体外 小鼠中类别转换重组的分析因B细胞表面Fc受体结合的亲细胞IgE分子而具有挑战性。本文描述了一种IgE检测方法：在固定和透化以进行胞质荧光染色之前，先通过胰蛋白酶介导裂解细胞表面结合的IgE。
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摘要
摘要
B淋巴细胞免疫球蛋白重链（IgH）类别转换重组（CSR）是指最初表达的IgM转换为其他IgH同种型（如IgA、IgE和IgG）的过程。体外检测IgH类别转换重组是研究多种生物学过程的关键方法，涵盖从DNA重组与修复到分子及细胞免疫学的多个方面。体外CSR检测通常涉及通过流式细胞术测定活化B细胞表面的免疫球蛋白表达。虽然IgA和IgG亚类的检测较为直接，但通过该方法检测IgE存在困难，原因是可溶性IgE会结合于活化B细胞表面表达的FcεRII/CD23。本文介绍一种独特的方法，可准确检测在培养中发生类别转换重组后产生IgE的小鼠B细胞。该方法基于胰蛋白酶介导的细胞表面IgE-CD23复合物的裂解，从而通过胞质染色检测IgE产生的B系细胞。该方案为IgE类别转换重组的流式细胞术分析提供了便捷的解决方案。
引言
在小鼠和人类的免疫球蛋白重链（IgH）类别转换重组（CSR）过程中，IgH 的 μ 恒定区外显子（Cμ）被删除，并被下游多个恒定区外显子（CHs）中的一组所取代（例如 Cγ、Cε 和 Cα），从而导致抗体从产生 IgM 转变为产生其他 Ig 类别（例如 IgG、IgE 或 IgA）。CSR 发生在转换（S）区，这些区域是位于每组 CHs 上游 5’端的 1–10 kb 序列1。活化诱导的胞苷脱氨酶（Activation-Induced Cytidine Deaminase, AID）通过胞苷脱氨活性启动 CSR。
IgE 是过敏性疾病的关键介质2，更深入地了解 IgE 的产生与调控机制，可能为特应性疾病的治疗开辟新的途径。在小鼠和人类中，IgE 是受到最严格调控的免疫球蛋白同种型。正常情况下，IgE 的检测水平比其他 IgH 同种型低数千倍3，但在疾病状态下可显著升高4。然而，向 IgE 的类别转换重组（CSR）过程尚未完全阐明。体外使用 IL-4 联合抗 CD40 抗体或 LPS 激活 B 细胞，可诱导其向 IgG1 和 IgE 发生类别转换5。活化的 B 细胞表达低亲和力 IgE 受体 FcεRII/CD232,6，该受体可结合类别转换后在培养中分泌的可溶性 IgE。因此，在流式细胞术分析时，受体结合了 IgE 的 B 细胞与内源性表达 IgE 的 B 细胞染色结果相似7。尽管已知小鼠 B 细胞表达低亲和力 IgG 受体 FcγRIIB1（CD32）8，但根据我们的经验，其似乎不会干扰向 IgG1 类别转换的检测。然而，在检测 B 细胞体外激活后向 IgE 的转换时，非特异性结合于细胞表面的 IgE 可能会干扰分析结果。采用常规染色方法时，不表达 IgE 的细胞也可能呈现 IgE 阳性染色。
本文概述了一种用于开展CSR检测并从小鼠中鉴定真正表达IgE的B细胞的策略9–11。使用胰蛋白酶（一种常见的用于蛋白质消化的实验室试剂）处理活化的B细胞，可去除细胞亲和性IgE及膜结合的表面IgE。随后进行通透化处理，并对胞浆内IgE进行染色，从而揭示真正产生IgE的细胞。
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方案
注意：此处描述的所有实验均遵循机构动物照护与使用委员会（IACUC）指南，并已获得马萨诸塞州波士顿儿童医院动物研究委员会（ARCH）的批准。
1. 试剂的准备
- 1,000倍IL-4储存液：将IL-4细胞因子用H稀释至20 µg/ml2O 或 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）。分装为每管 200 µl 至 1.5 ml 微量离心管中，于 -20 °C 保存。
- 1,000倍抗CD40抗体：从生产商处获取，浓度为1.0 mg/ml，4 °C保存。
- B细胞刺激培养基：向425 ml RPMI-1640培养基中加入75 ml 新鲜解冻的胎牛血清（FCS）、10 ml 1.0 M HEPES缓冲液、5 ml L-谷氨酰胺储备液、5 ml 青霉素-链霉素储备液、5 ml 最低必需培养基非必需氨基酸（MEM-NEAA）以及3.5 µl 2-巯基乙醇。培养基可在4 ˚C保存最多一周。使用前仅向所需体积的培养基中加入IL-4（20 ng/ml）和抗CD40抗体（1.0 µg/ml）。
- 2% FCS-FACS缓冲液：将10 ml FCS加入490 ml 1x PBS中。4 °C保存。
- 2×胰蛋白酶-EDTA溶液：将5 ml 10×胰蛋白酶-EDTA储备液（每升含5.0 g胰蛋白酶和2.0 g EDTA）用20 ml 1×PBS稀释。将胰蛋白酶-EDTA以2×工作浓度分装，于4 °C保存。使用前恢复至室温。
- 胎牛血清：解冻后的FCS可在4 ˚C保存最多两周。细胞质染色实验前15分钟将其置于冰上。
- 中性缓冲福尔马林：配制10%福尔马林溶液（含3.7%多聚甲醛）。福尔马林具有毒性，操作时须在通风橱内进行，并穿戴适当的个人防护装备。将福尔马林于室温下储存于化学品储存柜中。
