细胞适应应激的能力对其存活至关重要。mRNA 翻译的调控即为一种此类适应策略，可实现对蛋白质组的快速调控。本文提供了一种标准化的多聚体分析流程，用于鉴定在应激条件下被选择性翻译的特定 mRNA。
本文内容
摘要
摘要
蛋白质合成的调控是细胞应激反应中的关键控制环节。特别是，已发现特定的RNA调控元件能够实现特定mRNA的选择性翻译，这些mRNA通常编码应对特定应激反应所需的蛋白质。识别这类mRNA以及表征介导选择性翻译的调控机制，长期以来一直是分子生物学研究的前沿课题。多核糖体分析（polysome profiling）是这些研究中的核心技术。多核糖体分析的目标是通过固定正在不同转录本上活跃翻译的核糖体，并在蔗糖梯度中利用超速离心分离由此形成的多核糖体，从而实现对高效翻译与低效翻译转录本的区分。随后可利用传统的生物化学与分子生物学方法对这些转录本作进一步表征。尤为重要的是，将多核糖体分析与高通量基因组学方法相结合，可实现对翻译调控的大规模分析。
引言
蛋白质合成（翻译）的调控是一个关键的细胞过程，与细胞存活密切相关。鉴于翻译消耗了细胞超过50%的能量，其受到严格调控且翻译过程的扰动难以被细胞耐受，这一点并不令人意外。相反，许多异常的细胞过程则需要翻译机制和翻译输出的改变以维持其功能。即 蛋白质组）需要被修饰。这种情况在多种应激反应和疾病状态下经常出现，癌症可能是其中最典型的例子。转录调控的一个关键优势在于细胞能够对外部和内部的各种刺激迅速重新编程其蛋白质表达输出，从而形成一种精细的调控机制，决定细胞存活与死亡之间的平衡1.
转录调控的两个方面尤为引人关注：一是理解介导特异性翻译的调控机制及控制元件的本质，二是鉴定参与细胞对最初引发选择性翻译的特定刺激产生应答的特定mRNA及其编码的蛋白质产物。多聚核糖体分析技术可有效用于研究这两个过程。
多核糖体分析技术的总体目标是研究并量化特定mRNA在不同细胞条件下的翻译状态。该技术的原理是通过“冻结”正在不同转录本上活跃翻译的核糖体，从而捕获mRNA的翻译过程，并在蔗糖梯度中通过超速离心分离由此形成的多核糖体，进而区分高度翻译的转录本（结合多个核糖体）与低效翻译的转录本（结合一个或两个核糖体）。在本实验方案中，使用抗生素环己酰亚胺，该抗生素可结合60S核糖体亚基，并阻止去乙酰化tRNA从核糖体E位点释放2，从而抑制核糖体的移位，使核糖体停滞在正在翻译的mRNA上。然而，也可使用其他阻断剂，例如同样可抑制翻译延伸的emetine3。
与检测翻译过程最终产物的蛋白质印迹法和35S-甲硫氨酸标记技术不同，多聚核糖体分析技术能够检测核糖体与正在活跃翻译的mRNA的结合情况，从而更详细地研究不同条件下的翻译机制。因此，该技术可轻松地用于专门研究不同的翻译模式4-6、参与翻译调控的蛋白质因子7-9、影响蛋白质合成的应激条件1,10,11，或mRNA结构（如IRES或上游开放阅读框）对蛋白质合成的影响12-14。如今，随着DNA微阵列15或高通量测序技术16,17的应用，多聚核糖体分析的应用范围进一步扩大，可用于分析与多聚核糖体结合的mRNA。
方案
注意：关于RNA操作的说明：采取标准预防措施，防止RNase导致RNA降解。在实验方案的所有步骤中，均应佩戴手套，使用带滤芯的移液器吸头、无RNase的塑料耗材和试剂。所有溶液均使用超纯水或经DEPC处理的水。根据制造商的操作说明，使用RNase失活溶液对任何可能污染的表面进行去污染处理。
1. 溶液的配制。
- 配制 500 ml 基础溶液（0.3 M NaCl；15 mM MgCl2.6H2O；15 mM Tris-HCl，pH 7.4）。使用磁力搅拌器搅拌至溶液澄清，并通过 0.45 µm 滤膜过滤。室温保存。
