本文介绍了一种利用突触小泡蛋白2-pHluorin构建体和全内反射荧光显微镜技术研究神经母细胞瘤细胞中神经递质囊泡动态的方法。同时报道了图像处理与数据分析的策略。
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本文内容
摘要
摘要
突触小泡通过融合与回收的动态循环在化学突触处释放神经递质。监测突触活动在 实时 在单囊泡水平上解析胞吐-胞吞作用的不同步骤，对于理解生理和病理条件下的突触功能至关重要。
直接靶向突触小泡的遗传编码pH敏感探针，结合全内反射荧光显微镜（TIRFM），可提供追踪小泡动态所需的时空分辨率。由全内反射产生的隐逝场仅能激发细胞贴附的玻片表面以上一层薄层（<150 nm）内的荧光分子，而这正是胞吐-胞吞过程发生的确切位置。由此获得的高对比度图像非常适合对小泡进行追踪以及对融合事件进行定量分析。
本方案中，SH-SY5Y 人神经母细胞瘤细胞因其表面平坦且囊泡分布分散，被提议作为利用全内反射荧光显微镜（TIRFM）在单囊泡水平研究神经递质释放的有价值模型。文中提供了将 SH-SY5Y 培养为贴壁细胞以及转染突触 pHluorin 的方法，同时介绍了进行 TIRFM 观察和成像的技术 。最后，提出了一种策略，旨在对全细胞及单囊泡水平的融合事件进行筛选、计数和分析。
为验证成像流程和数据分析方法，对pHluorin标记囊泡的动力学行为进行了研究。 在静息和刺激（去极化钾浓度）条件下进行分析。膜去极化会增加囊泡融合事件的频率，并导致全细胞记录的净荧光信号同步升高。单囊泡分析揭示了融合事件行为的改变（峰值高度和宽度增加）。这些数据表明，钾去极化不仅诱导大量神经递质释放，还改变了囊泡融合与再循环的机制。
使用适当的荧光探针，该技术可用于不同的细胞系统，以解析组成型和刺激性分泌的机制。
引言
神经元之间的化学突触传递是神经系统中信息交流的主要机制。该过程依赖于突触前部位囊泡融合与回收的动态循环来释放神经递质。尽管许多参与囊泡动态过程的蛋白质已被鉴定出来，但它们在该现象中的具体作用仍有待阐明1。
我们的认知在一定程度上受到限制，原因在于目前最常用的胞吐/胞吞检测方法并不总是最合适的。许多关于囊泡融合与动态过程的研究依赖于电生理学技术。该技术具有最佳的时间分辨率，非常适合研究囊泡与质膜的初始融合过程，但无法检测支持突触前功能的许多潜在分子事件。另一方面，电子显微镜能够提供对每一个单独步骤最精细的形态学描述，但由于样品必须经过固定才能分析，因此无法捕捉事件的动态过程。
新型光学记录技术的出现2,3，结合荧光分子探针开发的进展4-6，能够实现胞吐过程的可视化 在活体中 细胞，从而为突触结构与功能提供了新的信息层次。
早期研究利用了依赖于活性的苯乙烯类染料（FM1-43及相关有机染料）7,8。目前最先进的成像技术则采用与囊泡腔内蛋白相连的绿色荧光蛋白（GFP）的pH敏感变体（pHluorin）9。由于囊泡内腔pH值较低，这些探针在囊泡中通常处于关闭状态。当囊泡与质膜融合后，其内腔暴露于中性的细胞外环境，pH值迅速升高，解除pHluorin的质子依赖性荧光淬灭，从而快速产生荧光信号。由于pHluorin的荧光变化速度比膜融合事件本身更快，因此通过监测荧光强度的增加，可以测量并分析囊泡与膜的融合过程。由于标记了pHluorin的膜表面分子会被内吞，荧光信号随后会恢复至基础水平，因此同一探针也可用于监测囊泡的再循环过程9。
尽管囊泡标记的pH传感器可确保仅可视化那些真正与质膜融合的囊泡，但仍需在高空间和时间分辨率下进行成像，以详细描述胞吐/胞吞 过程中所涉及的各个步骤。能够提供必要时空分辨率的光学技术是全内反射荧光显微镜（TIRFM），这是荧光显微镜的一种应用10。
