方法文章

小鼠胚胎耳蜗外植体培养及电穿孔介导的基因转导

DOI：

10.3791/52260

⸱

2015年1月12日

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1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, College of Medicine, 2Laboratory of Cochlear Development, NIDCD, NIH

本文内容

摘要

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我们介绍一种从胚胎小鼠内耳分离和培养耳蜗外植体的方法。同时，我们还演示了通过方波电穿孔法将基因转入耳蜗外植体的技术。体外外植体培养结合基因转移技术，使研究人员能够研究在发育过程中改变基因表达所产生的影响。

摘要

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位于小鼠耳蜗柯蒂氏器内的听觉毛细胞负责检测声音信息并将其传递至中枢神经系统。这些机械感受性毛细胞排列成一排内毛细胞和三排外毛细胞，沿耳蜗从基底端到顶端的轴向延伸分布。本文所述的器官培养技术提供了一种高效的方法，用于分离并维持胚胎小鼠内耳的耳蜗组织外植体。此外，耳蜗外植体培养中的感觉毛细胞及非感觉支持细胞在形态学和分子特征上均与体内（in vivo）观察到的情况相似，可在其固有的细胞环境中进行研究。耳蜗外植体可作为重要的实验工具，用于鉴定和表征参与细胞特化与模式形成的分子及遗传通路。尽管转基因小鼠模型为基因表达研究提供了有效手段，但大量小鼠突变体在胚胎发育阶段即死亡，从而阻碍了对发育表型的分析与解读。对于在出生前即死亡的突变小鼠，其柯蒂氏器可通过体外培养，以分析其在体外（in vitro）的发育过程以及对不同因子的反应。此外，我们还描述了一种在离体（ex vivo）条件下对胚胎期耳蜗外植体进行电穿孔的技术，该技术可用于下调或过表达特定基因，分析其潜在的内源性功能，并检验特定基因产物在特定背景下是否对哺乳动物耳蜗发育具有必要性或充分性1-8。

引言

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哺乳动物的柯蒂氏器由多种特化的细胞类型组成，包括两种机械感觉毛细胞以及至少四种非感觉支持细胞，这使其成为研究细胞增殖、命运决定、分化和模式形成等正常细胞过程的理想模型系统。此外，这些不同类型细胞的正常发育对于正常的听觉功能至关重要。因此，理解调控其发育过程的分子和细胞因素十分关键。然而，小鼠耳蜗体积微小且位置深在，为基因表达研究带来了特殊挑战。更重要的是，大多数细胞命运决定和模式形成事件发生在胚胎发育时期，并在出生前基本完成。因此，识别并表征胚胎发育阶段的信号调控事件，对于揭示耳蜗形态发生的分子基础至关重要。

此处，我们演示一种培养完整耳蜗的方法 体外 从小鼠胚胎内耳中分离。采用该技术的原理在于，培养的耳蜗能够保持其分子和形态学特征，从而为研究耳蜗形态发生过程中潜在的候选基因及相关机制提供了一个有价值的模型。尽管转基因小鼠可用于基因表达研究，但一种 体外 系统常被用于监测特定基因功能。此外，可利用转基因小鼠胚胎建立耳蜗培养，从而对其 体外 可研究其发育过程及对各种可溶性因子和拮抗剂的反应。尽管本方案使用第13天（E13）的胚胎，但E12或E14至出生早期的内耳培养亦可获得类似结果。

我们还介绍了一种利用方波电穿孔技术在体外培养的胚胎耳蜗组织块中进行基因转导的方法。在分离获得耳蜗组织块后，可通过电穿孔将目的基因的DNA质粒导入耳蜗管内单个细胞中。该技术可作为转基因小鼠....

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方案

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注意：所有使用活体动物的实验方案必须经过机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查和批准，并须遵循官方批准的实验动物护理与使用方法。所有解剖操作均应在洁净的层流工作台中采用无菌技术进行。操作过程中应佩戴手套，必要时可佩戴口罩。

1. 胚胎小鼠内耳的解剖

  1. 耳蜗柯蒂氏器外植体培养的准备工作：
    1. 使用前打开超净台的紫外灯照射约30分钟以进行灭菌，并用70%乙醇对台面进行消毒。此外，所有解剖器械（包括精细解剖工具和用于胚胎解剖的Sylgard包被培养皿）均需通过高压灭菌或在70%乙醇中浸泡至少20分钟进行灭菌。倒掉70%乙醇后，将培养皿和器械置于洁净的超净工作台中自然晾干后再使用。
    2. 通过向10倍浓度的Hank’s平衡盐溶液（HBSS）中加入10%的10x HBSS和0.5% HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸），调节pH至约7.2，过滤除菌后将最终溶液保存于4 °C。所有解剖操作均需在预冷的HBSS/HEPES溶液中进行，以在整个过程中更好地保持组织活性。
    3. 在无菌的15 ml聚丙烯管中，向300 µl基底膜基质中加入5 ml冷（4 °C）无菌的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），通过涡旋混合均匀。取150 µl基底膜基质-DMEM混合液滴加至每个玻璃底培养皿的中央，使其覆盖培养皿中央的整个培养区域。盖好培养皿后，置于37 °C培养箱中孵育至少45分钟后再使用。
      4. ....

