利用光转化后荧光衰减法（FDAP）测量活体斑马鱼胚胎中的蛋白质稳定性

摘要

细胞和组织中的蛋白质水平通常由蛋白质的生成与清除之间的平衡进行严格调控。利用光转化后荧光衰减（Fluorescence Decay After Photoconversion, FDAP）技术，可对蛋白质的清除动力学进行实验测定 体内.

摘要

蛋白质稳定性影响生物学的诸多方面，测量蛋白质的清除动力学可为生物系统提供重要的见解。在FDAP实验中，可以测量活体生物内蛋白质的清除情况。将目标蛋白与一种光可转换荧光蛋白标记，使其在体内表达并进行光转换，随后监测光转换信号随时间下降的过程。然后将数据拟合到适当的清除模型中，以确定蛋白质的半衰期。重要的是，通过应用区域掩膜，可分别检测生物体不同区室中蛋白质群体的清除动力学。该方法已被用于测定斑马鱼发育过程中分泌型信号蛋白的细胞内和细胞外半衰期。本文中，我们描述了在斑马鱼胚胎中进行FDAP实验的详细方案。理论上，FDAP可用于测定任何光学可及生物体内任意可标记蛋白质的清除动力学。

引言

细胞和生物体内蛋白质的水平由其生成和清除速率决定。蛋白质的半衰期可短至数分钟，长达数天^1-4。在许多生物系统中，关键蛋白质的稳定或清除对细胞活动具有重要影响。细胞周期的推进^5,6、发育信号传导^7-9、细胞凋亡¹⁰以及神经元的正常功能与维持^11,12均依赖于细胞内蛋白质稳定性的调控。细胞外蛋白质的稳定性则影响分泌蛋白（如形态发生素）在组织内的分布与可利用性^13,14。

在过去几十年中，蛋白质稳定性主要通过细胞培养中的放射性脉冲标记或放线菌酮追踪实验来评估¹⁵。在这类脉冲追踪实验中，细胞短暂暴露于含有放射性氨基酸前体的“脉冲”环境中，这些前体被整合到新合成的蛋白质中；或者暴露于放线菌酮中，后者可抑制蛋白质的合成。随后在不同时间点收集培养的细胞，并通过免疫沉淀结合自显影技术（用于放射性脉冲追踪实验）或蛋白质印迹法（用于放线菌酮实验）来定量检测蛋白质随时间的降解情况。

传统的蛋白质稳定性检测方法存在若干不足之处。首先，这些检测中的蛋白质通常并非在其内源环境中表达，而是在组织培养中表达，有时甚至在来自不同物种的细胞中表达。对于稳定性依赖于特定环境的蛋白质而言，这种方法存在问题。其次，无法在单个细胞或生物体中随时间推移追踪蛋白质的清除过程，这些检测所得的数据反映的是在不同时间点上不同细胞群体的平均值。由于单个细胞初始的蛋白质含量可能不同，摄取放射性标记物或环己酰亚胺的时间可能不同，或具有不同的清除动力学特性，因此此类汇总数据可能具有误导性。最后，在环己酰亚胺追踪实验中，添加蛋白质合成抑制剂可能会产生非预期的生理效应，从而人为地改变蛋白质的稳定性^16-18。上述缺点可通过使用光转化后荧光衰减（Fluorescence Decay After Photoconversion, FDAP）技术加以避免，该技术利用光可转化蛋白在活体生物中动态测量蛋白质的清除过程^19-25（FDAP技术的局限性详见讨论部分）。

光可转换蛋白是一类荧光蛋白，其激发和发射特性在特定波长的光照后会发生改变²⁶。其中一种常用变体是Dendra2，它是一种“绿色转红色”的光可转换蛋白，最初具有与绿色荧光蛋白相似的激发和发射特性，但在暴露于紫外光（即“光转换”）后，其激发/发射特性会转变为类似于红色荧光蛋白的特性^23,27。重要的是，光转换后新合成的蛋白不会具有与已光转换蛋白相同的激发/发射特性，因此可在光转换后将蛋白的合成与清除过程区分开来，从而仅观察到已光转换的蛋白群体。将目标蛋白与光可转换蛋白进行标记，便可在完整且光学可及的活体生物中实现对蛋白的脉冲式标记。

在FDAP实验（图1A）中，将目标蛋白与一种光可转换蛋白标记并表达于活体生物中（图1B）。对该融合蛋白进行光转换，并通过荧光显微镜监测光转换信号随时间的减弱情况（图1C）。随后，利用适当的模型对数据进行拟合，以确定该融合蛋白的半衰期（图1D）。