当光线以大于临界角的入射角到达玻璃盖玻片与样品之间的界面时，会发生全内反射。此时，激发光不会透射进入样品，而是被完全反射回去。在这种条件下，界面处会形成一种隐逝光波，并在光学密度较低的介质（即样品）中传播。由于隐逝场的强度随距离界面的增加呈指数衰减（穿透深度约为100 nm），只有紧邻盖玻片的荧光分子能够被激发，而远离界面的荧光分子则不会被激发。在转染了GFP构建体的细胞中，该穿透深度对应于细胞质膜上或靠近质膜的囊泡结构中表达的蛋白质。由于细胞内部的荧光分子无法被激发，背景荧光被极大抑制，从而形成信噪比极高的图像11。
全内反射荧光显微镜（TIRFM）具有多项特性，使其成为监测囊泡动态的首选技术。其极佳的对比度和高信噪比能够检测到来自单个囊泡的极微弱信号。基于芯片的逐帧图像采集提供了检测高度动态过程所需的时间分辨率。最后，该技术使样品中除特定焦平面外的细胞区域几乎不受光照，从而显著降低光毒性，实现长时间的延时成像记录12。
数据分析仍然是该技术最具挑战性且最关键的环节。监测囊泡融合的最简单方法是随时间测量报告荧光蛋白在细胞表面的累积量13。随着融合增加，净荧光信号也随之增强。然而，这种方法可能会低估融合过程，尤其是在大细胞和静息状态下，因为内吞作用和光漂白过程会抵消囊泡外排所引起的荧光强度增加。另一种方法是追踪每一个单独的融合事件14。后一种方法非常灵敏，能够揭示有关融合机制的重要细节。然而，该方法需要人工选择单个事件，因为目前尚无法完全自动化地追踪囊泡并记录其荧光信号的波动。对囊泡动态的观察需要以高频率采样细胞，这会产生大量数据，难以通过人工方式进行分析。
本文旨在优化全内反射荧光显微镜（TIRFM）成像技术，用于监测SH-5YSY神经母细胞瘤细胞系中基础状态及刺激条件下的神经递质释放，并逐步描述实验室建立的分析方法，可在全细胞水平和单囊泡水平上对数据进行分析。
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方案
1. 细胞培养与转染
- SH-SY5Y 细胞培养
注意：实验使用人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞系（ATCC# CRL-2266）进行15SH-SY5Y 细胞以悬浮细胞团和贴壁细胞的混合形式生长。请遵循本方案中所述的指导说明（细胞密度、传代比例， 等等以确保细胞牢固地贴附于玻璃盖片上，这对于全内反射荧光显微镜（TIRFM）至关重要。- 开始前，在超净工作台内配制适量的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）和培养基。
- 配制 50 ml PBS，含 150 mM NaCl、24 mM 磷酸盐缓冲液，pH 7.4。过滤该溶液。
- 使用高糖型 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM），加入 10% 灭活胎牛血清（FBS）、青霉素（100 U/ml）、链霉素（100 µg/ml）、L-谷氨酰胺（2 mM）和丙酮酸钠（1 mM），配制 50 ml 细胞培养基。过滤该溶液。
- 移除完全培养基，用 3 ml PBS 洗涤细胞。
- 将细胞在37 °C、5% CO₂条件下，用2 ml 0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）（适用于6 cm培养皿）孵育5分钟。2 使用移液器吹打使细胞脱落。
- 通过加入 2 ml DMEM 灭活胰蛋白酶，并在 300 × g 离心 5 分钟以收集细胞。
- 弃去上清液，向沉淀中加入1 ml DMEM，充分吹打溶液以将细胞分散成单细胞悬液。
- 以1:4比例将细胞接种至含有3 ml完全培养基的新6 cm直径培养皿中。将细胞维持在6 cm直径培养皿中，于37 °C、5% CO₂培养箱中培养。2 培养箱。每周传代一次，或当细胞覆盖培养皿表面面积达80%–90%时进行传代。