- 按以下步骤配制 10% 和 50% 蔗糖溶液以及 60% 追踪溶液：
- 配制 10% 蔗糖溶液（w/v）：在 50 ml 离心管中加入 5 g 蔗糖，用基础溶液定容至 50 ml。配制 50% 蔗糖溶液（w/v）：在 50 ml 离心管中加入 25 g 蔗糖，用基础溶液定容至 50 ml。
- 配制 60%（w/v）追踪溶液：在 50 ml 离心管中加入 30 g 蔗糖，用基础溶液定容至 50 ml。向 60% 追踪溶液中加入 100 µl 饱和溴酚蓝溶液（将溴酚蓝加入水中直至不再溶解；离心以沉淀未溶解的粉末）。使用涡旋振荡器混匀，并确认完全溶解。
- 将溶液储存于 4 °C，待用时取出。
- 配制 RNA 裂解缓冲液。该缓冲液需在实验当天新鲜配制。每份样品需准备 500 µl RNA 裂解缓冲液。向 1 ml 基础溶液中加入 10 µl Triton X-100（终浓度 1% [v/v]）、1 µl DMSO 溶解的 100 mg/ml 放线菌酮（CHX，终浓度 0.1 mg/ml）和 3.5 µl RNasin（140 U/ml）。使用涡旋振荡器混匀。置于冰上保存。
注意：放线菌酮具有高毒性，可能引起突变。避免皮肤接触和吸入。为减少频繁操作粉末，可预先配制较大体积的 100 mg/ml DMSO 储存液，分装后于 -80 °C 长期保存，工作液保存于 -20 °C。 - 实验当天，通过向所需体积的 10% 和 50% 蔗糖溶液（每梯度约 7 ml）中加入 CHX（终浓度 0.1 mg/ml），配制含 CHX 的蔗糖溶液。
2. 使用自动梯度混合仪制备蔗糖梯度
- 打开梯度生成仪的电源，并将用于放置梯度的托盘调至水平（关键步骤！）。当托盘调平后，点击“Done”。
- 在菜单中选择要运行的梯度程序：
- 按下“GRAD”菜单，然后选择“LIST”。
- 选择“SW41”。
- 滚动列表，通过按下“RUN”按钮选择“10 - 50% gradient - 11 steps”程序。
- 将一个锥形超速离心管（SW-41 管，14 × 89 mm）放入标记块中，并使用提供的细管标记笔沿标记块的上台阶在管壁上画一条标记线。将标记好的离心管放置在稳定台面上的适配架中。
注意：此标记线将作为分层加入 10% 和 50% 蔗糖溶液时的填充参考线。 - 将两个提供的套管连接到两个 10 ml 注射器上，并用含有 RNase 失活液的温蒸馏水反复抽吸清洗。之后务必彻底清除所有残留水分。
- 用 10% 蔗糖+CHX 溶液填充其中一个注射器，将套管插入超速离心管底部。缓慢挤出 10% 蔗糖溶液，直至液面刚好超过管壁上的标记线。
注意：避免产生气泡。若出现气泡，请轻轻敲击离心管以驱除气泡。 - 用 50% 蔗糖+CHX 溶液填充另一个注射器，用擦拭纸擦去多余液体后，将套管轻轻插入超速离心管底部。缓慢挤出 50% 蔗糖溶液，直至液面恰好达到标记线。然后迅速而平稳地抽出套管。
注意：此时 10% 蔗糖溶液应上升并在管顶形成弯月面。若未形成，需在液面处补加少量 10% 蔗糖溶液。 - 略微倾斜超速离心管，插入所提供的盖帽，同时排出所有气泡。使用微量移液器移除盖帽储液腔中的多余液体。
- 擦去管壁外的多余液体，将离心管放置于梯度生成仪的托盘上。
- 按下“RUN”按钮。
注意：托盘将按设定角度倾斜，暂停 5 秒后开始旋转，以形成梯度。 - 当梯度形成完成后（约 2 分钟，仪器会发出提示音），小心取下超速离心管（或离心管组），放入支架中，并迅速向上拔出盖帽，避免扰动梯度。
- 将梯度管置于冰上保存，切勿扰动！或者，也可在 4 °C 下保存过夜。
