利用光转化后荧光衰减法（FDAP）测量活体斑马鱼胚胎中的蛋白质稳定性

摘要

细胞和组织中的蛋白质水平通常由蛋白质的生成与清除之间的平衡进行严格调控。利用光转化后荧光衰减（Fluorescence Decay After Photoconversion, FDAP）技术，可对蛋白质的清除动力学进行实验测定 体内.

摘要

蛋白质稳定性影响生物学的诸多方面，测量蛋白质的清除动力学可为生物系统提供重要的见解。在FDAP实验中，可以测量活体生物内蛋白质的清除情况。将目标蛋白与一种光可转换荧光蛋白标记，使其在体内表达并进行光转换，随后监测光转换信号随时间下降的过程。然后将数据拟合到适当的清除模型中，以确定蛋白质的半衰期。重要的是，通过应用区域掩膜，可分别检测生物体不同区室中蛋白质群体的清除动力学。该方法已被用于测定斑马鱼发育过程中分泌型信号蛋白的细胞内和细胞外半衰期。本文中，我们描述了在斑马鱼胚胎中进行FDAP实验的详细方案。理论上，FDAP可用于测定任何光学可及生物体内任意可标记蛋白质的清除动力学。

引言

细胞和生物体内蛋白质的水平由其生成和清除速率决定。蛋白质的半衰期可短至数分钟，长达数天^1-4。在许多生物系统中，关键蛋白质的稳定或清除对细胞活动具有重要影响。细胞周期的推进^5,6、发育信号传导^7-9、细胞凋亡¹⁰以及神经元的正常功能与维持^11,12均依赖于细胞内蛋白质稳定性的调控。细胞外蛋白质的稳定性则影响分泌蛋白（如形态发生素）在组织内的分布与可利用性^13,14。

在过去几十年中，蛋白质稳定性主要通过细胞培养中的放射性脉冲标记或放线菌酮追踪实验来评估¹⁵。在这类脉冲追踪实验中，细胞短暂暴露于含有放射性氨基酸前体的“脉冲”环境中，这些前体被整合到新合成的蛋白质中；或者暴露于放线菌酮中，后者可抑制蛋白质的合成。随后在不同时间点收集培养的细胞，并通过免疫沉淀结合自显影技术（用于放射性脉冲追踪实验）或蛋白质印迹法（用于放线菌酮实验）来定量检测蛋白质随时间的降解情况。

传统的蛋白质稳定性检测方法存在若干不足之处。首先，这些检测中的蛋白质通常并非在其内源环境中表达，而是在组织培养中表达，有时甚至在来自不同物种的细胞中表达。对于稳定性依赖于特定环境的蛋白质而言，这种方法存在问题。其次，无法在单个细胞或生物体中随时间推移追踪蛋白质的清除过程，这些检测所得的数据反映的是在不同时间点上不....

方案

1. 生成光转化融合构建体并注射去壳斑马鱼胚胎

1. 构建一个包含目标蛋白与绿色至红色光转换蛋白融合的功能性表达载体（参见 讨论），然后使用 体外 转录生成编码融合蛋白的加帽mRNA，方法同Müller 等 2012¹⁹.
2. 使用蛋白酶去除约30枚处于单细胞期的斑马鱼胚胎的卵膜。或者，使用镊子手动去除胚胎的卵膜²⁸.
   注意：胚胎必须在后续成像前去除绒毛膜。如需要，可先透过绒毛膜进行胚胎注射，随后在成像前去除绒毛膜。
   1. 配制5 mg/ml的pronase储备液 Streptomyces griseus 在标准斑马鱼胚胎培养基中¹⁹在室温下轻轻摇动溶液 10 分钟，使蛋白酶充分溶解。将 2 ml 分装至微量离心管中，于 -20 °C.
   2. 将单细胞期胚胎转移至含有约8 ml胚胎培养液的5 cm直径玻璃或琼脂糖包被的塑料培养皿中。向培养皿中加入2 ml解冻的蛋白酶原储备液，在室温下孵育5至10分钟。
   3. 避免让胚胎暴露于空气或与塑料接触，因为与其中任一接触都会导致去壳胚胎破裂。取一个200 ml玻璃烧杯，装入胚胎培养液。将培养皿倾斜并浸入培养液中，从而将胚胎转移至烧杯内。
   4. 待胚胎沉降至烧杯底部后，倒出大部分胚胎培养液，然后向烧杯中加入新鲜胚胎培养液。加入培养液时....