- 开始前，在超净工作台内配制适量的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）和培养基。
- 用于成像的SH-SY5Y细胞接种
- 对于TIRFM实验，将细胞接种到玻璃盖玻片上。使用厚度为0.17 ± 0.005 mm、折射率为1.5255 ± 0.00015的玻璃盖玻片。实验开始前，按以下步骤准备玻璃盖玻片：
- 用90%乙醇清洁玻璃盖玻片，过夜。
- 用蒸馏水彻底冲洗（更换蒸馏水三次）。将玻璃盖片置于干燥箱中干燥。
- 将盖玻片放入玻璃培养皿中，置于预热至200 °C的烘箱内灭菌3小时。
- 转染前一天，将每张盖玻片放入一个3.5 cm的培养皿中，加入1 ml培养基，在37 °C、5% CO₂条件下孵育2 培养箱
- 按照步骤 1.1.3 - 1.1.5 所述进行细胞消化，将细胞沉淀重悬于 1 ml 完全培养基中并计数。计算每块培养皿所需加入的细胞悬液体积，使细胞终浓度为 3 × 10⁵5 细胞/孔。此密度对于细胞的最佳生长和高效转染至关重要。在37 °C、5% CO₂条件下培养。2 过夜孵育
- 对于TIRFM实验，将细胞接种到玻璃盖玻片上。使用厚度为0.17 ± 0.005 mm、折射率为1.5255 ± 0.00015的玻璃盖玻片。实验开始前，按以下步骤准备玻璃盖玻片：
- 使用聚乙烯亚胺（PEI）对SH-SY5Y细胞进行转染
注意：为了可视化突触小泡动态，使用了含有 synapto-pHluorin 的 pCB6 载体。synapto-pHluorin 是通过将绿色荧光蛋白（GFP）的 pH 敏感变体与目标序列框内融合而构建的。16 以及囊泡膜蛋白 synaptobrevin 2。该构建体已被广泛用于研究神经元内突触囊泡的特性9.- 转染开始前，配制以下溶液各10 ml。溶液保存时间最长不超过1个月。
- 配制150 mM NaCl溶液，用0.01 N HCl调节pH至5.5。
- 配制10%聚乙烯亚胺（PEI；25 kDa线性）的150 mM NaCl溶液。溶液pH升至8.8，用0.01 N HCl调节pH至7.8。
- 接种后24小时，吸除培养基，加入1.5 ml完全培养基。将细胞置于37 °C、5% CO₂的培养箱中继续培养。2 培养箱
- 在超净工作台内，向1.5 ml离心管中每3.5 cm培养皿加入3 µg质粒DNA、25 μl 150 mM NaCl溶液和100 μl PEI溶液。
- 涡旋10秒，然后将DNA/PEI混合物在室温下孵育30分钟。
- 将DNA/PEI混合物小心加入含有细胞盖玻片的培养皿中，轻轻摇动，使试剂在培养皿中均匀分布。
- 4小时后更换培养基，将细胞在37 °C、5% CO₂条件下过夜培养2 培养箱。转染后24–48小时进行成像实验。
- 转染开始前，配制以下溶液各10 ml。溶液保存时间最长不超过1个月。
2. 全内反射荧光显微镜（TIRFM）进行细胞成像
- 成像装置设置
- 使用上述设置进行TIRF成像 图1. 它包含一台电动倒置显微镜（图1，插图 A），激光源（图1，插图 B）和 TIRF 滑块（图1，插图C）。通过高数值孔径（NA 1.45 Alpha Plan-Fluar）100倍油浸物镜实现全内反射荧光显微镜（TIRFM）照明。
- 对于TIRFM照明，使用多谱线（458/488/514 nm）100 mW氩离子激光器。通过单模光纤将线偏振激光引入光路，经由TIRF滑块导入。将TIRF滑块插入反射光路的视场光阑平面。
- 对于宽场照明，将显微镜连接至传统的汞短弧灯HBO白光光源。滑块中的保偏双棱镜可确保TIRF照明与白光照明同时组合。
