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方法文章

利用光转化后荧光衰减法（FDAP）测量活体斑马鱼胚胎中的蛋白质稳定性

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DOI：

10.3791/52266

⸱

2015年1月28日

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University, 2Systems Biology of Development Group, Friedrich Miescher Laboratory of the Max Planck Society

本文内容

摘要

细胞和组织中的蛋白质水平通常由蛋白质的生成与清除之间的平衡进行严格调控。利用光转化后荧光衰减（Fluorescence Decay After Photoconversion, FDAP）技术，可对蛋白质的清除动力学进行实验测定 体内.

摘要

蛋白质稳定性影响生物学的诸多方面，测量蛋白质的清除动力学可为生物系统提供重要的见解。在FDAP实验中，可以测量活体生物内蛋白质的清除情况。将目标蛋白与一种光可转换荧光蛋白标记，使其在体内表达并进行光转换，随后监测光转换信号随时间下降的过程。然后将数据拟合到适当的清除模型中，以确定蛋白质的半衰期。重要的是，通过应用区域掩膜，可分别检测生物体不同区室中蛋白质群体的清除动力学。该方法已被用于测定斑马鱼发育过程中分泌型信号蛋白的细胞内和细胞外半衰期。本文中，我们描述了在斑马鱼胚胎中进行FDAP实验的详细方案。理论上，FDAP可用于测定任何光学可及生物体内任意可标记蛋白质的清除动力学。

引言

细胞和生物体内蛋白质的水平由其生成和清除速率决定。蛋白质的半衰期可短至数分钟，长达数天1-4。在许多生物系统中，关键蛋白质的稳定或清除对细胞活动具有重要影响。细胞周期的推进5,6、发育信号传导7-9、细胞凋亡10以及神经元的正常功能与维持11,12均依赖于细胞内蛋白质稳定性的调控。细胞外蛋白质的稳定性则影响分泌蛋白（如形态发生素）在组织内的分布与可利用性13,14。

在过去几十年中，蛋白质稳定性主要通过细胞培养中的放射性脉冲标记或放线菌酮追踪实验来评估15。在这类脉冲追踪实验中，细胞短暂暴露于含有放射性氨基酸前体的“脉冲”环境中，这些前体被整合到新合成的蛋白质中；或者暴露于放线菌酮中，后者可抑制蛋白质的合成。随后在不同时间点收集培养的细胞，并通过免疫沉淀结合自显影技术（用于放射性脉冲追踪实验）或蛋白质印迹法（用于放线菌酮实验）来定量检测蛋白质随时间的降解情况。

传统的蛋白质稳定性检测方法存在若干不足之处。首先，这些检测中的蛋白质通常并非在其内源环境中表达，而是在组织培养中表达，有时甚至在来自不同物种的细胞中表达。对于稳定性依赖于特定环境的蛋白质而言，这种方法存在问题。其次，无法在单个细胞或生物体中随时间推移追踪蛋白质的清除过程，这些检测所得的数据反映的是在不同时间点上不同细胞群体的平均值。由于单个细胞初始的蛋白质含量可能不同，摄取放射性标记物或环己酰亚胺的时间可能不同，或具有不同的清除动力学特性，因此此类汇总数据可能具有误导性。最后，在环己酰亚胺追踪实验中，添加蛋白质合成抑制剂可能会产生非预期的生理效应，从而人为地改变蛋白质的稳定性16-18。上述缺点可通过使用光转化后荧光衰减（Fluorescence Decay After Photoconversion, FDAP）技术加以避免，该技术利用光可转化蛋白在活体生物中动态测量蛋白质的清除过程19-25（FDAP技术的局限性详见讨论部分）。

