展示了两种脱水-再水化方法——电形成法和凝胶辅助溶胀法，将跨膜蛋白KvAP重组到巨大单层囊泡（GUVs）中的过程。在这两种方法中，含有该蛋白的小区单层囊泡融合形成GUVs，随后可通过荧光显微镜和膜片钳电生理技术进行研究。
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本文内容
摘要
摘要
巨大单层囊泡（GUVs）是研究膜相关现象的一种常用仿生系统。然而，为了形成含有功能性跨膜蛋白的 GUVs，通常使用的 GUVs 制备方案必须经过修改。本文介绍了两种脱水-再水化方法——电场成形法和凝胶辅助膨胀法，用于制备含有电压门控钾离子通道 KvAP 的 GUVs。在这两种方法中，先将含有蛋白质的小单层囊泡溶液部分脱水，形成膜堆叠，再使其在再水化缓冲液中膨胀。在电场成形法中，将膜沉积在铂电极上，以便在膜再水化过程中施加交流电场。相比之下，凝胶辅助膨胀法则使用琼脂糖凝胶基底以促进膜的再水化。这两种方法均可在低盐（例如，5 mM）和生理盐浓度（例如，100 mM）条件下生成 GUVs。所获得的 GUVs 通过荧光显微镜进行表征，并采用内面向外式膜片钳构型测量重组通道的功能。尽管在交变电场存在下膨胀（即电场成形）可获得较高产量的无缺陷 GUVs，但凝胶辅助膨胀法能实现更均一的蛋白质分布，且无需特殊设备。
引言
在研究支配生命系统的物理原理时，自下而上的方法使实验者能够控制系统的组分及其他参数，而这些参数在基于细胞的系统中通常难以操控1。对于基于膜的过程，巨大单层囊泡（Giant Unilamellar Vesicles, GUVs，直径约 1–100 µm）已被证明是一种非常有用的生物模拟系统2–7，因其非常适合显微镜观察和微操作8–10。尽管存在多种不同的GUV制备方案，但大多数方法可分为两类：基于乳液的方法11,12和基于脂质膜再水化的方法13–16。在基于乳液的方法中，GUV膜的内层和外层通过在水/油界面处的脂单层逐步组装而成。该方法非常适合在GUV内部包封可溶性蛋白质，以及构建具有不对称脂双层组成的GUV。然而，由乳液法制备的GUV可能残留溶剂痕迹，从而改变膜的力学性质17，且该方法在跨膜蛋白的重构方面并不十分理想。
薄膜再水化方法基于以下事实：干燥（脱水）会导致许多脂质混合物形成多层膜堆叠。若将此膜堆与水性缓冲液接触，溶剂会渗入膜堆内部及表面，使膜堆中的各层膜相互分离，并在表面处形成单个脱离的巨型脂质体（GUVs）13,18（同时也会产生大量其他类型的脂质结构）。然而，即使在最优的缓冲液和脂....