本文所述的FDAP检测方法旨在测定斑马鱼胚胎在早期胚胎发育过程中分泌型信号蛋白的细胞外半衰期¹⁹。然而，该方法可适用于任何能够耐受活体成像的透明模式生物，并可用于监测任何可标记的细胞内或细胞外蛋白的清除情况。本文所描述技术的多种变体已在培养细胞^20,23、Drosophila²²以及小鼠²¹胚胎中实施。

方案

1. 构建光转换融合载体并注射去壳斑马鱼胚胎

1. 构建一个包含目标蛋白与绿色至红色光转换蛋白融合的功能性表达载体（参见 讨论），然后使用 体外 转录生成编码融合蛋白的加帽mRNA，方法同Müller 等人， 2012¹⁹.
2. 使用蛋白酶去除约30个处于单细胞期的斑马鱼胚胎的卵膜。或者，使用镊子手动去除胚胎的卵膜²⁸.
   注意：为了进行后续成像，必须对胚胎进行去壳膜处理。如有需要，可先透过壳膜注射胚胎，然后在成像前立即进行去壳膜处理。
   1. 制备5 mg/ml的蛋白酶原储备液 Streptomyces griseus 在标准斑马鱼胚胎培养基中¹⁹在室温下轻轻摇动溶液10分钟，使蛋白酶充分溶解。将2 ml分装至微量离心管中，于-20 °C冷冻保存。
   2. 将受精卵期胚胎转移至含有约8 ml胚胎培养液的5 cm直径玻璃或琼脂糖包被的塑料培养皿中。向培养皿中加入2 ml解冻的蛋白酶原储备液，在室温下孵育5至10分钟。
   3. 避免让胚胎接触空气或塑料，因为与其中任何一种物质接触都会导致去壳胚胎破裂。取一个200 ml玻璃烧杯，盛满胚胎培养液。将培养皿倾斜并浸入培养液中，将胚胎转移至烧杯内。
   4. 待胚胎沉降至烧杯底部后，倒出大部分胚胎培养液，然后向烧杯中加入新鲜的胚胎培养液。加入培养液时产生的轻微涡流可使胚胎脱去已变弱的卵膜。
   5. 重复步骤 1.2.4。
3. 将去壳的胚胎转移至琼脂糖包被的注射皿中²⁹ 使用火焰抛光尖端的玻璃巴斯德移液管。对移液管尖端进行火焰处理可防止毛边损伤胚胎。
4. 共同注射 mRNA 和 3 kDa Alexa488-葡聚糖偶联物^29,30 (图1B；有关建议使用的mRNA和Alexa488-葡聚糖用量，请参见讨论部分）。将样品直接注射到细胞中央（而非卵黄中），以确保在卵裂开始后mRNA和荧光染料能够均匀分布。
   注意：在数据分析过程中，Alexa488信号将用于生成区室化掩模，以区分细胞内和细胞外荧光。
5. 将已注射的胚胎转移至六孔塑料培养皿中经1–2%琼脂糖包被的孔内，孔中预先加入胚胎培养液。于28 °C避光孵育，直至胚胎发育至晚期球形期。³¹ （受精后约5小时）。每隔1至2小时在体视显微镜下检查胚胎，移除已死亡胚胎产生的碎片。

2. 在倒置共聚焦显微镜上进行光转化和成像的斑马鱼胚胎制备

1. 使用体视显微镜挑选出一至五个健康的胚胎，并用火焰拉制的玻璃巴斯德吸管将它们从培养皿中移出。
2. 将胚胎轻轻吹入一个含有约 1 ml 融化的 1% 低熔点琼脂糖（溶于 1× Danieau 胚胎培养基中，参见材料列表）的微量离心管中（图 2A）。
   注意：琼脂糖温度应保持在 40 至 42 °C 之间；温度过高可能损伤胚胎。
3. 用吸管吸取部分琼脂糖并将胚胎一同吸入。然后将琼脂糖与胚胎轻轻吹至玻璃底培养皿的盖玻片上（图 2B）。确保盖玻片的厚度与共聚焦显微镜物镜的要求相匹配。
   1. 可根据需要重复使用该玻璃吸管。为清除吸管内残留的琼脂糖并防止堵塞，可快速吸取胚胎培养基进行反复吹打。为此，可在体视显微镜旁放置一个装有约 5 ml 胚胎培养基的 15 ml 离心管。
4. 使用金属探针调整胚胎位置，使动物极（胚盘）朝向盖玻片。操作应迅速，因为琼脂糖将在 20–30 秒内凝固。在琼脂糖硬化前，使用体视显微镜观察胚胎位置，并根据需要进行调整。
5. 重复步骤 2.1–2.4，直至完成所需数量胚胎的封片。
   注意：在典型实验中，可在盖玻片上放置四个琼脂糖液滴，每滴含四至五个胚胎，即可轻松容纳。一次理想的实验可对约 16 个胚胎进行成像（图 2C）。
6. 待琼脂糖完全凝固后，向玻璃底培养皿中加入 1× Danieau 胚胎培养基，直至充满。