光可转换蛋白是一类荧光蛋白，其激发和发射特性在特定波长的光照后会发生改变26。其中一种常用变体是Dendra2，它是一种“绿色转红色”的光可转换蛋白，最初具有与绿色荧光蛋白相似的激发和发射特性，但在暴露于紫外光（即“光转换”）后，其激发/发射特性会转变为类似于红色荧光蛋白的特性23,27。重要的是，光转换后新合成的蛋白不会具有与已光转换蛋白相同的激发/发射特性，因此可在光转换后将蛋白的合成与清除过程区分开来，从而仅观察到已光转换的蛋白群体。将目标蛋白与光可转换蛋白进行标记，便可在完整且光学可及的活体生物中实现对蛋白的脉冲式标记。

在FDAP实验（图1A）中，将目标蛋白与一种光可转换蛋白标记并表达于活体生物中（图1B）。对该融合蛋白进行光转换，并通过荧光显微镜监测光转换信号随时间的减弱情况（图1C）。随后，利用适当的模型对数据进行拟合，以确定该融合蛋白的半衰期（图1D）。

本文所述的FDAP检测方法旨在测定斑马鱼胚胎在早期胚胎发育过程中分泌型信号蛋白的细胞外半衰期19。然而，该方法可适用于任何能够耐受活体成像的透明模式生物，并可用于监测任何可标记的细胞内或细胞外蛋白的清除情况。本文所描述技术的多种变体已在培养细胞20,23、Drosophila22以及小鼠21胚胎中实施。

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方案

1. 生成光转化融合构建体并注射去壳斑马鱼胚胎

  1. 构建一个包含目标蛋白与绿色至红色光转换蛋白融合的功能性表达载体（参见 讨论），然后使用 体外 转录生成编码融合蛋白的加帽mRNA，方法同Müller 等 201219.
  2. 使用蛋白酶去除约30枚处于单细胞期的斑马鱼胚胎的卵膜。或者，使用镊子手动去除胚胎的卵膜28.
    注意：胚胎必须在后续成像前去除绒毛膜。如需要，可先透过绒毛膜进行胚胎注射，随后在成像前去除绒毛膜。
    1. 配制5 mg/ml的pronase储备液 Streptomyces griseus 在标准斑马鱼胚胎培养基中19在室温下轻轻摇动溶液 10 分钟，使蛋白酶充分溶解。将 2 ml 分装至微量离心管中，于 -20 °C.
    2. 将单细胞期胚胎转移至含有约8 ml胚胎培养液的5 cm直径玻璃或琼脂糖包被的塑料培养皿中。向培养皿中加入2 ml解冻的蛋白酶原储备液，在室温下孵育5至10分钟。
    3. 避免让胚胎暴露于空气或与塑料接触，因为与其中任一接触都会导致去壳胚胎破裂。取一个200 ml玻璃烧杯，装入胚胎培养液。将培养皿倾斜并浸入培养液中，从而将胚胎转移至烧杯内。
    4. 待胚胎沉降至烧杯底部后，倒出大部分胚胎培养液，然后向烧杯中加入新鲜胚胎培养液。加入培养液时产生的轻微涡流可使胚胎脱去已变弱的卵膜。
    5. 重复步骤 1.2.4。
  3. 将去壳的胚胎转移至琼脂糖包被的注射皿中29 使用火焰烧灼尖端的玻璃巴斯德吸管。烧灼吸管尖端可防止毛边损伤胚胎。
  4. 共同注射 mRNA 和 3 kDa Alexa488-葡聚糖偶联物29,30 (图1B；有关建议的mRNA和Alexa488-葡聚糖用量，请参见讨论部分）。将样品直接注射至细胞中央（而非卵黄），以确保在卵裂开始后mRNA和荧光染料能够均匀分布。
    注意：在数据分析过程中，Alexa488信号将用于生成区室化掩模，以区分细胞内和细胞外荧光。
  5. 将注射后的胚胎转移至六孔塑料培养皿中含胚胎培养液的1–2%琼脂糖包被的孔内。置于暗处孵育，温度为 28 °C 直到胚胎发育至晚期囊胚阶段31 （受精后约5小时）。每隔1至2小时在体视显微镜下检查胚胎，及时清除死亡胚胎产生的碎片。

