移的影响并无显著差异。因此，所测试的细胞外基质基质似乎并未在调控这些工程化MSC细胞行为方面发挥关键作用。

本研究展示了利用高内涵筛选（HCS）系统分析细胞行为不同方面的应用。然而，在图像分析过程中遇到某些局限性也是常见现象。在分析荧光图像时，有时难以确定准确的阈值，即免疫标记或染色细胞被判定为阳性标记/染色的最低信号强度。因此，为尽量减少主观偏差，阈值的设定依赖于与对照组的比较（在所有处理过程中，均平行设置荧光成像的阴性对照，即省略一抗或二抗）。另一个局限性出现在利用延时数字成像分析细胞迁移时。在某些情况下，成像软件无法区分细胞的随机布朗运动与实际发生的极短距离迁移。当多个细胞彼此非常接近时，分析软件难以识别其为多个独立细胞，这一问题也较为明显。为克服此局限性，在分析过程中需采用手动选择细胞的方式，而非完全自动化的分析。细胞接种密度也可能导致数据分析偏差，例如倾向于成簇生长的细胞群体与倾向于孤立生长的细胞群体之间的迁移数据差异。这类差异部分可能反映了细胞对细胞-基质相互作用与细胞-细胞相互作用的不同偏好性。

使用高内涵筛选（HCS）系统获取图像并进行数据分析，可高效快速地评估多种细胞参数。此外，在环境培养箱中，常规采集了30种不同条件（6种基质和5种不同的间充质干细胞亚型）下的延时数字视频，时间跨度从数小时至数天（最长48小时）。随后利用这些数据计算并确定不同细胞系在各种细胞外基质分子上的细胞迁移速率差异。

在本报告中，我们重点介绍了一种高内涵筛选平台的实施，用于评估细胞健康与功能。此类分析有助于合理设计细胞类型以及聚合物基底，以促进定向细胞生长和神经再生。这是在采用细胞移植策略进行广泛的体内临床前研究之前，实现基于干细胞的治疗因子递送的关键步骤。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96 孔板	Greiner Bio One	655090	用于 ImageXpress 的 96 孔板
牛血清白蛋白 (BSA)	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	A9647
兔抗 Ki67 抗体	Abcam (Cambridge, MA)	Ab16667	1:200 稀释
I 型胶原蛋白	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	C7661	来自大鼠尾部的胶原蛋白
DAPI	Invitrogen (Carlsbad, CA)	D3571
驴抗兔 Cy3	Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)	711-165-152	1:500 稀释
ECL（层粘连蛋白-胶原蛋白-巢蛋白）	Millipore/Chemicon (Temecula, CA)	08-110
胎牛血清 (FBS)	Hyclone (Logan, UT)	SH30071.03
马血清	Hyclone (Logan, UT)	SH3007403
乙醇	Chemistry Store (Ames, IA)	12003510	100%，200 证明
纤连蛋白	Fisher Scientific (Hampton, NH)	CB-40008
Iscove’s 改良杜尔贝科培养基 (IMDM)	Hyclone (Logan, UT)	SH30396.03
KH2PO4	Fisher Scientific (Hampton, NH)	P285	用于 PO4 缓冲液
K2HPO4	Fisher Scientific (Hampton, NH)	P288	用于 PO4 缓冲液
L-谷氨酰胺	Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY)	25030-081
小鼠层粘连蛋白（小鼠来源）	Trevigen (Gaithersburg, MD)	3400-010-01
成年 C57BL/6 小鼠的骨髓间充质干细胞 (MSCs)	Tulane 基因治疗中心 (New Orleans, LA)		从骨髓中分离获得
基因修饰的间充质干细胞 (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF)	这些细胞来自我们之前的研究：Ye 等（待发表）
正常驴血清 (NDS)	Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)	017-000-121
多聚甲醛 (PFA)	Fisher Scientific (Hampton, NH)	O4042	0.1 M PO4 缓冲液中的 4% PFA
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	P0781
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	P4417
聚-L-赖氨酸	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	P4707
碘化丙啶 (PI)	Invitrogen (Carlsbad, CA)	P1304MP
吐温 X-100	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	X100
0.05% 胰蛋白酶 (EDTA 1x)	Invitrogen (Carlsbad, CA)	25300-054
Iscove 改良杜尔贝科培养基	Invitrogen (Carlsbad, CA)	12440–046
杂交瘤专用 FBS	Hyclone (Logan, UT)	SH30396.03
马血清	Hyclone (Logan, UT)	SH3007403
ImageXpress Micro	Molecular Devices (Sunnyvale, CA)	ImageXpress micro	高内涵筛选系统
MetaXpress 4.0	Molecular Devices (Sunnyvale, CA)	MetaXpress 4.0	图像采集与分析软件