- 或者，可使用双室梯度生成器按以下步骤制备梯度：
- 用 RNase 失活液和无 RNase 水冲洗梯度生成器的管路和装置。
- 向梯度生成器的近端室加入 5 ml 的 50% 蔗糖+CHX 溶液，并确保两室之间的空气完全排出。
- 向梯度生成器的远端室加入 5 ml 的 10% 蔗糖+CHX 溶液。
- 向一个锥形离心管（SW-41 管，14 × 89 mm）底部加入 0.5 ml 的 50% 蔗糖+CHX 溶液，并将其放入管架中。
- 启动近端室中的搅拌器，打开活塞，以“3”档速度（约 1 ml/min）开始沉积梯度。
- 将制备好的梯度管置于冰上，避免扰动。
注意：梯度可在 4 °C 下保存过夜。
3. 细胞裂解与超速离心。
- 将SW-41转子和离心管置于4 °C预冷，并将离心机温度设为4 °C。
注意：细胞裂解步骤针对每梯度使用两个150 mm培养皿的亚融合状态（约70–80%融合度）HEK293细胞进行了优化，不同细胞系可能需要调整相应体积。 - 在裂解前至少24小时，以适当的细胞密度将细胞接种于生长培养基中。
- 准备一份含0.1 mg/ml CHX的生长培养基（每150 mm培养皿20 ml）。
- 将细胞在含CHX的培养基中（每150 mm培养皿20 ml）于37 °C/5% CO2条件下孵育3分钟，以阻断并稳定多聚核糖体。
- 迅速操作，吸除培养皿中的培养基，将培养皿置于冰上，用10 ml预冷的含CHX（终浓度0.1 mg/ml）磷酸盐缓冲液（PBS：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4 ，1.8 mM KH2PO4）洗涤细胞一次，注意沿培养皿壁缓慢加样，避免吹起细胞单层。
- 吸除PBS，向每个培养皿中加入额外10 ml PBS+CHX，用细胞刮刀刮下细胞，并将两个培养皿的全部液体转移至冰上的50 ml离心管中。保留1 ml细胞悬液于微量离心管中置于冰上，用于后续蛋白质分析。
- 将50 ml离心管中的细胞在4 °C、300 × g条件下离心10分钟。
- 彻底去除PBS，将沉淀重悬于500 µl预冷的RNA裂解缓冲液中。
- 将细胞悬液转移至2 ml微量离心管中。
- 反复吹打以裂解细胞，冰上孵育10分钟，期间偶尔涡旋震荡。
- 在4 °C、2,000 × g条件下离心5分钟，沉淀细胞核。
- 将上清液转移至新的2 ml微量离心管中。
- 在4 °C、17,000 × g条件下离心5分钟，沉淀细胞碎片。
- 将上清液转移至新的2 ml微量离心管中，取2 µl测定260 nm处的光密度值（以裂解缓冲液作为空白对照）。
- 从每个样品中取出50 µl（总量的10%）用于总RNA分析。注意：裂解物可保存于-80 °C直至使用。
- 将等量A260单位的样品小心加载至各蔗糖梯度中（最少10 OD，最佳25 OD，最大体积500 µl；如需，可用额外裂解缓冲液稀释浓缩的裂解物）。
- 超速离心前确保各梯度间重量差异不超过0.1 g。
- 在4 °C条件下，以39,000 rpm（260,343 × g）离心1.5小时。
- 离心过程中保持转子刹车开启，在减速至1,000 rpm时关闭刹车。
注意：此步骤可最大限度减少因刹车时电刷接触转子导致的加速度突变对梯度造成的扰动。
4. 梯度分馏系统仪器设置。
- 按照以下步骤设置仪器，并用水作为空白对照校准分光光度计：
- 打开仪器各组件，使光源预热至少15分钟。
- 确保馏分收集器设置为“多聚核糖体（polysome）”方法（按文件夹图标两次，再按返回箭头两次以返回主界面）。
- 确保馏分收集器上的阀门处于废液位置（箭头指向垃圾桶图标）。在废液收集管下方放置一个盛有蒸馏水的250 ml锥形瓶。