- 使用安装在滤光轮上的激发滤光片（带宽 488/10 nm）对激光进行过滤，并将其引入激光光路。采用由软件控制的高速快门，以实现对激光照射的快速调控。进行 pHluorin 分析时，安装带通发射滤光片（525/50 nm）。使用 Image ProPlus 软件在冷却的快速 CCD 相机上采集数字图像（512 × 512 像素）。
- 实现全内反射荧光照明（图2）
- 打开激光器、计算机、相机、滤光轮和快门控制器，然后等待 20 分钟再开始实验，因为激光器需要预热并稳定。
- 成像前，配制适量的以下溶液。
- 配制 50 ml Krebs (KRH) 溶液，含 125 mM NaCl、5 mM KCl、1.2 mM MgSO₄、1.2 mM KH2PO4，25 mM 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）（缓冲至pH 7.4），2 mM CaCl2，以及 6 mM 葡萄糖。
- 配制 10 ml KCl-KRH 溶液（pH 7.4），含 80 mM NaCl、50 mM KCl、1.2 mM MgSO₄、1.2 mM KH2PO4，25 mM HEPES（用 HCl 调至 pH 7.4），2 mM CaCl₂2，以及 6 mM 葡萄糖。
- 移除含有转染细胞的玻璃盖玻片，并将其放入相应的成像腔室中。组装腔室，然后在玻璃盖玻片中央加入500 µl KRH溶液。
- 在物镜上滴加镜油。将成像腔室置于显微镜载物台上，并将物镜对准玻璃盖玻片下方。将安全罩放置在样品上方。
- 在落射荧光模式下，聚焦于盖玻片（上表面），选择位于腔室中央的转染细胞。选取那些使用低于80毫秒曝光时间即可清晰记录荧光信号的细胞。
- 在软件控制下，切换至全内反射荧光（TIRF）照明模式 在活体中 模式。
- 设置TIRF配置时，检查从物镜射出的光束在样品盖片上的位置（图2B）。当光束位于物镜中心时（图2A，左侧），在TIRF样品盖玻片中心可见一个斑点（图2B，左侧）并在落射荧光模式下对细胞成像（多个焦平面，背景荧光较强； 图2C，左侧。
- 为达到临界角，将聚焦光斑沿 Y 方向（向前或向后）移动； 图2B，中心) 使用TIRF滑块上的角度调节螺丝（图1C）。当光束以大于临界角的角度会聚到样品平面时（图2A，右侧），该斑点消失，在样品盖中央出现一条笔直、细窄且聚焦清晰的线图2B，右侧。
- 为优化TIRF角度，请使用细胞样品（图 2C）。在视频中观察荧光图像，此阶段仍可见类似落射荧光的图像。轻轻调节螺丝，直至达到全内反射荧光（TIRF）条件：仅细胞的一个光学层面处于焦点中即， 与盖玻片接触的质膜），这将产生一张高对比度的平面图像（图2C，右侧。
- 样本成像
- 设置单通道延时成像实验。为尽量减少光漂白，应使用较短的曝光时间和较高的增益来采集图像。合适的曝光时间范围为40–80毫秒。以1–2 Hz的采样频率采集图像。若需更清晰地观察囊泡动力学，建议采用更高频率（10 Hz）进行采样。通常的观察时间为2分钟。
- 加入500 µl KRH溶液，以TIRFM模式记录细胞，此为静息状态。保存时间序列图像。
- 在相同细胞上保持静息状态的相同条件下（激光功率、曝光时间、帧数）进行记录。采集五帧图像后，加入 500 µl KCl-KRH 溶液，并使 KCl 保留在腔室中。此为刺激条件；保存时间序列图像。
3. 图像分析与数据处理
注意：为了分析图像，本实验室基于图像分析软件的现有功能开发了宏；类似的宏可在线获取（材料与设备表中提供了网址）。
- 荧光强度定量分析
- 使用“序列荧光强度”宏命令对视频中图像感兴趣区域（ROI）的荧光强度进行定量分析。
- 打开时间序列图像。进入宏菜单，选择“序列荧光强度”。在“分析”窗口中会出现“选择感兴趣区域（ROI）”提示。
- 在菜单中选择一种选择工具以创建感兴趣区域（ROI）。在细胞膜无斑点的区域放置3个ROI（背景ROI）。使用此“背景ROI”评估光漂白，并为融合事件分析设定阈值。图3A).
