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方法文章

小鼠胚胎耳蜗外植体培养及电穿孔介导的基因转导

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DOI：

10.3791/52260

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2015年1月12日

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, College of Medicine, 2Laboratory of Cochlear Development, NIDCD, NIH

本文内容

摘要

我们介绍一种从胚胎小鼠内耳分离和培养耳蜗外植体的方法。同时，我们还演示了通过方波电穿孔法将基因转入耳蜗外植体的技术。体外外植体培养结合基因转移技术，使研究人员能够研究在发育过程中改变基因表达所产生的影响。

摘要

位于小鼠耳蜗柯蒂氏器内的听觉毛细胞负责检测声音信息并将其传递至中枢神经系统。这些机械感受性毛细胞排列成一排内毛细胞和三排外毛细胞，沿耳蜗从基底端到顶端的轴向延伸分布。本文所述的器官培养技术提供了一种高效的方法，用于分离并维持胚胎小鼠内耳的耳蜗组织外植体。此外，耳蜗外植体培养中的感觉毛细胞及非感觉支持细胞在形态学和分子特征上均与体内（in vivo）观察到的情况相似，可在其固有的细胞环境中进行研究。耳蜗外植体可作为重要的实验工具，用于鉴定和表征参与细胞特化与模式形成的分子及遗传通路。尽管转基因小鼠模型为基因表达研究提供了有效手段，但大量小鼠突变体在胚胎发育阶段即死亡，从而阻碍了对发育表型的分析与解读。对于在出生前即死亡的突变小鼠，其柯蒂氏器可通过体外培养，以分析其在体外（in vitro）的发育过程以及对不同因子的反应。此外，我们还描述了一种在离体（ex vivo）条件下对胚胎期耳蜗外植体进行电穿孔的技术，该技术可用于下调或过表达特定基因，分析其潜在的内源性功能，并检验特定基因产物在特定背景下是否对哺乳动物耳蜗发育具有必要性或充分性1-8。

引言

哺乳动物的柯蒂氏器由多种特化的细胞类型组成，包括两种机械感觉毛细胞以及至少四种非感觉支持细胞，这使其成为研究细胞增殖、命运决定、分化和模式形成等正常细胞过程的理想模型系统。此外，这些不同类型细胞的正常发育对于正常的听觉功能至关重要。因此，理解调控其发育过程的分子和细胞因素十分关键。然而，小鼠耳蜗体积微小且位置深在，为基因表达研究带来了特殊挑战。更重要的是，大多数细胞命运决定和模式形成事件发生在胚胎发育时期，并在出生前基本完成。因此，识别并表征胚胎发育阶段的信号调控事件，对于揭示耳蜗形态发生的分子基础至关重要。

此处，我们演示一种培养完整耳蜗的方法 体外 从小鼠胚胎内耳中分离。采用该技术的原理在于，培养的耳蜗能够保持其分子和形态学特征，从而为研究耳蜗形态发生过程中潜在的候选基因及相关机制提供了一个有价值的模型。尽管转基因小鼠可用于基因表达研究，但一种 体外 系统常被用于监测特定基因功能。此外，可利用转基因小鼠胚胎建立耳蜗培养，从而对其 体外 可研究其发育过程及对各种可溶性因子和拮抗剂的反应。尽管本方案使用第13天（E13）的胚胎，但E12或E14至出生早期的内耳培养亦可获得类似结果。

我们还介绍了一种利用方波电穿孔技术在体外培养的胚胎耳蜗组织块中进行基因转导的方法。在分离获得耳蜗组织块后，可通过电穿孔将目的基因的DNA质粒导入耳蜗管内单个细胞中。该技术可作为转基因小鼠研究的补充手段，用于解析细胞表型背后的分子通路机制。利用此基因转导方法，可在胚胎耳蜗内的多种上皮细胞类型中实现转染，从而在单细胞水平上开展基因功能缺失与功能获得分析。此外，还可对耳蜗组织块培养物进行电生理学研究。8. 这种方法的 体外 电穿孔技术相对简单直接，且对组织损伤极小，因此该技术得到了迅速推广。

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方案

注意：所有使用活体动物的实验方案必须经过机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查和批准，并须遵循官方批准的实验动物护理与使用方法。所有解剖操作均应在洁净的层流工作台中采用无菌技术进行。操作过程中应佩戴手套，必要时可佩戴口罩。

