本研究建立了一种用于未来临床前治疗测试的离体灌流牛视网膜标准化应激模型。评估了缺氧（纯N2）或谷氨酸应激（250 µM谷氨酸）对视网膜功能的影响，视网膜功能以a波和b波振幅表示。
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摘要
摘要
在过去的几十年中，神经保护一直是眼科研究的重要研究领域，涉及青光眼、视网膜血管阻塞、视网膜脱离和糖尿病视网膜病变等疾病。本研究旨在建立一种标准化的应激模型，用于未来的临床前治疗测试。
制备牛视网膜并用饱和氧的标准溶液灌流，记录视网膜电图（ERG）。在记录到稳定的b波后，施加缺氧（纯N2）或谷氨酸应激（250 µm谷氨酸）处理45分钟。为单独研究光感受器功能的影响，加入1 mM天冬氨酸以获取a波。随后监测ERG恢复情况，持续75分钟。
在缺氧条件下，曝光45分钟后a波振幅下降了87.0%（p <0.01，洗脱结束时振幅下降36.5%，p = 0.03）。此外，b波振幅初始下降了87.23%，具有统计学意义（p <0.01），洗脱结束时下降25.5%（p = 0.03）。
对于250 µm谷氨酸，a波振幅最初减少了7.8%（p >0.05），随后减少1.9%（p >0.05）。b波振幅减少了83.7%（p <0.01）；经过75分钟的洗脱后，减少幅度为2.3%（p = 0.62）。本研究提出了一种标准化的应激模型，未来可能有助于识别潜在的神经保护作用。
引言
在过去的几十年中，神经保护一直是眼科研究的重要研究领域。视网膜是一个高度敏感的神经元网络，其功能在很大程度上依赖于氧供，并受到周围细胞代谢的显著影响。与神经细胞损伤相关的主要眼病包括视网膜血管阻塞、青光眼和视网膜脱离。
视网膜动脉阻塞是视网膜血管阻塞的一种典型情况，由于视网膜内层缺氧，可导致突发性视力丧失1。该病常与全身性血管病变相关2，并导致持续性视力损害1，仅有8%的患者视力可显著恢复1。尽管动脉内溶栓曾被提议作为治疗选择，但在一项随机临床试验中未能证实其疗效3。
青光眼和视网膜脱离均伴有谷氨酸浓度升高4-6。在生理条件下，谷氨酸作为兴奋性递质广泛存在于整个中枢神经系统及内层视网膜中7,8。不仅在青光眼 和视网膜脱离5,6中发现谷氨酸水平升高，在增殖性糖尿病视网膜病变中也观察到类似现象9。谷氨酸水平升高可能引发兴奋性毒性，从而导致神经细胞损伤10。在大多数视网膜脱离病例以及部分增殖性糖尿病视网膜病变患者中，需进行视网膜手术（睫状体平坦部玻璃体切除术）。在施行睫状体平坦部玻璃体切除术过程中，机械操作、光纤强光照射，以及长时间手术期间灌注液高流速所产生的剪切应力，均会对视网膜造成额外损伤11,12。
上述所有疾病均具有一个共同点，即其病理变化局限于视网膜本身，这给眼科领域带来了保护视网膜这一神经感觉系统的挑战。
视网膜电图（ERG）是评估视网膜功能的标准方法 体内 光感受器功能（a波）和内层视网膜功能（b波）。视网膜电图（ERG）通过将银电极插入角膜进行测量，眼睛接受逐渐增强的光照刺激，以检测视杆细胞、视锥细胞或内层视网膜的功能异常。视网膜的不同病变可通过ERG反应的振幅（反应强度）或潜伏期（反应时间间隔）的变化来识别。采用不同的ERG方案和测量方法（图形ERG、多焦ERG或明亮视野ERG）可进一步区分各类功能缺陷。近年来引入的离体视网膜技术，使得在排除其他干扰因素的情况下评估视网膜效应成为可能。 例如 实验动物的一般反应13,14.