2. 在倒置共聚焦显微镜上进行光转化和成像的斑马鱼胚胎装片

  1. 使用体视显微镜挑选出1至5个健康的胚胎，并用火焰拉制的玻璃巴斯德吸管将胚胎从培养皿中移出。
  2. 将胚胎轻轻吹入含有约1 ml熔融的1%低熔点琼脂糖（溶于1× Danieau胚胎培养基中，参见材料列表）的微量离心管中（图2A）。
    注意：琼脂糖温度应保持在40至42 °C之间；温度过高可能损伤胚胎。
  3. 将胚胎连同部分琼脂糖重新吸入吸管中，然后轻轻吹至玻璃底培养皿的盖玻片表面（图2B）。确保盖玻片的厚度与共聚焦显微镜所用物镜的规格相匹配。
    1. 可根据需要重复使用该玻璃吸管。为清除吸管内残留的琼脂糖并防止堵塞，可快速吸取胚胎培养基进行反复吹打。为此，可在体视显微镜旁放置一个装有约5 ml胚胎培养基的15 ml离心管。
  4. 使用金属探针调整胚胎位置，使动物极（胚盘）朝向盖玻片。操作应迅速，因为琼脂糖将在20–30秒内凝固。在琼脂糖完全硬化前，使用体视显微镜观察胚胎位置，并根据需要进行调整。
  5. 重复步骤2.1–2.4，直至完成所需数量胚胎的封片。
    注意：在典型实验中，可在盖玻片上放置四滴琼脂糖，每滴含四至五个胚胎，空间充足。一次理想的实验可对约16个胚胎进行成像（图2C）。
  6. 待琼脂糖完全凝固后，向玻璃底培养皿中加入1× Danieau胚胎培养基，直至充满。

3. 光转化及测量光转化信号的衰减

对于斑马鱼胚胎的尺寸和折射率而言，使用25倍或40倍的水镜是合适的。由于在长达五小时的实验过程中水会蒸发，因此最好使用与水折射率相同的浸油，而不是实际的水。请确保所用浸油适用于水镜（而非油镜）。

  1. 在物镜上放置一大滴浸油，以确保在成像过程中载物台移动至不同胚胎位置时，物镜与盖玻片之间的油膜不会断裂。将玻璃底培养皿牢固地放置在载物台上，防止载物台移动时培养皿发生位移。如有可能，使用设定为 28 °C 的加热载物台，此温度为斑马鱼发育的最适温度。
  2. 在共聚焦显微镜的软件中定义每个胚胎的位置。调整每个胚胎的 z 轴深度，尽量使所有胚胎成像于大致相同的焦平面。
    注意：距动物极约 30 μm 的深度较为理想，因为在此深度可避开胚胎的外包层，成像区域最大，且光散射最小。厚度约为 3.3 μm 的单个光学切片即可提供足够数据，无需采集 z 轴层扫图像（见第 5 节）。
  3. 实验过程中采集两个信号：“绿色”信号来自 Alexa488-葡聚糖偶联物——该信号将在数据分析中用于区分细胞外和细胞内荧光；“红色”信号来自光转化后的融合蛋白。
    1. 使用 488 nm 激光激发 Alexa488，并收集约 500 至 540 nm 范围内的发射荧光。注意：光转化后，许多绿色转红色的光可转换蛋白（例如，Dendra2）可被 543 nm 激光激发，并在约 550 至 650 nm 范围内发射荧光。应根据所使用的光可转换蛋白的特性进行相应调整。
  4. 采集“光转化前”图像，并配置共聚焦显微镜软件，以适当的成像条件每隔 10 或 20 分钟对步骤 3.2 中已定义的各个位置进行成像，持续五小时（见第 5 节和 讨论部分）。
  5. 为实现融合蛋白的光转化，切换至 10X 物镜，并使用汞灯配合激发波长约为 300–400 nm 的滤光片，在 100% 输出功率下照射一组胚胎 2 分钟。沿 z 轴方向移动焦点以促进光转化的均匀性（见第 5 节）。确保在光转化过程中浸油不会滴落到 10x 物镜上。
    注意：光转化过程中焦点的移动可实现自动化，以避免不同操作者之间的差异。
  6. 光转化完成后立即切换回 25X 或 40X 物镜。确认步骤 3.2 中已定义的位置仍然准确。若培养皿在光转化过程中发生位移，需重新定义胚胎的位置。
    1. 启动步骤 3.4 中创建的程序，并持续成像 5 小时。记录每个胚胎从光转化完成到成像开始之间的时间间隔。
  7. 定期检查实验进程。监测 Danieau’s 培养基的液面高度，必要时补充培养基。若软件停滞，需重新启动。
  8. 为确定在数据分析中用于估计指数衰减模型渐近线的背景荧光值，实验中应包含一些仅注射了 Alexa488-葡聚糖但未注射 mRNA 的胚胎。为测定仪器噪声（该值也将在后续数据分析中使用），需在无样品的情况下采集一幅图像。