- 在图表记录仪上选择以下设置：将灵敏度旋钮设为“SET LAMP AND OPTICS”；噪声滤波开关设为“1.5”；峰分离旋钮设为“OFF”；走纸速度旋钮设为“30 cm/hr”（即5 cm/10 min）；将分光光度计单元顶部的基线调节旋钮（Baseline Adjust dial）设为“MAX OPEN”。
注：可选：可使用数字记录软件替代图表记录仪。在计算机上点击“开始”，将弹出采集窗口：在“Options”菜单中取消勾选“Pause graphics”；在“Scaling”中将图形范围设为-10至100（可在运行过程中动态调整）；点击“Save”按钮创建新文件并开始记录运行数据。 - 将注射器和针筒装入泵中，并使用提供的螺丝和内六角扳手拧紧固定。
注：切勿过度拧紧。 - 使用“REV”指令以“RAPID”速度将追洗液（Chase Solution）吸入注射器。将泵置于直立位置，使用“FORWARD”指令将管路中的空气排出。此功能及清洗步骤仅使用“RAPID”模式。
- 安装一支装有无RN酶水的超速离心管。
- 用套管刺穿超速离心管，直至看到两个黑色标记（出液孔位于这两个标记之间），然后将注射泵设为“Manual”模式并以6.0 ml/min启动。
- 当水流经流通池时（追洗液填充离心管约1/3时），切换至可变速度模式，并将流速设为1.0 ml/min。
- 在1.0 ml/min的流速下，调节分光光度计上的基线调节旋钮，使图表上的电压读数为零（±0.5单位范围内）。
注：观察废液管中流出的水是否进入锥形瓶。 - 将所需的灵敏度设为“0.5”或“1.0” AU。
注：对于10 ml梯度中10 OD单位的样品，1.0 AU灵敏度效果最佳。若OD值低于10，可使用“0.5”灵敏度以增强信号。 - 按下自动基线（Auto Baseline）按钮，并通过调节记录仪偏移旋钮（Recorder offset dial），将基线设定在图表记录仪的10%刻度位置（若使用数字记录仪则此步骤可选）。
- 当获得稳定基线后，若使用模拟图表记录仪，则将泵开关调至“OFF”，并将走纸速度旋钮调至60 cm/hr；若使用数字记录仪，则将泵开关和走纸速度均设为“OFF”。
- 通过将泵切换至“REV”位置，回收追洗液（如有需要，可将流速调回6.0 ml/min……切勿使用RAPID模式），直至液体到达穿刺套管的第一个标记处。
- 取下离心管，通过少量追洗液流经套管以排出其中可能存在的气泡。清洁穿刺部位。
注：少量残留水可能从流通池中渗出。
5. 梯度分馏与样品收集。
- 安装并刺穿含有蔗糖梯度的离心管。
- 将十一支 2 ml 微量离心管放入分部收集器托盘的 1–11 号位置，确保管盖不向上突出。暂时用“废液管”替换“第 1 号管”，以收集分部收集管路中残留的液体。
- 将泵控制旋钮设为“手动”模式，并将注射泵的流速设为“6.0 ml/min”。
- 按下分部收集器上的“播放”图标。当机械臂到达第一支管时，立即按下“暂停”按钮（这将定位机械臂并打开分部收集阀）。
- 使用“前进”命令启动泵，并观察记录仪笔。当笔迹开始向上偏转时（表明样品正通过分光光度计的流动池），迅速将“废液管”更换为“第 1 号管”。
- 当第一滴液体被收集后，迅速将命令切换至“远程启动/停止”、“可变（1.0 ml/min）”，然后按下“播放”图标。
注意：此时泵由分部收集器界面控制，每分钟将收集 1 ml 的组分。 - 从此刻起，A260 读数将显示在数字记录仪界面（或模拟图表记录仪）上。请确保软件上的“记录”按钮已被按下！
- 当蓝色洗脱液进入收集管或最后一支管（通常为第 11 号管）时，按下“停止”图标。