结果

FDAP 已被用于测定斑马鱼胚胎中细胞外信号蛋白的半衰期¹⁹。其中一种蛋白 Squint 可在胚胎发育过程中诱导中胚层-内胚层基因的表达³⁴。Squint-Dendra2 能够以与未标记的 Squint 相似水平诱导中胚层-内胚层基因的表达，这已通过 qRT-PCR 和 原位 杂交实验得到验证¹⁹。将 Alexa488-葡聚糖和编码 Squint-Dendra2 的 mRNA 共同注射到胚胎中，并进行 FDAP 检测。随着时间的推移，细胞外光转化信号强度的下降明显可见（图 4A）。使用 PyFDAP 对 23 个胚胎生成细胞外强度分布曲线。利用 PyFDAP 将所得数据按一级清除动力学模型进行拟合，得到平均清除速率常数 k 为 1.00 × 10^-4/秒，对应平均半衰期 τ 为 116 分钟。当成像时间间隔为 10 或 20 分钟时，获得的强度分布曲线和清除速率常数相似，表明光漂白或意外的光转化对信号强度变化的影响不显著（图 4B）。

讨论

FDAP 实验的成功依赖于功能性光转化融合蛋白的生成。对蛋白质进行标记可能会影响其生物学活性和/或生物物理特性，包括其定位、溶解度和稳定性^36-41。应准备测试多种不同融合构建体的活性，以筛选出具有功能的构建体。我们发现，改变光转化蛋白相对于目标蛋白的位置，或使用较长的连接序列（例如，采用氨基酸序列 LGDPPVAT¹⁹），可增强融合蛋白的活性。对于信号转导蛋白，可通过检测其诱导靶基因表达的能力来确定融合蛋白的活性¹⁹。qRT-PCR 或 原位 杂交可有效反映靶基因的表达水平¹⁹。需要注意的是，本文所述方案旨在测定斑马鱼早期胚胎中蛋白质的稳定性，若需在其他背景下评估蛋白质稳定性，则需对方案进行相应修改。

绿色到红色光转换蛋白 Dendra2²⁷ 已成功应用于斑马鱼 FDAP 实验¹⁹（图4），但也有其他可选蛋白^26,.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PyFDAP（从以下网站下载：http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab）			按照 PyFDAP 网站提供的说明进行安装和操作；PyFDAP 兼容 Linux、Mac 和 Windows 操作系统。
mMessage mMachine Sp6 转录试剂盒	Life Technologies	AM1340	用于生成带帽的 mRNA，以注射到胚胎中
Alexa488-葡聚糖偶联物，3 kDa	Life Technologies	D34682	与 mRNA 共同注射，以创建细胞内和细胞外的掩膜
6 孔塑料培养皿	BD Falcon		将胚胎在琼脂糖包被的孔中孵育，直至准备进行封片
胚胎培养基			每升含 250 mg Instant Ocean 盐、1 mg 亚甲蓝的反渗透水，用 NaHCO3 调节 pH 至 7
来自 Streptomyces griseus 的蛋白酶	Sigma	P5147	配制 5 mg/ml 储存液，使用时稀释至 1 mg/ml，用于脱去单细胞期胚胎的卵膜
直径 5 cm 的玻璃培养皿			用于胚胎脱膜
200 ml 玻璃烧杯			用于胚胎脱膜
显微注射装置			用于在单细胞期向胚胎注射 mRNA 和染料
体视显微镜			用于胚胎注射和封片操作
1x Danieau's 培养基			用于稀释低熔点琼脂糖并进行成像；配方：过滤（0.2 mm）后的溶液，含 58 mM NaCl、0.7 mM KCl、0.4 mM MgSO4、0.3 mM CaCl2 和 5 mM HEPES，pH 7.2
UltraPure 低熔点琼脂糖	Invitrogen	16520-100	用于胚胎封片；在 Danieau's 培养基中配制成 1% 浓度：将 200 mg 加入 20 ml Danieau's 培养基中，微波加热至溶解，然后分装至离心管中，每管 1 ml；分装后可于 4 °C 保存，使用前在 70 °C 重新熔化，并冷却至 40–42 °C 使用
玻璃巴斯德移液管	Kimble Chase（通过 Fisher 销售）	63A53WT	用于胚胎封片；需将管尖在火焰上烧圆，以防止锋利边缘损伤胚胎
金属探针			用于封片过程中调整胚胎位置
玻璃底培养皿	MatTek	P35G-1.5-14-C	根据物镜选择合适的盖玻片厚度；此处列出的货号对应盖玻片 No. 1.5
装有约 5 ml 胚胎培养基的 15 ml 离心管	BD Falcon		用于冲洗巴斯德移液管上残留的琼脂糖
倒置激光扫描共聚焦显微镜			需要配备汞弧灯、488 nm 激光、543 nm 激光以及相应的滤光片组
加热载物台			在实验过程中维持胚胎处于 28 °C 的最佳温度
支持延时成像的共聚焦软件			必须能够定义多个成像位置，并按设定的时间间隔自动对这些位置进行成像
25X 或 40X 水镜物镜			用于成像的物镜
10X 干镜物镜			用于光转化的物镜
浸油			折射率与水相同的浸油