使用TIRFM和pH敏感型GFP探针评估SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中神经递质囊泡动态：细胞成像与数据分析

摘要

本文介绍了一种利用突触小泡蛋白2-pHluorin构建体和全内反射荧光显微镜技术研究神经母细胞瘤细胞中神经递质囊泡动态的方法。同时报道了图像处理与数据分析的策略。

摘要

突触小泡通过融合与回收的动态循环在化学突触处释放神经递质。监测突触活动在 实时 在单囊泡水平上解析胞吐-胞吞作用的不同步骤，对于理解生理和病理条件下的突触功能至关重要。

直接靶向突触小泡的遗传编码pH敏感探针，结合全内反射荧光显微镜（TIRFM），可提供追踪小泡动态所需的时空分辨率。由全内反射产生的隐逝场仅能激发细胞贴附的玻片表面以上一层薄层（<150 nm）内的荧光分子，而这正是胞吐-胞吞过程发生的确切位置。由此获得的高对比度图像非常适合对小泡进行追踪以及对融合事件进行定量分析。

本方案中，SH-SY5Y 人神经母细胞瘤细胞因其表面平坦且囊泡分布分散，被提议作为利用全内反射荧光显微镜（TIRFM）在单囊泡水平研究神经递质释放的有价值模型。文中提供了将 SH-SY5Y 培养为贴壁细胞以及转染突触 pHluorin 的方法，同时介绍了进行 TIRFM 观察和成像的技术 。最后，提出了一种策略，旨在对全细胞及单囊泡水平的融合事件进行筛选、计数和分析。

为验证成像流程和数据分析方法，对pHluorin标记囊泡的动力学行为进行了研究。 在静息和刺激（去极化钾浓度）条件下进行分析。膜去极化会增加囊泡融合事件的频率，并导致全细胞记录的净荧光信号同步升高。单囊泡分析揭示了融合事件行为的改变（峰值高度和宽度增加）。这些数据表明，钾去极化不仅诱导大量神经递质释放，还改变了囊泡融合与再循环的机制。

使用适当的荧光探针，该技术可用于不同的细胞系统，以解析组成型和刺激性分泌的机制。

引言

神经元之间的化学突触传递是神经系统中信息交流的主要机制。该过程依赖于突触前部位囊泡融合与回收的动态循环来释放神经递质。尽管许多参与囊泡动态过程的蛋白质已被鉴定出来，但它们在该现象中的具体作用仍有待阐明¹。

我们的认知在一定程度上受到限制，原因在于目前最常用的胞吐/胞吞检测方法并不总是最合适的。许多关于囊泡融合与动态过程的研究依赖于电生理学技术。该技术具有最佳的时间分辨率，非常适合研究囊泡与质膜的初始融合过程，但无法检测支持突触前功能的许多潜在分子事件。另一方面，电子显微镜能够提供对每一个单独步骤最精细的形态学描述，但由于样品必须经过固定才能分析，因此无法捕捉事件的动态过程。

新型光学记录技术的出现^2,3，结合荧光分子探针开发的进展^4-6，能够实现胞吐过程的可视化 在活体中 细胞，从而为突触结构与功能提供了新的信息层次。

早期研究利用了依赖于活性的苯乙烯类染料（FM1-43及相关有机染料）^7,8。目前最先进的成像技术则采用与囊泡腔内蛋白相连的绿色荧光蛋白（GFP）的pH敏感变体（pHluorin）⁹。由于囊泡内腔pH值较低，这些探针在囊泡中通常处于关闭状态。当囊泡与质膜融合后，其内腔暴露于中性的细胞外环境，pH值迅速升高，解除pHluorin....