3. 光转化及测量光转化信号的减少

对于斑马鱼胚胎的大小和折射率而言，25倍或40倍的水镜是合适的。最好使用与水折射率相同的浸油，而不是实际的水，因为在长达五小时的实验过程中水会蒸发。请确保所用浸油适用于水镜（而非油镜）。

1. 在物镜上放置一大滴浸油，以确保在成像过程中载物台移动至不同胚胎位置时，物镜与盖玻片之间的油膜不会断裂。将玻璃底培养皿牢固地放置在载物台上，防止载物台移动时培养皿发生位移。如果条件允许，使用设定为28 °C的加热载物台，此温度为斑马鱼发育的最适温度。
2. 在共聚焦显微镜的软件中定义每个胚胎的位置。调整每个胚胎的z轴深度，尽量使所有胚胎的成像平面大致相同。
   注意：距动物极约30 μm的深度较为理想，因为在此深度可避开胚胎的外包层，成像区域最大，且光散射最小。厚度约为3.3 μm的单个光学切片即可提供足够数据，无需采集z轴层扫图像（见第5节）。
3. 实验过程中采集两个信号：来自Alexa488-葡聚糖偶联物的“绿色”信号——该信号将在数据分析中用于区分细胞外和细胞内荧光；以及光转化后融合蛋白产生的“红色”信号。
   1. 使用488 nm激光激发Alexa488，并收集约500至540 nm范围内的发射荧光。注意：光转化后，许多绿色转红色的光转化蛋白（例如，Dendra2）可被543 nm激光激发，并在约550至650 nm范围内发射荧光。应根据所使用的光转化蛋白类型进行相应调整。
4. 采集“光转化前”图像，并配置共聚焦显微镜软件，以适当的成像条件每隔10或20分钟对先前定义的各个位置（步骤3.2中定义）进行成像，持续五小时的时间序列采集（见第5节及 讨论部分）。
5. 为实现融合蛋白的光转化，切换至10X物镜，并使用汞灯配合激发波长约为300–400 nm的滤光片，在100%输出功率下照射一组胚胎，持续2分钟。沿z轴方向调整焦平面，以促进光转化的均匀性（见第5节）。确保在光转化过程中浸油不会滴落到10X物镜上。
   注意：光转化过程中焦平面的移动可实现自动化，以避免不同操作者之间的差异。
6. 光转化完成后立即切换回25X或40X物镜。确认步骤3.2中定义的位置仍然准确。若培养皿在光转化过程中发生位移，需重新定义胚胎的位置。
   1. 启动步骤3.4中创建的程序，使成像持续进行5小时。记录每个胚胎从光转化完成到成像开始之间的时间间隔。
7. 定期检查实验进程，监测Danieau's培养基的液面高度，必要时补充培养基。若软件运行停滞，需重新启动。
8. 为确定在数据分析中用于估计指数衰减模型渐近线的背景荧光值，实验中应包含一些仅注射了Alexa488-葡聚糖但未注射mRNA的胚胎。为测定仪器噪声（该值也将在后续数据分析中使用），需在无样品的情况下采集一幅图像。