注意：分配阀应切换至废液阀。 - 在所有梯度完成分部收集前，始终将组分置于冰上。当天实验结束后，组分可在进行蛋白质或 RNA 提取前储存于 -80 °C。若需同时进行蛋白质和 RNA 分析，可将每份组分均分为两份（各 500 µl，分别用于蛋白质和 RNA 分析）。
6. 清洗
注意：（仅当需要收集多个梯度时才执行此可选步骤）。
- 将废液管浸入含有约 50 ml 超纯水的锥形瓶中，并以 6 ml/min 的流速反转泵运行。
- 当冲洗液到达穿刺针管的第一个刻度线时，停止泵运行。
- 取下离心管，排出针管中的任何残留空气，并清洁穿刺装置。
注意：流路池可能会有少量残留水泄漏。 - 从步骤 5.1 开始重复分级操作程序。
7. 最终清理。
- 将泵管从穿刺针底部断开，并使用快速流速设置将Chase Solution泵入一个50 ml离心管中。将Chase Solution储存于4 °C，因其可重复使用。
- 将泵管连接至三通管路系统，并关闭通向注射器的阀门。将一根管路连接至装有蒸馏水的50 ml注射器，另一根管路连接至穿刺针底部。
- 安装用于空白步骤的超速离心管，并通过分光光度计和收集管至少流过50 ml蒸馏水（在界面上点击“开始/暂停”图标，切换至收集菜单）。
- 拆下离心管、注射器（使用内六角扳手拆卸螺丝）以及所有其他可拆卸部件，先用温自来水彻底清洗，再用超纯水冲洗。
注意：清洗活塞、筒体、管路和穿刺套管时需格外小心。
注意：请小心操作玻璃注射器筒体！将所有部件存放于无尘环境中。 - 用沾有蒸馏水的软纸巾擦拭流通池底部。清洁馏分收集器托盘及任何可能溅到蔗糖的区域。
8. 从蔗糖组分中分离 RNA。
- 每1 ml蔗糖组分准备50 µl蛋白酶K溶液（37.5 µl 10% SDS，7.5 µl 0.5 M EDTA，1 µl Glycoblue，4 µl 20 mg/ml蛋白酶K）。
- 在2 ml平底管中，将1 ml蔗糖组分与50 µl蛋白酶K溶液于55 °C孵育1小时（若使用500 µl组分，则相应调整蛋白酶K溶液的体积）。
- 向蔗糖组分中加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇（125:24:1，建议使用酸性（pH 4.5）以减少DNA污染）。
注意：向第7–10组分中额外加入200 µl氯仿，因其密度较大，可能导致相分离倒置。
注意：苯酚/氯仿接触或吸入可引起灼伤。操作时须穿戴实验服、安全护目镜，并在通风橱中进行。 - 涡旋混匀约30秒，室温下以最大转速离心5分钟。
- 移取约80–90%的水相（避免触及可能含有基因组DNA的中间层），转移至新管中。
- 加入等体积氯仿，重复步骤8.4。
- 小心移取水相，避免接触中间层。
- 加入1/10体积的3 M醋酸钠（pH 5.2）（也可使用5 M醋酸铵替代）。
- 加入1.5倍体积的预冷无水乙醇，涡旋15秒。
- 于-20 °C沉淀过夜（若时间紧迫，可于-80 °C沉淀1小时）。
注意：若需要，样品可在-20 °C保存更长时间。 - 4 °C下以最大转速离心30分钟。
- 用1 ml预冷无RNase的70%乙醇洗涤沉淀。
- 将沉淀空气干燥，并溶于20 µl无RNase的水中。
- 通过分光光度法测定总RNA浓度，以确保产量和纯度（基于A260/280比值），随后使用各组分等体积样品及针对目标mRNA的特异性PCR引物进行标准RT-qPCR分析14。
9. 从蔗糖组分中分离蛋白质。
- 除了RNA外，还可以从各个多聚核糖体组分中分离和鉴定蛋白质。请选用多种已有的优质蛋白质分离方案之一进行操作， 例如 18.