- 光漂白校正与阈值确定（图3B）
- 为了评估光漂白，打开荧光强度行中的“背景 ROI”。图 3Ba）。将每帧中的荧光强度值归一化为初始强度值（F0）（F/F0）（图 3Bb取平均值。
- 突出显示平均数据，并使用图表菜单选项创建折线图。
- 从数据分析菜单中选择“趋势线”以打开图表分析对话框。选择回归类型，设置为“指数”回归，然后选择“在图表上显示方程”。在图形窗口中将显示指数方程，参数值将自动赋值，图 3Bc).
- 对每帧中的强度值应用指数校正，方法如下：
Fn（校正后）= Fn / exp(-n * a)
Fn = 第n帧测得的实验荧光强度；n = 帧数；a = 漂白因子（表示漂白程度的常数） 由于光漂白导致的强度衰减速率； 图 3Bd). - 为设定阈值，打开一个经过归一化和校正的“背景ROI”，计算其平均荧光信号及其标准差（SD）。平均值加3倍标准差即为阈值图3Be）。将此阈值用于数据分析。
- 使用半自动程序筛选融合事件
- 使用图像分析软件打开时间序列图像。对活动的图像序列应用高斯滤波器。
- 使用“计数对象”工具或宏程序分析图像，该工具或宏程序可选择像素平均荧光强度处于特定范围内的对象。通过阈值功能手动设置强度范围（进入菜单栏，选择“测量”→“阈值”，以高亮显示感兴趣区域）。合适的阈值应设定为局部荧光背景信号的30%以上。
- 应用“筛选对象”宏，仅选择符合以下条件的对象：
- 应用“长宽比”选项（包含最小值和最大值）。长宽比（Aspect）表示与对象等效的椭圆的长轴与短轴之比。长宽比始终 ≥1。建议取值范围为最小值 = 1，最大值 = 3。
- 应用直径范围。 直径表示在两个度数间隔处测量的、连接两个轮廓点并穿过物体中心点的直径长度的平均值。请以像素（或使用校准系统时以 µm）为单位设置范围。
- 在初步实验中确定最佳范围：手动选择感兴趣区域的斑点，然后使用轮廓分析功能测量其直径。
- 选择“显示对象”：所选对象将叠加显示在TIRFM图像上图4B).
- 仅分析显示荧光强度短暂增加（持续一至三帧）随即出现明显信号丢失的斑点（瞬时斑点）。使用圆形选区工具，在选定的囊泡/斑点周围径向创建直径约等于一个斑点大小的感兴趣区域（实验用感兴趣区域）。此步骤需手动完成。
- 选定 ROI 后，计算每个 ROI 在整个视频过程中的平均荧光强度。
- 数据分析（图3C-D）
- 将每个“实验感兴趣区域”中测得的荧光变化的时间过程导出至电子表格；(图 3Da）。将每帧中的强度值归一化为初始荧光强度（F/F0），（图 3Db).
- 根据步骤 3.2.4 中报告的方法，对每帧中的强度值应用指数校正图 3Dc).
- 为计算融合事件的总数（峰数量）、每次融合发生的时间（峰宽度）以及荧光峰的幅度（峰高和曲线下面积，AUC），可使用电子表格或数学软件包中的逻辑函数。文献中已有采用逻辑公式进行融合事件分析的示例。 图3Dd和3De.
- 将荧光强度增加超过阈值（平均背景荧光强度 ± 3倍标准差）视为囊泡与质膜的融合，并将由此产生的峰值视为一次融合事件。
- 将每个峰的最后一个x值与第一个x值之差计算为峰宽，再将该值乘以1/（采样频率）。将此结果视为囊泡在质膜上融合与黏附的时间，即囊泡再酸化与循环之前的时间图 3Dd).