4. 使用 PyFDAP 分析数据

  1. 目视检查每个胚胎的时间序列数据集。剔除在成像过程中死亡、发生显著位移、光转换信号极弱，或包含细胞区域外观异常且停止移动与分裂（常见于受损或状态不佳的胚胎）的数据集。
    注意：在其他方面可用的数据集中，偶尔会在一两个图像中出现浸油中的气泡或其他伪影。请记录下包含伪影的图像；这些图像将在后续被舍弃，而该数据集中剩余的时间点仍可进行分析。
  2. 使用基于 Python 的软件包 PyFDAP 分析 FDAP 数据。PyFDAP 通过测定每张图像中细胞内和细胞外的平均红色荧光强度，并利用指数衰减函数对数据进行拟合，从而计算半衰期56 (图3).
    1. 下载 PyFDAP（参见 材料清单
    2. 使用 PyFDAP 分离细胞内和细胞外的光转化信号（图3A,B）。使用严格位于细胞内的 Alexa488 信号创建细胞内掩膜。将该掩膜应用于对应的红色通道图像，以在计算平均细胞外强度时排除细胞内像素。为测量平均细胞内强度，需对掩膜进行反转。
    3. 在 PyFDAP 中显示步骤 4.2.2 中生成的掩膜图像。目视检查这些图像，并剔除无法准确区分细胞内与细胞外空间的数据集（这种情况应较为罕见；注意，在细胞外空间被掩膜的图像中包含细胞膜，但可通过调整阈值算法或引入膜掩膜来去除细胞膜）例如，使用膜定位CFP）。同时剔除包含伪影的任何单张图像（例如，步骤4.1中识别出的浸油中的气泡）
    4. 使用 PyFDAP 计算每幅图像的平均细胞外和细胞内荧光强度。PyFDAP 通过累加位于掩膜之外的像素强度，并除以所累加像素的总数，来计算这些平均值。
    5. 拟合荧光数据（图3C）拟合以下指数函数：
      Exponential decay equation c(t)=c₀e⁻ᵏᵗ+y₀; kinetic study; mathematical formula.
      其中 t 是光转化后的时间， c(t) 在给定值下的强度 t, c0 是强度在 t = 0, k 是清除率常数，以及 y0 是函数随着荧光减弱所趋近的渐近线（图1D). y0 可根据步骤 3.8 中的测量结果进行限定19.
    6. 使用 PyFDAP 从清除速率常数计算细胞外和细胞内蛋白质的半衰期（τ）k）使用以下关系式：
      Half-life calculation formula, τ = ln(2)/k, physics equation, radioactive decay concept.