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方案
1. 溶液配制
- 配制5 ml含有5 mM KCl、1 mM HEPES（pH 7.4）或TRIS（pH 7.5）以及2 mM海藻糖的“SUV缓冲液”。使用0.2 µm注射器滤器过滤该缓冲液，并分装为1 ml等份，可于-20 °C保存。
注意：试剂和仪器的更多详细信息见材料清单。 - 配制40 ml GUV“生长缓冲液”，用于在脂质膜再水化过程中填充GUV内部。对于“低盐”生长条件，将5 mM KCl、1 mM HEPES（pH 7.4）或1 mM TRIS（pH 7.5）以及约400 mM蔗糖混合；对于“生理盐浓度”生长条件，将100 mM KCl、5 mM HEPES（pH 7.4）或5 mM TRIS（pH 7.5）以及约200 mM蔗糖混合。
- 通过混合100 mM KCl、5 mM HEPES（pH 7.4）或5 mM TRIS（pH 7.5）以及约200 mM葡萄糖，配制40 ml用于实验腔室外部溶液的“观察缓冲液”。
注意：这些缓冲液仅为示例。请参见讨论部分以调整适用于其他实验的缓冲液。 - 使用渗透压计测量生长缓冲液和观察缓冲液的渗透压。加入蔗糖或葡萄糖颗粒，使两者的渗透压差异控制在1%以内，以防止GUV从生长腔室转移至观察腔室时发生破裂或塌陷。
注意：在此浓度范围内，每添加1 mM蔗糖（40 ml中加入13.7 mg）或葡萄糖（40 ml中加入7.2 mg），渗透压约增加1 mOsm。
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结果
可通过显微镜下观察生长室快速评估 GUV 的生长情况。在电场成形过程中，GUV 通常沿铂丝成簇生长，如图 4所示。在凝胶辅助溶胀过程中，GUV 呈现为迅速生长并相互融合的球形结构（图 5）。
无缺陷的GUV在转移至观察室后更容易被识别和评估。需要进行校准测量以严格评估GUV的质量，此前已有系统性定量方法发表。28。然而，作为经验性参考，“良好”的GUV应为分离的（即， 不呈簇状，具有单一、光滑、球形的外膜，不含任何内部结构即， 管状结构，嵌套囊泡 等等。）内部，且具有“标准”脂质荧光水平（较亮的物体通常为双层或多层结构）。 图6 显示转移至等渗葡萄糖溶液后一个“无缺陷”GUV的微分干涉相差（DIC）和落射荧光图像。DIC中的对比度源于充满蔗糖的GUV与含葡萄糖的浴液之间光学密度的差异。尽管KvAP本身不应通透蔗糖或葡萄糖，但含KvAP的GUV的折射率对比度常随时间推移而降低。GUV膜中均匀的蛋白质荧光证实K.......
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讨论
仿生模型系统是研究蛋白质与膜的性质及其相互作用的重要工具。与BLM或支撑脂质膜等其他重建系统相比，基于GUV的系统具有多项优势，包括对膜的组成、张力和几何形态具有较强的可控性，且真正实现了无油环境。然而，将KvAP等跨膜蛋白整合到GUV中，需要对仅含脂质的GUV常规制备方法进行重大改进。本文所介绍的电形成方法此前已被表征，并用于研究膜蛋白在曲面膜上分布与动态的生物物理原理2,4,35。本研究展示了一种新的凝胶辅助溶胀法，进一步丰富了GUV中蛋白重建的方法体系。这两种方法均可制备出无缺陷且含有高密度KvAP的GUV，内面向外膜片的测量结果证实，这些GUV中包含功能性的、具有钾离子选择性和电压依赖性的离子通道。
这两种方法各有优缺点。当可以使用低盐条件时，电致形成法在大单层囊泡（GUV）产率和蛋白质密度均一性之间提供了良好的折中方案。尽管在生理盐浓度下电致形成法仍能获得较为合理的产率，但不同GUV之间的蛋白质密度差异可能很大（见图8和图11）。这种密度差异似乎与电致形成持续时间有关，因为即使在低盐.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢 Susanne Fenz 讨论了通过琼脂糖溶胀法重建蛋白质的可能性，感谢 Feng Ching Tsai 进行电流测量，以及 Bassereau 课题组现任和前任成员提供的支持与帮助。本项目由法国国家科研署（项目编号 BLAN-0057-01）、欧洲委员会（NoE SoftComp 项目）、巴黎第六大学（FED21“复杂系统动力学”项目资助）提供经费支持。M.G. 获得了居里研究所国际博士奖学金的支持，S.A. 获得了法国医学研究基金会奖学金的支持，G.E.S.T. 获得了欧洲委员会玛丽·居里引进国际奖学金以及巴黎第六大学资助项目的支持。出版费用由“CelTisPhyBio”实验室卓越计划（ANR-11-LABX0038）承担。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DPhPC（1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱） | Avanti Polar Lipids | 850356P | |
| 卵磷脂 L-α-磷脂酰胆碱（鸡蛋，鸡源） | Avanti Polar Lipids | 840051P | |
| 卵磷脂 L-α-磷脂酸（鸡蛋，鸡源） | Avanti Polar Lipids | 840101P | |