- 将超过阈值的所有数值相加，计算全细胞AUC。将该值视为记录时间内由于自发（静息）或诱发（刺激引起）突触活动导致的净荧光变化。
- 将峰高计算为每个峰的最大 y 值与阈值之间的差值。将该值视为融合类型（单个）的指示性参数 与 同时/顺序融合或瞬时转染 与 完全融合
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结果
所述的全内反射荧光（TIRF）成像与数据分析方法旨在研究细胞系统中囊泡的动力学行为。该技术可用于评估信号分子和药物对融合事件及神经递质囊泡动态的影响17。通过使用GFP标记的质膜蛋白，TIRF显微技术已被用于表征胶质细胞和上皮细胞中GFP标记的谷氨酸转运蛋白的组成型运输过程18,19。
为了验证所报道的成像方法和数据分析策略，分别在基础状态和刺激条件下（钾诱导去极化），记录转染了突触-pHluorin的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中的融合事件（视频 1、2）。进行了两种不同的分析：全细胞分析（图 4）和单囊泡分析（图 5）。
全细胞分析用于测量细胞中融合事件的总数以及刺激诱导的净荧光变化。图4展示了在静息状态和刺激条件下（KCl刺激），使用相同实验方案（曝光时间、激光功率等）记录转染了synapto-pHluorin的细胞的结果。图...
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讨论
本文介绍了一种利用荧光cDNA编码载体和全内反射荧光显微镜（TIRFM）对分泌细胞中囊泡动态进行成像与分析的实验方案。TIRFM成功成像的关键要素包括细胞模型的选择，以及使用基因编码的囊泡释放与循环光学探针对细胞进行转染。
全内反射荧光显微镜（TIRFM）非常适合用于观察贴附在玻璃盖玻片上生长且形态足够扁平的细胞，从而能够稳定地可视化细胞膜及膜融合事件。理想情况下，囊泡应在细胞内分散分布，以便在单个囊泡水平上对它们的运输、融合和内吞过程进行成像和定量分析。然而，神经元并不满足这些条件：其形态不规则，神经突经常相互交叉，且囊泡融合主要集中在少数特定区域（即活性区）。因此，在原代培养的神经元中，利用TIRFM研究这些区域的囊泡动态极为困难。
我们首次证明，通过全内反射荧光显微镜（TIRFM）技术，SH-SY5Y 人神经母细胞瘤细胞系可作为研究静息和刺激条件下神经递质释放的有价值的替代模型。该细胞系具有神经元表型，包括细胞体和细长的突起，含有合成神经递质所需的酶、突触结构相关蛋白以及受调控的分泌机制。此外，在视黄酸、佛波酯和二丁酰环...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢米兰大学为Eliana Di Cairano（博士后奖学金）和Stefania Moretti（博士奖学金）提供的支持。本工作得到了C.P.主持的大学科研项目PUR的资助。
我们感谢英国布里斯托大学生物化学学院的 Jeremy M. Henley 教授提供 pHluorin 载体，感谢 Dotti Francesco 博士在数据分析方面的帮助，以及 Silvia Marsicano 提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 仪器设备 | |||
| Axio Observer Z1 |  Zeiss | 491912-9850-000 | 倒置显微镜 |
| 多线氩离子激光器 Lasos 77 | Lasos | 00000-1312-752 | 多线（458/488/514 nm），100 mW 氩离子激光器 |
| 激光TIRF滑块 | 蔡司 | 423681-9901-000 | |
| 100倍物镜 | 蔡司 | 421190-9900-000 | 油，NA 1.45 Alpha-Plan |
| CCD相机 RetigaSRV 快速1394 | QImaging | ||
| LAMBDA 10-3 智能快门光学滤光片切换器 | Sutter Instrument Company | ||
| 软件 | |||
| Image ProPlus 6.3 软件 | Media Cybernetics | 斑点选择，感兴趣区域选择，荧光强度测定 | |
| Excel | Microsoft | 光漂白校正，全细胞与单囊泡分析 | |
| GraphPad Prism 4.00 | GraphPad Software, Inc. | 统计分析 |
参考文献
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