5. 用于评估光漂白、意外光转化及光转化均一性的对照实验

  1. 评估光漂白
    注意：光漂白可能导致荧光强度出现人为下降，这种下降不仅反映了目标蛋白的清除情况，还反映了荧光蛋白自身的漂白特性。
    1. 为评估可能的光漂白现象，进行两组FDAP实验：一组成像间隔为10分钟，另一组成像间隔为20分钟（图4）。按照第4节所述方法，使用PyFDAP分析这两组实验的数据。
    2. 比较10分钟和20分钟间隔实验中获得的半衰期。若20分钟间隔实验得到的半衰期更长，表明存在显著的光漂白。若两组实验的半衰期相同，则光漂白不是主要问题。
    3. 或者，可在光转换后立即连续采集约30幅图像来评估光漂白。若荧光强度显著下降，则表明存在显著的光漂白。
    4. 若检测到光漂白，可采用较低的激光功率、缩短成像时间，或考虑使用光稳定性更高的光转换蛋白32。
  2. 评估意外光转换。
    注意：Dendra2可通过488 nm光照进行光转换27。在按照步骤3.3.1使用488 nm激光激发Alexa488时，可能发生意外的光转换，从而导致目标蛋白表观半衰期的人为延长。然而，我们及其他研究者33发现，在斑马鱼胚胎中，488 nm光照进行光转换的效率较低。
    1. 使用步骤5.1.1中描述的对照实验来检测是否存在意外光转换。比较10分钟和20分钟间隔实验的半衰期。若20分钟间隔实验的半衰期更短，表明存在显著的意外光转换。若两组实验的半衰期相同，则意外光转换不是主要问题。
    2. 若检测到意外光转换，应降低488 nm激光功率并缩短成像时间，以避免意外地转换Dendra2。
  3. 评估光转换均匀性。
    注意：若光转换偏向胚胎的动物极，则荧光强度的下降将受到蛋白扩散或细胞运动进入深层焦平面的影响（图5A）。
    1. 为确定光转换是否均匀，可表达一种分泌型光转换蛋白（用于细胞外融合蛋白实验）或细胞质光转换蛋白（用于细胞内融合蛋白实验）。按常规进行光转换后，每20分钟采集一次涵盖大部分胚盘区域的z轴层析图像，持续80分钟。
    2. 若光转换偏向动物极，则由于扩散或细胞运动，深层焦平面的荧光强度将随时间逐渐增加（图5B）。若检测到光转换不均匀，应在光转换过程中将焦点调至胚胎更深的层次。

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结果

FDAP 已被用于测定斑马鱼胚胎中细胞外信号蛋白的半衰期19。其中一种蛋白 Squint 可在胚胎发育过程中诱导中胚层-内胚层基因的表达34。Squint-Dendra2 能够以与未标记的 Squint 相似水平诱导中胚层-内胚层基因的表达，这已通过 qRT-PCR 和 原位 杂交实验得到验证19。将 Alexa488-葡聚糖和编码 Squint-Dendra2 的 mRNA 共同注射到胚胎中，并进行 FDAP 检测。随着时间的推移，细胞外光转化信号强度的下降明显可见（图 4A）。使用 PyFDAP 对 23 个胚胎生成细胞外强度分布曲线。利用 PyFDAP 将所得数据按一级清除动力学模型进行拟合，得到平均清除速率常数 k 为 1.00 × 10-4/秒，对应平均半衰期 τ 为 116 分钟。当成像时间间隔为 10 或 20 分钟时，获得的强度分布曲线和清除速率常数相似，表明光漂白或意外的光转化对信号强度变化的影响不显著（图 4B）。