1. 胚胎小鼠内耳的解剖

  1. 耳蜗柯蒂氏器外植体培养的准备工作：
    1. 使用前打开超净台的紫外灯照射约30分钟以进行灭菌，并用70%乙醇对台面进行消毒。此外，所有解剖器械（包括精细解剖工具和用于胚胎解剖的Sylgard包被培养皿）均需通过高压灭菌或在70%乙醇中浸泡至少20分钟进行灭菌。倒掉70%乙醇后，将培养皿和器械置于洁净的超净工作台中自然晾干后再使用。
    2. 通过向10倍浓度的Hank’s平衡盐溶液（HBSS）中加入10%的10x HBSS和0.5% HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸），调节pH至约7.2，过滤除菌后将最终溶液保存于4 °C。所有解剖操作均需在预冷的HBSS/HEPES溶液中进行，以在整个过程中更好地保持组织活性。
    3. 在无菌的15 ml聚丙烯管中，向300 µl基底膜基质中加入5 ml冷（4 °C）无菌的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），通过涡旋混合均匀。取150 µl基底膜基质-DMEM混合液滴加至每个玻璃底培养皿的中央，使其覆盖培养皿中央的整个培养区域。盖好培养皿后，置于37 °C培养箱中孵育至少45分钟后再使用。
    4. 向三个无菌聚苯乙烯培养皿中各倒入4–5 ml预冷的HBSS，并在超净台内保持封闭状态备用。
    5. 在无菌的15 ml聚丙烯管中配制培养基：加入9 ml DMEM、100 µl N2添加剂、10 µg/ml环丙沙星（Cipro）和1 ml胎牛血清（FBS）。
  2. 胚胎的分离：
    注意：本实验用于培养小鼠胚胎耳蜗外植体，应从胚胎第13天（E13）的颞骨中获取内耳，其中受精后的第一天定义为E19。该方案也可适用于E12至E18阶段的小鼠胚胎内耳。
    1. 使用CO2处死妊娠时间明确的小鼠，并通过颈椎脱位或其他经批准的方法实施安乐死。为保持组织培养室的无菌环境，安乐死操作应在超净台外进行。
    2. 将已处死的小鼠仰卧置于纸巾上，并用70%乙醇对腹部进行消毒。
    3. 一手用弯头镊夹住皮肤，另一手用剪刀沿腹中线剪开表皮和肌肉，打开腹腔。在两侧做两个垂直切口，用镊子轻轻提起双侧子宫角，小心将子宫整体取出，并用剪刀分离其下方的结缔组织。
    4. 将胚胎串置于含有预冷解剖液（HBSS/HEPES混合液）的培养皿中，并转移至超净工作台内。
    5. 小心地将胚胎从胎盘中分离，并放入盛有解剖液的无菌培养皿中。若液体变浑浊或带血，应立即将胚胎转移至新的培养皿中。
      注意：此时可使用Theiler分期指南对胚胎进行分期。
    6. 用洁净的镊子或剪刀夹断胚胎颈部以去头，并将头部转移至盛有预冷解剖液的新培养皿中。
  3. 内耳的解剖：
    1. 将一个胚胎头部置于含有冷解剖液的无菌Sylgard培养皿中。
    2. 在解剖显微镜下（放大倍数约1.6倍），用微型图钉围绕或靠近眼部区域固定胚胎头部（图1A）。
    3. 使用两把无菌镊子小心去除皮肤，并沿背侧中线打开颅骨（图1B）。移除脑组织后，即可观察到位于颞骨内的内耳结构（图1C, D）。此时可利用通常围绕内耳分布的血管壁作为识别内耳的解剖标志（图1D）。
    4. 将镊子置于组织下方，从颞骨中分离内耳，将其从颅底完整取出，并转移至另一个含有冷解剖液的新培养皿中（图1E, F）。

