检测真正表达IgE的小鼠B系细胞

摘要

体外 小鼠中类别转换重组的分析因B细胞表面Fc受体结合的亲细胞IgE分子而具有挑战性。本文描述了一种IgE检测方法：在固定和透化以进行胞质荧光染色之前，先通过胰蛋白酶介导裂解细胞表面结合的IgE。

摘要

B淋巴细胞免疫球蛋白重链（IgH）类别转换重组（CSR）是指最初表达的IgM转换为其他IgH同种型（如IgA、IgE和IgG）的过程。体外检测IgH类别转换重组是研究多种生物学过程的关键方法，涵盖从DNA重组与修复到分子及细胞免疫学的多个方面。体外CSR检测通常涉及通过流式细胞术测定活化B细胞表面的免疫球蛋白表达。虽然IgA和IgG亚类的检测较为直接，但通过该方法检测IgE存在困难，原因是可溶性IgE会结合于活化B细胞表面表达的FcεRII/CD23。本文介绍一种独特的方法，可准确检测在培养中发生类别转换重组后产生IgE的小鼠B细胞。该方法基于胰蛋白酶介导的细胞表面IgE-CD23复合物的裂解，从而通过胞质染色检测IgE产生的B系细胞。该方案为IgE类别转换重组的流式细胞术分析提供了便捷的解决方案。

引言

在小鼠和人类的免疫球蛋白重链（IgH）类别转换重组（CSR）过程中，IgH 的 μ 恒定区外显子（Cμ）被删除，并被下游多个恒定区外显子（C_Hs）中的一组所取代（例如 Cγ、Cε 和 Cα），从而导致抗体从产生 IgM 转变为产生其他 Ig 类别（例如 IgG、IgE 或 IgA）。CSR 发生在转换（S）区，这些区域是位于每组 C_Hs 上游 5’端的 1–10 kb 序列¹。活化诱导的胞苷脱氨酶（Activation-Induced Cytidine Deaminase, AID）通过胞苷脱氨活性启动 CSR。

IgE 是过敏性疾病的关键介质²，更深入地了解 IgE 的产生与调控机制，可能为特应性疾病的治疗开辟新的途径。在小鼠和人类中，IgE 是受到最严格调控的免疫球蛋白同种型。正常情况下，IgE 的检测水平比其他 IgH 同种型低数千倍³，但在疾病状态下可显著升高⁴。然而，向 IgE 的类别转换重组（CSR）过程尚未完全阐明。体外使用 IL-4 联合抗 CD40 抗体或 LPS 激活 B 细胞，可诱导其向 IgG1 和 IgE 发生类别转换⁵。活化的 B 细胞表达低亲和力 IgE 受体 FcεRII/CD23^2,6，该受体可结合....

方案

注意：此处描述的所有实验均遵循机构动物照护与使用委员会（IACUC）指南，并已获得马萨诸塞州波士顿儿童医院动物研究委员会（ARCH）的批准。

1. 试剂的准备

1. 1,000倍IL-4储存液：将IL-4细胞因子用H稀释至20 µg/ml₂O 或 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）。分装为每管 200 µl 至 1.5 ml 微量离心管中，于 -20 °C 保存。
2. 1,000倍抗CD40抗体：从生产商处获取，浓度为1.0 mg/ml，4 °C保存。
3. B细胞刺激培养基：向425 ml RPMI-1640培养基中加入75 ml 新鲜解冻的胎牛血清（FCS）、10 ml 1.0 M HEPES缓冲液、5 ml L-谷氨酰胺储备液、5 ml 青霉素-链霉素储备液、5 ml 最低必需培养基非必需氨基酸（MEM-NEAA）以及3.5 µl 2-巯基乙醇。培养基可在4 ˚C保存最多一周。使用前仅向所需体积的培养基中加入IL-4（20 ng/ml）和抗CD40抗体（1.0 µg/ml）。
4. 2% FCS-FACS缓冲液：将10 ml FCS加入490 ml 1x PBS中。4 °C保存。
5. 2×胰蛋白酶-EDTA溶液：将5 ml 10×胰蛋白酶-EDTA储备液（每升含5.0 g胰蛋白酶和2.0 g EDTA）用20 ml 1×PBS稀释。将胰蛋白酶-EDTA以2×工作浓度分装，于4 °C保存。使用前恢复至室温。
....