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结果

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我们描述了一种从胚胎内耳中分离耳蜗并显微解剖以暴露感觉上皮的方法。解剖后，可以将其作为完整的耳蜗管进行接种和培养（图 3），并通过免疫组织化学进行分析。培养的耳蜗外植体提供了一种有用的测定方法，用于检查各种可溶性因子和药物对耳蜗发育的影响。解剖耳蜗外植体后，电穿孔技术可用于错误表达目标基因并检查它们对耳蜗形态发生的影响。此处介绍的结果表明，碱性螺旋-环-螺旋 （bHLH） 转录因子 Atoh1 强表达到从 E13 内耳建立的培养耳蜗外植体中导致异位毛细胞形成。相比之下，另一种 bHLH 转录因子 NeuroD1 在 GER 内的前感觉细胞和非感觉上皮细胞中的强制表达导致异位神经元的形成。

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图 1：胚胎耳蜗的解剖。 如第 1 部分所述，从 E13 小鼠头部分离发育中的耳蜗所涉及的解剖步骤。（A） 中的虚线表示背中线，内耳的边界由

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讨论

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小鼠内耳膜迷路中的所有细胞，包括感觉细胞、非感觉细胞以及螺旋神经节神经元，均起源于外胚层中脑干附近的一个由原基衍生的耳囊，该结构约在胚胎第8天（E8）形成10-14。到E11时，耳囊的腹侧区域延伸形成耳蜗管；随着发育的进行，耳蜗及其他耳囊区域内的部分上皮细胞被确定为前感觉细胞区，这些区域将随后分化为不同类型的机械感觉毛细胞和非感觉支持细胞。在发育中的耳蜗中，约在E15.5时可辨认出一排内毛细胞和三排外毛细胞；到E17时，细胞排列基本完成，形成单排内毛细胞、柱细胞以及三排外毛细胞的结构。从E11耳蜗管开始生长至E17这一时间段内，发育中的上皮组织中发生了一系列细胞命运决定和模式形成过程，最终形成具有正常数量毛细胞和支持细胞的显著有序细胞排列。毛细胞和/或支持细胞的丧失是导致听力障碍的主要原因。由于这些细胞类型仅在胚胎发育的一个相对短暂的时间窗口内生成，因此理解决定每种细胞类型的分子与遗传通路至关重要，这将为再生治疗策略提供重要见解。

耳蜗培养与电穿孔技术已用于调控小鼠发育过程中的基因表达。在本视频中，我们展示了制备原代外植体的培养技术，以及将基因导入培养的小鼠胚.......

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披露

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未声明任何利益冲突。

致谢

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我们感谢 Bradley Schulte 博士对本实验方案提出的建议。本工作由美国国立卫生研究院资助项目 R00（5R00DC010220）资助。本项目在由资助项目 C06RR014516 支持翻修的实验室空间中完成。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
HBSSGibco14065-056
HEPESGibco15630-080
Dulbecco’s Modified MediumGibco12430-054
胎牛血清Gibco10082
N-2 补充剂 (100x)Gibco17502-048
盐酸环丙沙星Cellgro61-277-RF
玻璃培养皿 60 mmKimble Chase23062-6015/23064-6015
玻璃培养皿 100 mmKimble Chase23064-10015/23062-10015
显微固定针Fine Science Tools26002-15
Dumont #5 镊子Fine Science Tools11251-10
脉冲发生器Protech International IncCUY21Vivo-SQ
玻璃底培养皿MatTekP35G-0-10-C
Matrigel 基质BD Biosciences356237
培养皿，60 × 15 mmBecton Dickinson353037
组织培养皿Greiner Bio-one639160
磷酸盐缓冲液Gibco10010-023
OS-30Dow Corning4021768
Fluoromount 封片剂Southern Biotech0100-01
锥形管，15 mlGreiner Bio-one188261
肌球蛋白 6Proteus Biosciences Inc25-6791
肌球蛋白 7aProteus Biosciences Inc25-6790
TuJ1SigmaT2200

参考文献

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  1. Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. Organotypic development of the organ of Corti in culture. J Neurocytol. 4 (5), 543-572 (1975).
  2. Zheng, J. L., Gao, W. Q. Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears.

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