2. 耳蜗柯蒂氏器外植体培养的制备

注意：在此发育阶段，组织为软骨性质，可使用镊子轻松解剖。

  1. 将内耳定向，使腹侧朝上（图2A）并通过将微型图钉的尖端轻轻插入内耳的前庭部分来固定内耳（图2B).
  2. 使用超细镊子，从靠近卵圆窗处开始，用镊子一端切开覆盖的软骨，并小心地将软骨从耳蜗上分离移除（图2C).
    注意：使用镊子时需注意不要插入软骨过深，因为覆盖的软骨有时会与下方的耳蜗管融合；此时可闭合镊子，在软骨表面下方轻轻刮擦，以分离软骨与下方的耳蜗管。在此发育阶段，耳蜗螺旋的长度仅为四分之三圈。
  3. 接下来，用镊子夹住耳蜗管 preferred 区域（基底部或顶端）并轻轻拉出耳蜗顶部，以暴露感觉上皮图 2D).
    注意：必须完全去除耳蜗的顶壁，因为它可能遮蔽感觉上皮，影响分析。
    注意：此操作必须轻柔进行，因为感觉上皮很容易撕裂。
  4. 最后一步，小心地从暴露的感觉上皮上去除下方的结缔组织，使耳蜗外植体的基部均匀平整。
  5. 使用镊子将耳蜗从内耳的前庭部分分离。此步骤可在第 2.4 步之前或之后进行。图2E).
  6. 将解剖得到的耳蜗感觉上皮组织用1.5 mm无菌铲转移至基底膜基质包被的培养孔中图 2F).
  7. 将耳蜗外植体的上皮腔面朝上放置，吸除基底膜基质-DMEM溶液，轻柔地加入150 µl新鲜培养基以小心展平组织。应注意确保每个外植体良好贴附于包被的玻璃盖玻片表面，不漂浮在培养基中。固定外植体时，应使镊子尖端朝上，避免损伤耳蜗外植体。
  8. 将培养皿轻柔地转移至一个无菌的150 mm培养皿中，并置于37 °C、5% CO₂的细胞培养孵箱中2 根据需要的时间，通常为3至6天 体外 （体外培养天数）。培养1天后，在解剖显微镜下观察培养物，以确保耳蜗外植体已良好贴附于培养皿上。
  9. 孵育后 体外 根据所需时间培养后，将细胞或组织进行免疫组织化学处理。
    注意：外植体培养通常孵育6天体外培养期（DIV），相当于发育阶段P0。孵育后 体外，培养物可进行后续下游应用，如免疫组织化学（图3B），RT-PCR， 原位 杂交和/或蛋白质印迹。

3. 电穿孔介导的基因转移

  1. 电穿孔实验的准备工作：
    1. 通过高压灭菌或在70%乙醇中浸泡约20分钟，对一个100 mm的Sylgard包被玻璃培养皿进行灭菌处理，使用前在洁净台中自然晾干。
    2. 使用适当的质粒大提或中提试剂盒，从选定的表达载体中提取DNA。本实验方案所用的表达载体为pIRES2-Atoh1.EGFP和pCLIG-NeuroD1.EGFP。DNA最终浓度应至少达到1 µg/µl，溶解于无菌、无DNA酶和RNA酶的水中。
  2. 将DNA电穿孔转入胚胎耳蜗组织外植体：
    1. 将10 µl质粒DNA溶液加入一个新的100 mm Sylgard包被培养皿中，并将一个完整解剖得到的耳蜗外植体（来自步骤2.5）转移至DNA溶液中。
    2. 使上皮的腔面朝上，轻微倾斜耳蜗，使其与培养皿平面垂直。
    3. 将电极板置于耳蜗两侧，负极（阴极）靠近感觉上皮，正极（阳极）位于耳蜗基部附近。
      注意：由于DNA带负电荷，其会从负极向正极迁移；因此，将电极的阴极端置于感觉上皮附近，可使DNA主要穿过感觉上皮表面。
    4. 使用电穿孔仪，通过脚踏开关施加9至10次24 mV、持续30毫秒的电脉冲，随后向电穿孔处理后的耳蜗中加入100 µl预热的培养基。
    5. 对所有耳蜗外植体以及所有目标基因的DNA重复步骤3.2.1–4，并将电穿孔处理后的耳蜗转移至基底膜基质包被的培养皿中进行接种（步骤2.7）。将所有电穿孔处理的耳蜗置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中，培养所需时间后进行免疫细胞化学分析。
      注意：一窝CD1小鼠（约8–12只幼鼠）的全部耳蜗可在<4小时内完成分离、显微解剖、电穿孔和接种。