- 甲醇：将纯甲醇（100%）储存于 -20 °C，待细胞准备进行通透处理时使用。注意甲醇易燃，应存放于适当的冰箱中。
2. B细胞的纯化与活化
- 从新鲜收获的小鼠脾脏中，通过使用3 ml注射器的推杆将组织轻轻压过70 µm细胞筛，制备单细胞悬液。在15 ml圆锥形离心管中用10 ml 1× PBS收集细胞，并在4 °C下以300 × g离心5分钟。
- 弃去上清液，将沉淀重悬于1 ml红细胞裂解缓冲液中，孵育5分钟。加入13.5 ml 1× PBS中和反应，然后在300 × g下离心5分钟。
- （可选）根据制造商说明，按照MACS纯化方案，使用抗CD45R(B220)标记的磁珠对B细胞进行磁分离。
- 将纯化的B细胞以1.0 × 106 个细胞/ml的密度接种于预温的B细胞刺激培养基中，培养基于37 °C孵育5天，其中添加IL-4（20 ng/ml）和抗CD40抗体（1.0 µg/ml）。起始培养体积为8 ml，分装至6孔培养板中的2个孔（每孔4 ml）。
- 每天观察培养情况，维持细胞密度为1.0 × 106 个细胞/ml。根据需要将细胞分至其他孔中，并用含有新鲜IL-4和抗CD40抗体的B细胞刺激培养基稀释，以调整细胞浓度。
3. 胰蛋白酶消化、固定与通透处理
- 胰蛋白酶消化
- 将最多 1.0 × 107 个培养细胞收集至 15 ml 圆锥形离心管中，在 300 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。
- 用 10 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，以去除细胞收集培养基中的残留蛋白。重复离心步骤后弃去上清液。
- 将细胞沉淀重悬于倾倒后残留的液体中（约 100 μl）。
- 小心加入 800 μl 室温 0.1%（2×）胰蛋白酶-EDTA 溶液至细胞中。沿离心管壁以 45° 角缓慢滴加。
- 盖紧管盖，通过倾斜试管使液体沿管壁缓慢流动 5–6 次，轻柔混匀。溶液中可能出现丝状白色沉淀。胰蛋白酶消化时间应控制在 1 分钟以内。
- 加入 1 ml 冷的胎牛血清（FCS）终止胰蛋白酶反应。立即加入 10 ml 冷 PBS 稀释 FCS。
- 在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，将离心管放回冰上。
- 固定
- 将细胞重悬于倾倒后残留的液体中。如有需要，可用冷 PBS 将体积补至 100 μl。
- 在通风橱内，向细胞中加入 800 μl 10% 中性缓冲甲醛溶液，并上下吹打混匀。加入甲醛后试管会升温。在 37 °C 下孵育 10 分钟。
- 透化
- 将台式涡旋混合器调至轻柔振荡速度。
- 用 10 ml 血清移液管吸取 9 ml 冷（-20 °C）甲醇。
- 将含有细胞的试管置于涡旋混合器上方，轻轻开始振荡细胞。
- 在试管持续振荡的同时，将冷甲醇逐滴加入试管，使甲醇直接滴落在细胞上，确保持续混合。加入前 2 ml 甲醇后，可将滴加速率提高至缓慢连续流速。
- 将试管置于冰上静置 30 分钟，以完成透化过程。或者，细胞可在 -20 °C 下保存长达一个月。
4. IgG1 和 IgE 类别转换的荧光染色
- 将样品在 300 x g 条件下离心 5 分钟，并弃去甲醇溶液。可能会有白色沉淀与细胞一同形成沉淀。
- 加入 10 ml 室温 1x PBS，以 300 x g 离心 5 分钟以洗涤细胞。重复一次。注意：用室温 PBS 洗涤沉淀可溶解在步骤 4.1 后可能形成的额外沉淀物。
- 用 10 ml 2% FCS-FACS 缓冲液再进行一次洗涤。
- 将样品分装至 96 孔圆底板中，在 300 x g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，并将板置于冰上。
- 每孔使用 60 µl 2% FCS-FACS 缓冲液，加入以下抗体稀释液进行染色：Anti-IgM RPE/Cy7（1:200）、Anti-IgG1 PE（1:600）、Anti-IgE FITC（1:100）、Anti-CD45R(B220) PerCP-Cy5.5（1:200）
- 染色 5 分钟后，用 150 µl 2% FCS-FACS 缓冲液洗涤平板，并在 300 x g 条件下离心 5 分钟。
- 重悬于 400 µl 2% FCS-FACS 缓冲液中，通过 40 µm 尼龙细胞滤网转移至 5 ml FACS 管中。
5. 使用以下设门策略：
- 从FSC/SSC图中位于爆裂淋巴细胞群的CD45R(B220)阳性细胞中分离出该细胞群（图1）。
- 从B220阳性细胞中，利用IgE和IgG1图谱识别相应的细胞亚群。
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结果
该方案已成功用于研究小鼠B细胞中向IgE的类别转换重组（CSR）。为证明CSR检测的效率，我们采用抗CD40抗体和IL-4刺激小鼠脾脏B细胞，具体方法如前所述11。刺激5天后，收集细胞并按照上述方案进行处理，随后用荧光标记的IgM、IgG1、IgE以及B220（CD45R）抗体进行染色。在活化淋巴细胞设门（图1）后，若不进行胰蛋白酶处理，则无法清晰区分出明显的IgE阳性细胞群（图2a）。然而，在固定和通透前对细胞进行胰蛋白酶处理，可有效分离出IgE产生细胞（图2b），其原理在于去除了细胞表面结合的IgE。