| 18:1 (Δ9-顺式) PC（DOPC）1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱 | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
| 胆固醇（绵羊毛来源，>98%） | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
| TRed-DHPE | Invirtogen | T-1395MP | 标记脂质 |
| BPTR-神经酰胺 | Invirtogen | D-7540 | 标记脂质 |
| 氯仿 | VWR | 22711.290 | AnalaR Normapur |
| 丙酮 | VWR | 20066.296 | AnalaR Normapur |
| 乙醇 | VWR | 20821.330 | AnalaR Normapur |
| Kimwipe | Kimtech | 7552 | |
| Hamilton 注射器 | Hamilton Bonaduz AG | 多种规格 | |
| 棕色小瓶和聚四氟乙烯杯 | Sigma | SU860083 和 SU860076 | |
| Parafilm | VWR | 291-1214 | |
| 微量离心管 | Eppendorf | 多种规格 | |
| 琼脂糖 | Euromex | LM3（1670-B，Tg 25.7°C，Tm 64°C） | |
| 蔗糖 | Sigma | 84097-1kg | |
| 葡萄糖 | Sigma | G8270-1kg | |
| 海藻糖 | Sigma | T9531-25G | |
| KCl | Sigma | P9333-1kg | |
| HEPES | Sigma | H3375-100G | |
| TRIS | Euromex | EU0011-A | |
| 渗透压仪 | Wescor | Vapro | |
| pH 计 | Schott instruments | Lab850 | |
| 超声破碎仪 | Elmasonic | S 180 H | |
| 0.2 µm 注射器滤器 | Sartorius steim | Minisart 16532 | |
| 函数发生器 | TTi | TG315 | |
| 铂丝 | Goodfellow | LS413074 | 纯度 99.99+%，直径 = 0.5 mm |
| 聚四氟乙烯 | Goodfellow | ||
| 道康宁“高真空润滑脂” | VWR | 1597418 | |
| 密封膏 | Vitrex medical A/S, 丹麦 | REF 140014 | Sigillum Wax |
| 盖玻片 22 × 40 mm，No1.5 | VWR | 631-0136 | |
| 盖玻片 22 × 22 mm，No1.5 | VWR | 631-0125 | |
| 等离子清洗仪 | Harrick | PDC-32G | 空气等离子，设置为“高” |
| 培养皿 | Falcon BD | REF 353001 | 3.5 cm × 1 cm |
| 膜片钳放大器 | Axon instruments | Multiclamp700B | |
| 数据采集卡 | National Instruments | PCI-6221 | |
| Labview | National Instruments | 版本 8.6 | |
| 玻璃移液管，硼硅酸盐，外径 1 mm，内径 0.58 mm | Harvard Apparatus | GC100-15 | |
| 电极夹持器 | Warner Instruments | Q45W-T10P | |
| 微操纵器 | Sutter | MP-285 | |
| 移液管拉制仪 | Sutter | P-2000 | |
| 相机 | ProSilica | GC1380 | |
| 蔡司显微镜 | Zeiss | Axiovert 135 | |
| 物镜 | Zeiss | 40X 长工作距离，相差 | |
| 物镜 | Zeiss | 100X Plan-Apochromat NA 1.3 | |
| GFP 滤光片组（用于 Alexa-488） | Horiba | XF100-3 | |
| Cy3 滤光片组（用于 TexasRed） | Horiba | XF101-2 | |
| β-酪蛋白 | Sigma | C6905-1G | |
| 共聚焦显微镜 | Nikon Eclipse TE 2000-E | D-Eclipse C1 共聚焦头 | |
| 物镜 | Nikon | Plan Fluor 100X NA 1.3 | |
| Matlab | Mathworks | 用于图像处理和电流轨迹分析 |
参考文献
- Schwille, P. Bottom-Up Synthetic Biology: Engineering in a Tinkerer’s World. Science. 333 (6047), 1252-1254 (2011).
- Aimon, S., et al. Membrane Shape Modulates Transmembrane Protein Distribution. Developmental Cell. 28 (2), 212-218 (2014).
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