方案

1. 细胞培养与转染

1. SH-SY5Y 细胞培养
   注意：实验使用人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞系（ATCC# CRL-2266）进行¹⁵SH-SY5Y 细胞以悬浮细胞团和贴壁细胞的混合形式生长。请遵循本方案中所述的指导说明（细胞密度、传代比例， 等等以确保细胞牢固地贴附于玻璃盖片上，这对于全内反射荧光显微镜（TIRFM）至关重要。
   1. 开始前，在超净工作台内配制适量的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）和培养基。
      1. 配制 50 ml PBS，含 150 mM NaCl、24 mM 磷酸盐缓冲液，pH 7.4。过滤该溶液。
      2. 使用高糖型 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM），加入 10% 灭活胎牛血清（FBS）、青霉素（100 U/ml）、链霉素（100 µg/ml）、L-谷氨酰胺（2 mM）和丙酮酸钠（1 mM），配制 50 ml 细胞培养基。过滤该溶液。
   2. 移除完全培养基，用 3 ml PBS 洗涤细胞。
   3. 将细胞在37 °C、5% CO₂条件下，用2 ml 0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）（适用于6 cm培养皿）孵育5分钟。₂ 使用移液器吹打使细胞脱落。
   4. 通过加入 2 ml DMEM 灭活胰蛋白酶，并在 300 ....

结果

所述的全内反射荧光（TIRF）成像与数据分析方法旨在研究细胞系统中囊泡的动力学行为。该技术可用于评估信号分子和药物对融合事件及神经递质囊泡动态的影响¹⁷。通过使用GFP标记的质膜蛋白，TIRF显微技术已被用于表征胶质细胞和上皮细胞中GFP标记的谷氨酸转运蛋白的组成型运输过程^18,19。

为了验证所报道的成像方法和数据分析策略，分别在基础状态和刺激条件下（钾诱导去极化），记录转染了突触-pHluorin的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中的融合事件（视频 1、2）。进行了两种不同的分析：全细胞分析（图 4）和单囊泡分析（图 5）。

全细胞分析用于测量细胞中融合事件的总数以及刺激诱导的净荧光变化。图4展示了在静息状态和刺激条件下（KCl刺激），使用相同实验方案（曝光时间、激光功率等）记录转染了synapto-pHluorin的细胞的结果。图.......

讨论

本文介绍了一种利用荧光cDNA编码载体和全内反射荧光显微镜（TIRFM）对分泌细胞中囊泡动态进行成像与分析的实验方案。TIRFM成功成像的关键要素包括细胞模型的选择，以及使用基因编码的囊泡释放与循环光学探针对细胞进行转染。

全内反射荧光显微镜（TIRFM）非常适合用于观察贴附在玻璃盖玻片上生长且形态足够扁平的细胞，从而能够稳定地可视化细胞膜及膜融合事件。理想情况下，囊泡应在细胞内分散分布，以便在单个囊泡水平上对它们的运输、融合和内吞过程进行成像和定量分析。然而，神经元并不满足这些条件：其形态不规则，神经突经常相互交叉，且囊泡融合主要集中在少数特定区域（即活性区）。因此，在原代培养的神经元中，利用TIRFM研究这些区域的囊泡动态极为困难。

我们首次证明，通过全内反射荧光显微镜（TIRFM）技术，SH-SY5Y 人神经母细胞瘤细胞系可作为研究静息和刺激条件下神经递质释放的有价值的替代模型。该细胞系具有神经元表型，包括细胞体和细长的突起，含有合成神经递质所需的酶、突触结构相关蛋白以及受调控的分泌机制。此外，在视黄酸、佛波酯和二丁酰环.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器设备
Axio Observer Z1	Zeiss	491912-9850-000	倒置显微镜
多线氩离子激光器 Lasos 77	Lasos	00000-1312-752	多线（458/488/514 nm），100 mW 氩离子激光器
激光TIRF滑块	蔡司	423681-9901-000
100倍物镜	蔡司	421190-9900-000	油，NA 1.45 Alpha-Plan
CCD相机 RetigaSRV 快速1394	QImaging
LAMBDA 10-3 智能快门光学滤光片切换器	Sutter Instrument Company
软件
Image ProPlus 6.3 软件	Media Cybernetics		斑点选择，感兴趣区域选择，荧光强度测定
Excel	Microsoft		光漂白校正，全细胞与单囊泡分析
GraphPad Prism 4.00	GraphPad Software, Inc.		统计分析