结果
我们最近报道了肿瘤抑制因子PDCD4作为一种选择性翻译抑制剂的新功能，可抑制携带IRES的编码凋亡抑制因子XIAP和Bcl-xL的mRNA的翻译12。多聚核糖体分析（polysome profiling）是一项关键的技术，用于证明PDCD4在IRES介导的翻译过程中的特异性作用。HEK293细胞被瞬时转染以降低内源性PDCD4水平（图1A），随后进行多聚核糖体谱型分析。我们观察到，降低PDCD4水平并未损害细胞整体的翻译活性，这一点通过比较siCTRL和siPDCD4处理细胞的多聚核糖体谱型未见明显变化得以证实（图1B）。同样，非IRES型XIAP19的多聚核糖体分布在这两组细胞之间也未发生改变（图1C）。相反，携带IRES的两种mRNA——XIAP和Bcl-xL——的多聚核糖体分布则发生了显著变化。在PDCD4缺失的情况下，这两种mRNA的分布向重核糖体多聚体（heavy ribopolysomes）区域偏移（图1D、E）。由于这一变化并未伴随XIAP和Bcl-xL mRNA稳态水平的改变（图1F），这些结果表明，在PDCD4水平降低的细胞中，XIAP和Bcl-xL的翻译被增强，这一结论进一步通过Western blotting得到验证（图1G）。
图1：多聚核糖体分析鉴定PDCD4为XIAP和Bcl-xL翻译的选择性抑制因子。 （A） HEK293 细胞用 PDCD4 siRNA 或对照（CTRL）非靶向 siRNA 处理后，裂解并进行 Western 印迹分析，使用抗 PDCD4 和抗 Nucleolin 抗体验证 PDCD4 沉默程度。 (B) PDCD4 按如下方法进行敲低 （A） 并对接收的细胞裂解液进行多聚核糖体分析。顶部图示为典型的多聚核糖体图谱；XIAP 非IRES元件的分布情况 (C)Bcl-xL (D)和 XIAP IRES (E) 以GAPDH的mRNA为参照，各组分中目标mRNA的相对含量表示为总mRNA的百分比（% mRNA）。 (F) 通过RT-qPCR检测经PDCD4 siRNA或对照（CTRL）siRNA处理的细胞中mRNA的稳态水平。 (G) 来自裂解液的 （A） 也使用抗 XIAP、抗 Bcl-xL 和抗 Nucleolin 抗体进行了蛋白质印迹分析。（注：数据见于 图1 最初发表于 12) 请点击此处查看此图的放大版本。
讨论
多聚核糖体分析是一种强大的技术，可用于定量不同处理条件下特定转录本的翻译状态。该技术原理上非常简单，但实际操作涉及多个步骤，其中一些步骤对于获得良好的多聚核糖体图谱至关重要。这些关键步骤包括：1）使用无RNase的试剂和塑料耗材；2）制备优质的蔗糖梯度（根据我们的经验，10-50%的蔗糖梯度最有利于有效分辨40S/60S亚基以及结合有核糖体的mRNA）；3）使用处于指数生长期且融合度不超过80%的细胞，以捕获最高的翻译速率。在进行长时间细胞处理（如基因敲低或过表达）时，应特别注意最后一个步骤，即铺板细胞的数量需根据实验终点时细胞的融合度来确定。
在本研究呈现的结果中，多聚核糖体图谱分析是评估PDCD4在含有IRES的mRNA（如XIAP和Bcl-xL）翻译调控中作用的重要工具12。我们发现，在PDCD4敲低后，总体多聚核糖体图谱未发生明显变化（图1B），由此可得出结论：在本实验条件下，PDCD4并不影响细胞整体的蛋白质翻译。接下来，我们采用RT-qPCR分析，检测在PDCD4或对照siRNA处理的细胞中，XIAP和Bcl-xL mRNA的分布情况。