4. 使用 PyFDAP 分析数据

1. 目视检查每个胚胎的时间序列数据集。剔除在成像过程中死亡、发生显著位移、光转换信号极弱，或包含细胞区域外观异常且停止移动与分裂的胚胎数据集（此类特征通常提示胚胎受损或状态不佳）。
   注意：在其他方面可用的数据集中，偶尔会在一两个图像中出现浸油中的气泡或其他伪影。请记录下包含伪影的图像；这些图像将在后续被舍弃，而该数据集中的其余时间点仍可进行分析。
2. 使用基于 Python 的软件包 PyFDAP 分析 FDAP 数据。PyFDAP 通过测定每幅图像中细胞内和细胞外的平均红色荧光强度，并将数据拟合为指数衰减函数，从而计算半衰期。⁵⁶ (图3).
   1. 下载 PyFDAP（参见 材料清单
   2. 使用 PyFDAP 分离细胞内和细胞外的光转化信号图3A,B）。使用严格位于细胞内的 Alexa488 信号创建细胞内掩膜。将该掩膜应用于对应的红色通道图像，以在计算平均细胞外强度时排除细胞内像素的干扰。为测量平均细胞内强度，需将掩膜反转。
   3. 在 PyFDAP 中显示步骤 4.2.2 生成的掩膜图像。目视检查这些图像，并剔除无法准确区分细胞内与细胞外空间的数据集（这种情况应较为罕见；注意，在细胞外空间被掩膜的图像中包含细胞膜，但可通过调整阈值算法或引入膜掩膜来去除细胞膜）例如，使用膜定位CFP）。同时剔除任何包含伪影的单张图像（例如，步骤4.1中识别出的浸油中的气泡）
   4. 使用 PyFDAP 计算每幅图像的平均细胞外和细胞内荧光强度。PyFDAP 通过累加位于掩膜之外的像素强度，并除以所累加像素的总数，来计算这些平均值。
   5. 拟合荧光数据（图3C）拟合以下指数函数：
      
      其中 t 是光转化后的时间， c(t) 在给定值下的强度 t, c₀ 是强度在 t = 0, k 是清除率常数，且 y₀ 是函数随着荧光减弱所趋近的渐近线（图1D). y₀ 可根据步骤3.8中的测量结果进行限定¹⁹.
   6. 使用 PyFDAP 从清除速率常数计算细胞外和细胞内蛋白质的半衰期（τ）k）使用以下关系式：
      

5. 评估光漂白、意外光转化及光转化均一性的对照实验

1. 评估光漂白
   注意：光漂白可能导致荧光强度出现人为降低，这种降低不仅反映了目标蛋白的清除情况，还反映了荧光蛋白自身的光漂白特性。
   1. 为评估可能的光漂白现象，进行两组FDAP实验：一组在成像之间间隔10分钟，另一组在成像之间间隔20分钟（图4）。使用PyFDAP按照第4节所述方法分析这两组实验的数据。
   2. 比较10分钟和20分钟间隔实验所得的半衰期。若20分钟间隔实验得到更长的半衰期，表明存在显著的光漂白。如果两个实验的半衰期相同，则光漂白不是主要问题。
   3. 或者，可在光转化后立即连续采集约30张图像来评估光漂白。若荧光强度显著下降，则表明存在显著的光漂白。
   4. 若检测到光漂白，应使用较低的激光功率、缩短成像时间，或考虑采用光稳定性更高的光转化蛋白³²。
2. 评估意外光转化
   注意：Dendra2可通过488 nm光照实现光转化²⁷。在按照步骤3.3.1使用488 nm激光激发Alexa488时，可能发生意外光转化，从而导致目标蛋白表观半衰期的人为延长。然而，我们及其他研究者³³发现，在斑马鱼胚胎中，488 nm光照是一种效率很低的光转化方式。
   1. 使用步骤5.1.1中描述的对照实验来检测是否存在意外光转化。比较10分钟和20分钟间隔实验的半衰期。若20分钟间隔实验得到更短的半衰期，表明存在显著的意外光转化。如果两个实验的半衰期相同，则意外光转化不是主要问题。
   2. 若检测到意外光转化，应降低488 nm激光功率并缩短成像时间，以避免意外地转化Dendra2。
3. 评估光转化均匀性
   注意：如果光转化偏向胚胎的动物极，则荧光强度的下降将受到蛋白质扩散或细胞向深层移动的影响（图5A）。
   1. 为确定光转化是否均匀，可表达一种分泌型光转化蛋白（用于细胞外融合蛋白实验）或细胞质光转化蛋白（用于细胞内融合蛋白实验）。按常规进行光转化，然后每20分钟采集一次涵盖大部分胚盘区域的z轴层扫图像，持续80分钟。
   2. 若光转化偏向动物极，则由于扩散或细胞移动，深层区域的荧光强度将随时间逐渐增加（图5B）。若发现光转化不均匀，在进行光转化时应将焦点调至胚胎更深的层面。

结果

FDAP 已被用于测定斑马鱼胚胎中细胞外信号蛋白的半衰期¹⁹。其中一种蛋白 Squint 可在胚胎发育过程中诱导中内胚层基因的表达³⁴。Squint-Dendra2 诱导中内胚层基因表达的水平与未标记的 Squint 相似，这已通过 qRT-PCR 和原位杂交实验得到证实¹⁹。将 Alexa488-葡聚糖和编码 Squint-Dendra2 的 mRNA 共同注射到胚胎中，并进行 FDAP 检测。随时间推移，细胞外光转化信号强度的下降明显可见（图 4A）。使用 PyFDAP 对 23 个胚胎的细胞外强度分布进行分析，并通过 PyFDAP 采用一级清除动力学模型进行拟合，得到平均清除速率常数 k 为 1.00 × 10^-4/秒，对应平均半衰期 τ 为 116 分钟。当成像时间间隔为 10 或 20 分钟时，获得的强度分布和清除速率常数相似，表明光漂白或意外的光转化对信号强度变化无显著影响（图 4B）。