4. 耳蜗外植体培养的分析

注意：培养物通常孵育6天体外培养期（DIV），相当于发育阶段P0。孵育后 体外，细胞培养物经固定后进行免疫细胞化学处理。

  1. 在完成所需时间的孵育后，移除培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）快速冲洗耳蜗外植体，随后在4%多聚甲醛（溶于PBS中）中室温孵育15分钟。
  2. 加入PBS洗涤固定剂，并用PBS冲洗三次，每次15分钟。
  3. 使用PBS-T（PBS + 0.5% Tween）透化处理30分钟，然后用含10%山羊血清的PBS-T进行封闭。
  4. 在含1%山羊血清的PBS-T中加入一抗溶液，4 °C条件下孵育过夜。
  5. 加入适当的Alexa荧光标记二抗前，在室温下用PBS-T洗涤耳蜗三次，每次15分钟。
  6. 由于耳蜗外植体培养在玻璃盖玻片上，可通过将盖玻片从培养皿中分离并转移到载玻片上，实现对单个样本的操作。具体操作为：将培养皿浸泡于OS30溶剂中，室温至少1小时；使用无菌刀片将盖玻片从培养皿上剥离，转移至载玻片上，随后在荧光显微镜下观察。

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结果

我们描述了一种从胚胎内耳中分离耳蜗并进行显微解剖以暴露感觉上皮的方法。解剖后，可将组织接种并作为完整的耳蜗管进行体外培养（图3），并用于免疫组织化学分析。培养的耳蜗外植体为研究多种可溶性因子和药理学药物对耳蜗发育的影响提供了一种有效的实验体系。在耳蜗外植体解剖完成后，可采用电穿孔技术实现目的基因的异位表达，进而研究其对耳蜗形态发生的影响。本文结果表明，在源自E13期内耳的培养耳蜗外植体中强制表达碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子Atoh1，可导致异位毛细胞的形成。相反，在内侧胶质缘（GER）中的前感觉细胞和非感觉上皮细胞中强制表达另一种bHLH转录因子NeuroD1，则可诱导异位神经元的形成。

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讨论

小鼠内耳膜迷路中的所有细胞，包括感觉细胞、非感觉细胞以及螺旋神经节神经元，均起源于外胚层中脑干附近的一个由原基衍生的耳囊，该结构约在胚胎第8天（E8）形成10-14。到E11时，耳囊的腹侧区域延伸形成耳蜗管；随着发育的进行，耳蜗及其他耳囊区域内的部分上皮细胞被确定为前感觉细胞区，这些区域将随后分化为不同类型的机械感觉毛细胞和非感觉支持细胞。在发育中的耳蜗中，约在E15.5时可辨认出一排内毛细胞和三排外毛细胞；到E17时，细胞排列基本完成，形成单排内毛细胞、柱细胞以及三排外毛细胞的结构。从E11耳蜗管开始生长至E17这一时间段内，发育中的上皮组织中发生了一系列细胞命运决定和模式形成过程，最终形成具有正常数量毛细胞和支持细胞的显著有序细胞排列。毛细胞和/或支持细胞的丧失是导致听力障碍的主要原因。由于这些细胞类型仅在胚胎发育的一个相对短暂的时间窗口内生成，因此理解决定每种细胞类型的分子与遗传通路至关重要，这将为再生治疗策略提供重要见解。

耳蜗培养与电穿孔技术已用于调控小鼠发育过程中的基因表达。在本视频中，我们展示了制备原代外植体的培养技术，以及将基因导入培养的小鼠胚...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

我们感谢 Bradley Schulte 博士对本实验方案提出的建议。本工作由美国国立卫生研究院资助项目 R00（5R00DC010220）资助。本项目在由资助项目 C06RR014516 支持翻修的实验室空间中完成。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
HBSSGibco14065-056
HEPESGibco15630-080
Dulbecco’s Modified MediumGibco12430-054
胎牛血清Gibco10082
N-2 补充剂 (100x)Gibco17502-048
盐酸环丙沙星Cellgro61-277-RF
玻璃培养皿 60 mmKimble Chase23062-6015/23064-6015
玻璃培养皿 100 mmKimble Chase23064-10015/23062-10015
显微固定针Fine Science Tools26002-15
Dumont #5 镊子Fine Science Tools11251-10
脉冲发生器Protech International IncCUY21Vivo-SQ
玻璃底培养皿MatTekP35G-0-10-C
Matrigel 基质BD Biosciences356237
培养皿，60 × 15 mmBecton Dickinson353037
组织培养皿Greiner Bio-one639160
磷酸盐缓冲液Gibco10010-023
OS-30Dow Corning4021768
Fluoromount 封片剂Southern Biotech0100-01
锥形管，15 mlGreiner Bio-one188261
肌球蛋白 6Proteus Biosciences Inc25-6791
肌球蛋白 7aProteus Biosciences Inc25-6790
TuJ1SigmaT2200

参考文献

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