相较于标准RT-PCR或Northern印迹法，qPCR是分析多聚核糖体图谱的首选方法，因为它能够对mRNA分布进行定量而非半定量分析，并可检测不同处理间翻译效率的细微变化。利用该技术，我们发现，在PDCD4敲低后，XIAP和Bcl-xL mRNA的分布（以梯度中占总靶mRNA的百分比表示）显著向重多聚核糖体（即结合大量核糖体的mRNA）区域偏移（图1D、E），表明这些mRNA的翻译水平升高。这一结果进一步通过XIAP和Bcl-xL蛋白水平的升高得以证实，而其稳态RNA水平则未发生变化（图1F、G）。值得注意的是，非IRES型XIAP mRNA在处理组与未处理组细胞间的多聚核糖体分布无变化（图1C）。此外，翻译效率也可表示为多聚核糖体组分（通常为第5至10组分）与单核糖体组分（通常为第2至4组分）中mRNA含量的比值14。
在整个实验流程中使用对照对于验证多聚核糖体分析结果至关重要，因为仅凭254 nm处的吸光度读数所观察到的峰无法单独归因于核糖体RNA（例如Triton X-100等去污剂在此光谱区域有强烈吸收，可能掩盖梯度顶部的40S/60S峰）。必须运行不含裂解液的空白梯度和/或仅含裂解缓冲液的梯度，以确定缓冲液在254 nm处对吸光度的相对贡献。此外，人为造成的高级结构也可能导致将实际并不存在的多聚核糖体误判为存在例如 “拟多核糖体”20）。在整个实验过程中，镁离子用于稳定80S核糖体；在裂解液和梯度缓冲液中加入二价阳离子螯合剂EDTA（20 mM，处理15分钟），可螯合镁离子，导致核糖体解离为其组成的小亚基（40S）和大亚基（60S）。因此，若在260 nm处记录的吸收峰确实代表多聚核糖体（polysomes），经EDTA处理后，该图谱将发生坍塌，在梯度顶部附近仅出现一个单一吸收峰，对应于游离的mRNA和核糖体亚基（数据未显示）。与此同时，qPCR分析的所有特异性靶标也应全部出现在梯度的顶部。
与mRNA结合的核糖体数量并不总是能够指示该mRNA翻译效率的高低。事实上，在某些特定情况下，多聚核糖体上的活跃翻译可能发生停滞21,22，读者应了解这些情况。要确定转录本是否正活跃地参与翻译过程，可通过以下两种方法：a）用嘌呤霉素处理样品，与EDTA不同，嘌呤霉素可导致正在mRNA上主动移位的核糖体发生“脱离”；或b）用高哈尔满碱（homoharringtonine）处理样品，该试剂仅抑制起始密码子处第一个核糖体的移位，从而导致下游所有正在移位的核糖体发生“脱离”。
在进行qPCR分析时，使用对照转录本也至关重要。选择那些不受不同处理条件影响的转录本作为对照，例如一些看家基因（GAPDH、Actin、Tubulin、Nucleolin）、核糖体mRNA（18S、RPL13A），或在本实验中采用的XIAP IRES非IRES变体，有助于验证处理对翻译的影响是特异性的还是普遍性的。这些对照转录本可用于标准化被分析mRNA的分布情况——如本研究所示，将XIAP和Bcl-xL的mRNA水平相对于GAPDH mRNA进行归一化，并表示为各组分mRNA总量百分比（即所有组分mRNA含量之和）；或者，也可将目标mRNA与对照mRNA以绝对值形式分别表示。对输入裂解液（通常为总体积的10%）进行qPCR分析是另一个用于控制特定mRNA分布的步骤。理想情况下，输入裂解液中某一特定转录本的mRNA含量应与所分析的全部10个组分中该转录本mRNA含量的总和相当。最后，为控制苯酚:氯仿抽提步骤，可选的操作是在每个多聚核糖体组分中加入外源RNA spike-in 体外 转录的报告基因mRNA（如CAT，氯霉素乙酰转移酶），随后可通过qPCR进行定量，甚至可用于数据的标准化 14.