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讨论
在体外培养中，使用抗CD40抗体和IL-4刺激小鼠脾脏B细胞可模拟辅助性T细胞2型（TH2）的相互作用，促进抗体类别转换为IgG1和IgE5。B细胞可在总脾细胞悬液的背景下12，或在纯化的脾脏B细胞条件下11进行类别转换重组（CSR）激活。如本实验方案第2.3步所述，B细胞富集为可选步骤，是否进行应由实验人员根据实际需要自行决定。本实验采用CD45R(B220)标记的磁珠对B细胞进行阳性磁分离。分离后，建议通过流式细胞术（FACS）检测细胞纯度，以便将B细胞浓度调整至1.0 × 106 个细胞/ml，从而确保细胞因子和抗体刺激的适当条件。此外需注意，经历多次冻融循环的IL-4蛋白其活性可能下降。
在固定和通透之前对细胞进行胰蛋白酶消化，可实现通过流式细胞术准确测量类别转换（图2）。正确的细胞胰蛋白酶消化对该实验步骤的成功应用至关重要。由于胎牛血清（FCS）可抑制胰蛋白酶活性，因此在胰蛋白酶消化步骤前需用1×PBS洗涤细胞。我们发现室温下孵育...
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致谢
D.R.W. 获得美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 AI089972 和 AI113217、黏膜免疫学研究团队以及伯纳姆医学科学家职业奖基金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗小鼠 IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | 克隆号 R35-72 |
| 大鼠抗小鼠 IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | 克隆号 A85-1 |
| 甲醇 | BDH | BDH1135-4LP | 保存于 -20 °C |
| Falcon 细胞滤筛 40 µm 尼龙 | Corning | 352340 | |
| Falcon 细胞滤筛 70 µm 尼龙 | Corning | 352350 | |
| 抗人/小鼠 CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | 克隆号 RA3-6B2 |
| 抗小鼠/大鼠 CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | 克隆号 HM40-3 |
| RPMI 1640 培养基 | Gibco | 11875-093 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100 倍) | Gibco | 11140-050 | |
| 磷酸盐缓冲液 (10 倍) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) 磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| MACS 纯化柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | 用蒸馏水或 0.1% BSA 溶解 |
| 中性缓冲福尔马林溶液 (10%) | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| 胰蛋白酶-EDTA 溶液 (10 倍) | Sigma Aldrich | T4174-100 ml | 每升 0.9% NaCl 溶液含 5.0 g 胰蛋白酶、2.0 g EDTA•4 Na |
| 青霉素-链霉素 | Sigma Aldrich | P0781-100 ml | 10,000 U 青霉素；10 mg/ml 链霉素 (100 倍) |
| L-谷氨酰胺 200 mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| 2-巯基乙醇 (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100 ml | |
| 红细胞裂解缓冲液 | Sigma Aldrich | R7757 | |
| 大鼠抗小鼠 IgM RPE/Cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | 克隆号 1B4B1 |
| HyClone 胎牛血清 | Thermo | SH30910.03 | |
| B 细胞刺激培养基 | B 细胞刺激培养基由 RPMI 培养基添加胎牛血清 (15%)、20 mM HEPES、1 倍 MEM-NEAA、2.0 mM L-谷氨酰胺、 1 倍青霉素-链霉素 (青霉素：100 U/ml，链霉素：100 µg/ml)、β-巯基乙醇 (7 µL/L)、IL-4 (20 ng/ml) 和抗-CD40 (1 µg/ml) 组成 |
参考文献
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