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讨论

FDAP 实验的成功依赖于功能性光转化融合蛋白的生成。对蛋白质进行标记可能会影响其生物学活性和/或生物物理特性，包括其定位、溶解度和稳定性36-41。应准备测试多种不同融合构建体的活性，以筛选出具有功能的构建体。我们发现，改变光转化蛋白相对于目标蛋白的位置，或使用较长的连接序列（例如，采用氨基酸序列 LGDPPVAT19），可增强融合蛋白的活性。对于信号转导蛋白，可通过检测其诱导靶基因表达的能力来确定融合蛋白的活性19。qRT-PCR 或 原位 杂交可有效反映靶基因的表达水平19。需要注意的是，本文所述方案旨在测定斑马鱼早期胚胎中蛋白质的稳定性，若需在其他背景下评估蛋白质稳定性，则需对方案进行相应修改。

绿色到红色光转换蛋白 Dendra227 已成功应用于斑马鱼 FDAP 实验19（图4），但也有其他可选蛋白26,...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢 Jeffrey Farrell、James Gagnon 和 Jennifer Bergmann 对手稿提出的建议。KWR 在开发 FDAP 检测方法期间得到了美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目的资助。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）向 AFS 提供的资助，以及德国研究基金会（Emmy Noether 项目）、马普学会和人类前沿科学计划（职业发展奖）向 PM 提供的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PyFDAP（从以下网站下载：http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab）按照 PyFDAP 网站提供的说明进行安装和操作；PyFDAP 兼容 Linux、Mac 和 Windows 操作系统。
mMessage mMachine Sp6 转录试剂盒Life TechnologiesAM1340用于生成带帽的 mRNA，以注射到胚胎中
Alexa488-葡聚糖偶联物，3 kDaLife TechnologiesD34682与 mRNA 共同注射，以创建细胞内和细胞外的掩膜
6 孔塑料培养皿BD Falcon将胚胎在琼脂糖包被的孔中孵育，直至准备进行封片
胚胎培养基每升含 250 mg Instant Ocean 盐、1 mg 亚甲蓝的反渗透水，用 NaHCO3 调节 pH 至 7
来自 Streptomyces griseus 的蛋白酶SigmaP5147配制 5 mg/ml 储存液，使用时稀释至 1 mg/ml，用于脱去单细胞期胚胎的卵膜
直径 5 cm 的玻璃培养皿用于胚胎脱膜
200 ml 玻璃烧杯用于胚胎脱膜
显微注射装置用于在单细胞期向胚胎注射 mRNA 和染料
体视显微镜用于胚胎注射和封片操作
1x Danieau's 培养基用于稀释低熔点琼脂糖并进行成像；配方：过滤（0.2 mm）后的溶液，含 58 mM NaCl、0.7 mM KCl、0.4 mM MgSO4、0.3 mM CaCl2 和 5 mM HEPES，pH 7.2
UltraPure 低熔点琼脂糖Invitrogen16520-100用于胚胎封片；在 Danieau's 培养基中配制成 1% 浓度：将 200 mg 加入 20 ml Danieau's 培养基中，微波加热至溶解，然后分装至离心管中，每管 1 ml；分装后可于 4 °C 保存，使用前在 70 °C 重新熔化，并冷却至 40–42 °C 使用
玻璃巴斯德移液管Kimble Chase（通过 Fisher 销售）63A53WT用于胚胎封片；需将管尖在火焰上烧圆，以防止锋利边缘损伤胚胎
金属探针用于封片过程中调整胚胎位置
玻璃底培养皿MatTekP35G-1.5-14-C根据物镜选择合适的盖玻片厚度；此处列出的货号对应盖玻片 No. 1.5
装有约 5 ml 胚胎培养基的 15 ml 离心管BD Falcon用于冲洗巴斯德移液管上残留的琼脂糖
倒置激光扫描共聚焦显微镜需要配备汞弧灯、488 nm 激光、543 nm 激光以及相应的滤光片组
加热载物台在实验过程中维持胚胎处于 28 °C 的最佳温度
支持延时成像的共聚焦软件必须能够定义多个成像位置，并按设定的时间间隔自动对这些位置进行成像 
25X 或 40X 水镜物镜用于成像的物镜
10X 干镜物镜用于光转化的物镜
浸油折射率与水相同的浸油

参考文献

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