本研究旨在评估并建立一种针对灌流离体视网膜的缺氧和谷氨酸应激的明确且标准化的应激模型。因此，我们希望为今后研究某些药物或眼内灌注溶液的神经保护作用奠定基础。
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方案
1. 牛眼的准备
- 在动物屠宰后立即获取牛眼。
- 将保护好的眼球置于“Sickel溶液”中运输，该特殊培养基含有 120 mM NaCl、2 mM KCl、0.1 mM MgCl2、0.15 mM CaCl2、1.5 mM NaH2PO4、13.5 mM Na2HPO4 和 5 mM 葡萄糖，于室温下保存。
- 在暗适应条件下，使用微弱红光进行视网膜的制备。
- 移除眼球的前部结构。在距角膜缘约 4 mm 的赤道部做环形切口，随后整体移除角膜、虹膜、睫状体和晶状体。将视网膜保留在 Sickel 溶液中。
- 机械性松解玻璃体与视网膜表面的附着，并从开放的眼杯中移除玻璃体。
- 随后将眼球分为四个象限，使用环钻 punch 出直径约 7 mm 的圆形区域。
- 轻柔地将视网膜从色素上皮层分离，并将其放置于避光盒内的记录装置上。记录装置由一个中央带有网格的塑料固定器组成；将视网膜置于网格上，然后用塑料环直接固定在电极上。
注意：塑料固定器具有两个通道，以允许培养基持续流动。
2. 记录视网膜电图（ERG）
- 为记录视网膜电图，使用两个银/氯化银电极置于视网膜两侧，并以约 1 ml/min 的恒定灌注速度和 37 °C 的恒定温度对视网膜进行灌注。使用经氧气饱和的“Sickel 溶液”。
- 开始测量前，使视网膜暗适应（在所有测量过程中避免光照），并采用五分钟的刺激间隔。以视网膜表面光强设定为 6.3 mlx 的 1 Hz 单次白色氙灯闪光作为刺激光源。
- 使用经校准的中性密度滤光片，并通过定时器控制 10 µsec 的光刺激，以获得最佳反应。
- 为测量和处理数据，使用 Grass RPS312RM 放大器对视网膜电图信号进行滤波和放大（100 Hz 高通滤波器，50 Hz 陷波滤波器，放大倍数 100,000 倍）。尽量滤除可能干扰信号的干扰频率。为处理数据，使用台式计算机（PC 兼容）上的模数转换数据采集板。
- 在恒定灌注条件下完成暗适应后，持续测量电信号的振幅，直至记录到稳定的 b 波振幅。
注：若连续五次单次测量结果的平均值偏差小于 10%，则认为振幅已稳定。单次测量的典型示例见图 1。 - 开始测试时，将纯氧替换为纯氮（单次实验次数 n = 5）以检测缺氧效应，或替换为 250 µm 谷氨酸（n = 5）。
- 每 5 分钟记录一次电反应，持续 45 分钟。
- 测试期结束后，用经氧气饱和的标准培养液对视网膜灌注 75 分钟，观察 b 波振幅的变化。此阶段为洗脱期。b 波振幅的测量从 a 波波谷至 b 波峰值。
- 为研究缺氧或谷氨酸在暗视条件下对光感受器电位的影响，可在营养液中添加 1 mM 天冬氨酸以抑制 b 波。
- 在记录 30 分钟稳定的光感受器电位后，按前述步骤操作，将视网膜暴露于含 1 mM 天冬氨酸的不同灌流溶液中 45 分钟。洗脱期采用与前述相同的方案（步骤 2.8）。
3. 数据分析
- 为进行统计学评估数据，需确保所有数据符合正态分布，例如使用 Kolmogorov-Smirnov 检验15。
- 计算曝光阶段后 a 波和 b 波振幅相对于曝光前最后一次测量值的百分比下降幅度。将曝光 45 分钟结束时的视网膜电图（ERG）振幅下降情况与给药前测得的 ERG 进行比较。
- 将冲洗阶段结束时的 a 波和 b 波与曝光前相应的振幅进行比较，以评估可能的恢复情况。
- 进行统计分析时，使用 JMP 统计软件或 SPSS 软件。所有数据均以均值 ± 标准差表示。采用适当的统计学方法评估显著性。
注意：所用统计方法可能因实验范围不同而异。在本实验条件下，采用 Student 配对 t 检验。
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结果
视网膜制备物以氧饱和的标准溶液灌流1小时后（图1A 和 图1B），ERG波幅表现出稳定化，且单次测量之间的波幅变异减小。除缺氧测试外，所有实验均保持pH、渗透压、温度和pO2恒定。
为了分离出感光细胞信号与内层视网膜信号，向标准溶液中加入1 mM的天冬氨酸以抑制b波（图1A）。在测试缺氧效应时，经过45分钟暴露后，观察到a波振幅下降了87.0%（p <0.01）。在冲洗结束时，a波振幅仍下降了36.5%，差异具有统计学意义（p = 0.03，图2A）。此外，b波振幅初始下降了87.23%，同样具有统计学显著性（p <0.01）。在此条件下，冲洗结束后b波振幅仍减少了25.5%，差异具有统计学意义（p = 0.03，图2B）。
暴露于250 µm谷氨酸后，在规定的时间间隔后检测到a波振幅非显著性降低7.8%（p >0.05），随后出现1.9%的非显著性降低（p >0.05，图3A）。单次测量结果见表1
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讨论
本研究发现，缺氧45分钟后b波振幅受到显著影响。在洗脱阶段后，这种降低仍然具有显著性。光感受器电位也观察到类似效应。
结果得到了其他已发表数据16的支持，使我们有机会研究缺氧后可能的神经保护作用。
在250 µM谷氨酸作用45分钟后，我们仅发现b波振幅出现具有统计学意义的影响，且该影响在洗脱期结束时完全可逆。250 µM谷氨酸对光感受器电位无影响。只有内层视网膜受缺氧影响这一事实表明，这些变化非常细微，因此我们拥有一个极为敏感且标准化的指标，可用于评估可能的神经保护作用。天冬氨酸特异性抑制光感受器向水平细胞或双极细胞的信号传递，从而抑制b波。
这一发现与 Green D.G. 和 Kapousta-Bruneau N.V. 的研究结果相反，他们发现，当谷氨酸浓度为 250 和 500 mM 时，与仅使用培养基相比，其 b 波记录随时间更加稳定17。为解释这一矛盾，需考虑实验条件的若干差异：本模型使用的是 Sickel 溶液，而另...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本文献给我亲爱的妻子 Maren 和我们的小 Karl。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 120 mM NaCl | Merck Pharma, Germany | 1,064,041,000 | |
| 2 mM KCl, | Merck Pharma, Germany | 1,050,010,250 | |
| 0.1 mM MgCl2, | Merck Pharma, Germany | 58,330,250 | |
| 0.15 mM CaCl2 | Merck Pharma, Germany | 111 TA106282 | |
| 1.5 mM NaH2PO4/13.5 mM Na2HPO4 | Merck Pharma, Germany | 1,065,860,500 | |
| 5 mM 葡萄糖 | Merck Pharma, Germany | 40,741,000 |
参考文献
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重印与许可