与任何技术一样，多聚体图谱分析也存在一些局限性。通常需要收集至少10个组分（若需更精细地检测翻译效率的变化，则可能需要20个或更多组分），才能获得理想的多聚体分布，这一步骤在实际操作中具有一定的限制性，因为为了能够方便地同时处理40个样品以及4个输入对照的RNA提取和qPCR分析，每次最多只能分析4个样本。随着待分析转录本数量以及qPCR重复次数的增加，样本量会迅速累积，导致实验成本显著上升。基于qPCR的多聚体图谱分析另一局限在于，该方法仅适用于候选基因策略（即待分析的转录本需预先已知），无法用于全基因组范围的翻译水平分析。然而，在21世纪初st 世纪，研究人员开始利用DNA微阵列在基因组水平上分析其多聚核糖体RNA 15 以及最近与下一代测序技术相结合 16,17在此强大方法中，多聚核糖体分析的步骤如本方案所述，但与对各组分进行单独qPCR分析不同，而是将单体核糖体组分（通常为第2-4组分）和多聚核糖体组分（通常为后续组分）分别合并，然后通过DNA微阵列或全基因组RNA测序分析整体翻译水平的变化。因此，该方法可评估在特定处理条件下，所有从多聚核糖体向单体核糖体转移（翻译水平下降）或反向转移（翻译水平上升）的mRNA。随后可通过qPCR对特定mRNA在多聚核糖体中的分布进行验证和定量。多聚核糖体分析原理更为强大的应用是核糖体谱分析（ribosome profiling）。最近报道了该技术的进一步高通量扩展，可同时监测数百个多聚核糖体组分。 23这在研究突变体集合的翻译效率或进行大规模RNA干扰筛选时具有明显优势。核糖体谱分析是一种利用下一代测序技术来绘制被核糖体保护的RNA片段（即核糖体足迹）的方法，这些片段来源于正在进行蛋白质合成的核糖体24,25在此技术中，可通过环己酰亚胺（可逆）或依美丁（不可逆）抑制核糖体移位，随后进行细胞裂解和RNase消化，从而获得核糖体保护片段群体。富集核糖体，提取总RNA，并去除污染性的核糖体RNA及线粒体核糖体RNA。分离长约26–28个核苷酸的RNA片段，经逆转录生成cDNA文库并进行测序。26与标准的多聚核糖体分析方法不同，该方法不仅能鉴定出在翻译水平上受到调控的特定mRNA，还能在密码子分辨率上提供针对特定mRNA的信息，例如核糖体在特定转录本上的精确占据位置和密度。这对于具有特定翻译模式的mRNA（如含有IRES的mRNA）尤其具有重要意义，因为它能够提供更详细的信息，揭示核糖体在转录本上的招募位置。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢实验室过去和现在的成员，特别是 Urszula Liwak，在多核糖体分析方案方面的关键性讨论以及数据共享。本研究工作得到了加拿大卫生研究院、癌症研究学会以及加拿大自然科学与工程研究理事会向 MH 提供的运营基金资助。MDF 获得了加拿大范尼尔研究生奖学金博士奖和安大略省研究生奖学金的支持，本工作构成了她博士学位论文的一部分。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Gradient Master 108 自动梯度生成仪 | BIOCOMP | 107-201M | |
| Auto Densi-Flow 双室梯度生成仪 | LABCONCO | 4517000 | |
| Beckman 超速离心机 | Beckman Coulter | 型号 # L-100-XP | |
| 密度梯度分馏仪 | TELEDYNE ISCO | 69-3873-246 | 组成：穿管系统， 蠕动泵，UA-6 检测器（配备 254 nm 和 280 nm 滤光片）及 Foxy R1 分部收集器 |
| WinDaq 数据采集软件 | DATAQ INSTRUMENTS | WINDAQ/LITE | http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm |
| 聚丙烯超速离心管（适用于 SW41，14 x 89 mm） | Beckman Coulter | 331372 | |
| 无核酸酶 2 ml 离心管（海豚鼻型） | DiaMed | PRE1900-N | |
| 无核酸酶 2 ml 离心管（平底型） | SafeSeal | 12000 | |
| 蔗糖（无核酸酶） | Calbiochem | 573113 | 分子量 = 342.3 g/mol |
| 环己酰亚胺 | SIGMA | C7698 | 分子量 = 281.4 g/mol。用 DMSO 溶解后于 -80°C 长期保存。注意：有毒！可引起呼吸道和皮肤刺激。称量时请佩戴口罩。 |
| 氯化钠（无核酸酶） | OmniPur | 7710 | 分子量 = 58.44 g/mol |
| MgCl₂·6H₂O（无核酸酶） | OmniPur | 5980 | 分子量 = 203.3 g/mol |
| Tris 碱（无核酸酶） | J.T. Baker | 4109-01 | 分子量 = 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | OmniPur | 9400 | 注意：有毒！可引起呼吸道和皮肤刺激 |
| 重组 RNasin 核糖核酸酶抑制剂 | Promega | N2515 | |
| RNaseZap 核糖核酸酶失活溶液 | Ambion, Life Technologies | AM9780 | |
| GlycoBlue 共沉淀剂（15 mg/ml） | Invitrogen, Life Technologies | AM9516 | |
| 酸性苯酚:氯仿，pH 4.5（含 IAA，125:24:1） | Ambion, Life Technologies | AM9722 | 注意：有毒！可引起呼吸道刺激以及皮肤刺激和腐蚀 |
参考文献
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