讨论

FDAP 实验的成功依赖于功能性光转化融合蛋白的生成。对蛋白质进行标记可能会影响其生物学活性和/或生物物理特性，包括其定位、溶解度和稳定性^36-41。应准备测试多种不同融合构建体的活性，以筛选出具有功能的构建体。我们发现，改变光转化蛋白相对于目标蛋白的位置，或使用较长的连接序列（例如，采用氨基酸序列 LGDPPVAT¹⁹），可增强融合蛋白的活性。对于信号转导蛋白，可通过检测其诱导靶基因表达的能力来确定融合蛋白的活性¹⁹。qRT-PCR 或 原位 杂交可有效反映靶基因的表达水平¹⁹。需要注意的是，本文所述方案旨在测定斑马鱼早期胚胎中蛋白质的稳定性，若需在其他背景下评估蛋白质稳定性，则需对方案进行相应修改。

绿色到红色光转换蛋白 Dendra2²⁷ 已成功应用于斑马鱼 FDAP 实验¹⁹（图4），但也有其他可选蛋白^26,...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PyFDAP（从以下网站下载：http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab）			按照 PyFDAP 网站提供的说明进行安装和操作；PyFDAP 兼容 Linux、Mac 和 Windows 操作系统。
mMessage mMachine Sp6 转录试剂盒	Life Technologies	AM1340	用于生成带帽的 mRNA，以注射到胚胎中
Alexa488-葡聚糖偶联物，3 kDa	Life Technologies	D34682	与 mRNA 共同注射，以创建细胞内和细胞外的掩膜
6 孔塑料培养皿	BD Falcon		将胚胎在琼脂糖包被的孔中孵育，直至准备进行封片
胚胎培养基			每升含 250 mg Instant Ocean 盐、1 mg 亚甲蓝的反渗透水，用 NaHCO3 调节 pH 至 7
来自 Streptomyces griseus 的蛋白酶	Sigma	P5147	配制 5 mg/ml 储存液，使用时稀释至 1 mg/ml，用于脱去单细胞期胚胎的卵膜
直径 5 cm 的玻璃培养皿			用于胚胎脱膜
200 ml 玻璃烧杯			用于胚胎脱膜
显微注射装置			用于在单细胞期向胚胎注射 mRNA 和染料
体视显微镜			用于胚胎注射和封片操作
1x Danieau's 培养基			用于稀释低熔点琼脂糖并进行成像；配方：过滤（0.2 mm）后的溶液，含 58 mM NaCl、0.7 mM KCl、0.4 mM MgSO4、0.3 mM CaCl2 和 5 mM HEPES，pH 7.2
UltraPure 低熔点琼脂糖	Invitrogen	16520-100	用于胚胎封片；在 Danieau's 培养基中配制成 1% 浓度：将 200 mg 加入 20 ml Danieau's 培养基中，微波加热至溶解，然后分装至离心管中，每管 1 ml；分装后可于 4 °C 保存，使用前在 70 °C 重新熔化，并冷却至 40–42 °C 使用
玻璃巴斯德移液管	Kimble Chase（通过 Fisher 销售）	63A53WT	用于胚胎封片；需将管尖在火焰上烧圆，以防止锋利边缘损伤胚胎
金属探针			用于封片过程中调整胚胎位置
玻璃底培养皿	MatTek	P35G-1.5-14-C	根据物镜选择合适的盖玻片厚度；此处列出的货号对应盖玻片 No. 1.5
装有约 5 ml 胚胎培养基的 15 ml 离心管	BD Falcon		用于冲洗巴斯德移液管上残留的琼脂糖
倒置激光扫描共聚焦显微镜			需要配备汞弧灯、488 nm 激光、543 nm 激光以及相应的滤光片组
加热载物台			在实验过程中维持胚胎处于 28 °C 的最佳温度
支持延时成像的共聚焦软件			必须能够定义多个成像位置，并按设定的时间间隔自动对这些位置进行成像
25X 或 40X 水镜物镜			用于成像的物镜
10X 干镜物镜			用于光转化的物镜
浸油			折射率与水相同的浸油