结果

该方案已成功用于研究小鼠B细胞中向IgE的类别转换重组（CSR）。为证明CSR检测的效率，我们采用抗CD40抗体和IL-4刺激小鼠脾脏B细胞，具体方法如前所述¹¹。刺激5天后，收集细胞并按照上述方案进行处理，随后用荧光标记的IgM、IgG1、IgE以及B220（CD45R）抗体进行染色。在活化淋巴细胞设门（图1）后，若不进行胰蛋白酶处理，则无法清晰区分出明显的IgE阳性细胞群（图2a）。然而，在固定和通透前对细胞进行胰蛋白酶处理，可有效分离出IgE产生细胞（图2b），其原理在于去除了细胞表面结合的IgE。

讨论

在体外培养中，使用抗CD40抗体和IL-4刺激小鼠脾脏B细胞可模拟辅助性T细胞2型（T_H2）的相互作用，促进抗体类别转换为IgG1和IgE⁵。B细胞可在总脾细胞悬液的背景下¹²，或在纯化的脾脏B细胞条件下¹¹进行类别转换重组（CSR）激活。如本实验方案第2.3步所述，B细胞富集为可选步骤，是否进行应由实验人员根据实际需要自行决定。本实验采用CD45R(B220)标记的磁珠对B细胞进行阳性磁分离。分离后，建议通过流式细胞术（FACS）检测细胞纯度，以便将B细胞浓度调整至1.0 × 10⁶ 个细胞/ml，从而确保细胞因子和抗体刺激的适当条件。此外需注意，经历多次冻融循环的IL-4蛋白其活性可能下降。

在固定和通透之前对细胞进行胰蛋白酶消化，可实现通过流式细胞术准确测量类别转换（图2）。正确的细胞胰蛋白酶消化对该实验步骤的成功应用至关重要。由于胎牛血清（FCS）可抑制胰蛋白酶活性，因此在胰蛋白酶消化步骤前需用1×PBS洗涤细胞。我们发现室温下孵育.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗小鼠 IgE FITC	BD Pharmingen	553415	克隆号 R35-72
大鼠抗小鼠 IgG1 PE	BD Pharmingen	550083	克隆号 A85-1
甲醇	BDH	BDH1135-4LP	保存于 -20 °C
Falcon 细胞滤筛 40 µm 尼龙	Corning	352340
Falcon 细胞滤筛 70 µm 尼龙	Corning	352350
抗人/小鼠 CD45R(B220) PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-4052-82	克隆号 RA3-6B2
抗小鼠/大鼠 CD40	eBioscience	16-0402-85	克隆号 HM40-3
RPMI 1640 培养基	Gibco	11875-093
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
MEM-NEAA (100 倍)	Gibco	11140-050
磷酸盐缓冲液 (10 倍)	Lifetechnologies (Corning)	46-013-CM
MACS CD45R (B220) 磁珠	Miltenyi Biotec	130-049-501
MACS 纯化柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
IL-4	PeproTech	214-14	用蒸馏水或 0.1% BSA 溶解
中性缓冲福尔马林溶液 (10%)	Sigma Aldrich	HT501128-4L
胰蛋白酶-EDTA 溶液 (10 倍)	Sigma Aldrich	T4174-100 ml	每升 0.9% NaCl 溶液含 5.0 g 胰蛋白酶、2.0 g EDTA•4 Na
青霉素-链霉素	Sigma Aldrich	P0781-100 ml	10,000 U 青霉素；10 mg/ml 链霉素 (100 倍)
L-谷氨酰胺 200 mM	Sigma Aldrich	G7513
2-巯基乙醇 (99%)	Sigma Aldrich	M6250-100 ml
红细胞裂解缓冲液	Sigma Aldrich	R7757
大鼠抗小鼠 IgM RPE/Cy7	SouthernBiotech	1140-17	克隆号 1B4B1
HyClone 胎牛血清	Thermo	SH30910.03
B 细胞刺激培养基			B 细胞刺激培养基由 RPMI 培养基添加胎牛血清 (15%)、20 mM HEPES、1 倍 MEM-NEAA、2.0 mM L-谷氨酰胺、 1 倍青霉素-链霉素 (青霉素：100 U/ml，链霉素：100 µg/ml)、β-巯基乙醇 (7 µL/L)、IL-4 (20 ng/ml) 和抗-CD40 (1 µg/ml) 组成