小鼠主嗅觉系统中纤毛的全组织染色标记

摘要

嗅觉感觉神经元的纤毛中含有信号转导级联相关的蛋白质，但在冷冻切片中对其分布进行精细的空间分析较为困难。本文介绍了一种优化的全装片标记及纤毛蛋白的正面观（en face）可视化方法。

摘要

小鼠的嗅觉系统包含位于鼻腔内衬上皮中的600万至1000万个嗅觉感觉神经元。这些嗅觉神经元向嗅上皮表面延伸出一条单一树突，末端形成一种称为树突小球的结构。纤毛由此小球发出，伸入覆盖上皮表面的黏液层中。嗅觉信号转导级联中的蛋白质主要定位于纤毛膜内，可直接与环境中的挥发性物质接触。为了深入理解嗅觉信号转导机制，一个关键方面是对信号蛋白分布进行精确的形态学分析。在传统的冷冻切片中使用光学显微镜方法时，由于纤毛结构密集，难以准确确定蛋白在嗅觉纤毛中的定位。为解决这一问题，我们优化了一种全组织染色标记纤毛的方法，从而更清晰地呈现其形态及信号蛋白的分布情况。我们通过比较Kirrel2蛋白在全组织染色与传统冷冻切片染色中的标记效果，展示了该方法的优势。这种轴突导向性黏附分子已知会以依赖神经活动的方式定位于特定亚群的感觉神经元及其轴突中。而全组织纤毛标记揭示了该蛋白定位的额外且全新的图景。

引言

小鼠鼻腔内的嗅觉上皮包含600万至1000万个双极嗅觉感觉神经元¹每个嗅觉神经元从1,200个嗅觉受体基因中选择一个进行表达。嗅觉识别始于气味分子与嗅觉受体的结合。²，进而激活腺苷酸环化酶III型（ACIII）³ 通过嗅觉特异性G蛋白Gα_嗅觉⁴. 随之升高的环磷酸腺苷（cAMP）会打开环核苷酸门控（CNG）非选择性阳离子通道，导致 Ca²⁺ 内流²⁺ 和 Na⁺，随后是 Ca²⁺ 内流导致Ca通道开放²⁺ 活化的 Cl^- 通道^5,6. 所产生的外向Cl⁻电流^- 通过细胞内高浓度 Cl⁻ 实现促进性转运^- 由稳定 Cl 维持的浓度^- 摄取，可能通过 Na⁺/⁺/Cl^- 共转运蛋白 NKCC1，Cl⁻^-/HCO₃⁻^- 交换体 SLC4A1，以及可能其他尚未被鉴定的转运蛋白^6-8.

双极性的嗅觉神经元具有单根无分支的轴突，直接投射至嗅球，以及一根树突，该树突延伸至上皮表面，并终止为一种特化的结构，即树突结。从此树突结发出10至30根纤毛，其长度可达5....

方案

注意：所有动物实验均在夏里特医院或耶拿大学医院进行，遵循德国动物护理法律，避免动物遭受任何不必要的痛苦。

1. 溶液配制与解剖工作区准备

1. 溶液
   注意：在开始上皮组织解剖之前，先准备好以下溶液。
   1. 解剖步骤所用溶液：
      1. 配制Ringer溶液（pH 7.4），其中含140 mM NaCl、5 mM KCl、10 mM HEPES、2 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂和10 mM葡萄糖。
      2. 配制PBS^-/-溶液（pH 7.4），其中含2.68 mM KCl、1.47 mM KH₂PO₄、136 mM NaCl和8.1 mM Na₂HPO₄。
      3. 配制固定液（pH 7.2），其中含1x PBS^-/-、0.2 mM CaCl₂、4%蔗糖和4%多聚甲醛。固定液中的蔗糖有助于改善冷冻切片的质量以及切片的黏附性。储存于-20 °C。
   2. 染色步骤所用溶液
      1. 配制PBS^+/+溶液，其中含1x PBS^-/-、0.48 mM MgCl₂

结果

嗅觉上皮en face制备物可用于研究感觉神经元纤毛中蛋白质的定位，从而对在冰冻切片分析后定位尚不明确的蛋白质进行深入研究。这一问题可通过Kin of IRRE样蛋白2（Kirrel2）染色的实例加以说明。Kirrel2（亦称为Neph3）属于膜蛋白免疫球蛋白（Ig）超家族成员，具有同嗜性黏附蛋白的功能。研究表明，Kirrel2在嗅觉系统轴突导向中发挥作用，并以依赖神经元活动的方式在部分嗅觉神经元中表达¹⁰。

对嗅上皮典型冰冻切片进行 Kirrel2 免疫染色，结果显示 Kirrel2 定位于轴突、胞体和树突中（图 2A）。所有溶液的配制均如上文所述，采用 en face 制备技术进行。尽管部分标记出现在由树突 knob 构成的层上方，但通过冰冻切片分析仍难以确定 Kirrel2 是否定位于纤毛。某些神经元在其嗅结节内部及周围呈现染色，但单根纤毛难以分辨。相比之下，按照上述方案制备的嗅上皮 en face 样本则明确显示了 Kirrel2 的纤毛定位（图 2.......

讨论

本方案中描述的en face制备技术为嗅觉系统的详细分析提供了一种强有力的工具。迄今为止，大多数关于信号蛋白定位特征的研究均采用冷冻切片的免疫染色方法。该方法能够较好地展示嗅上皮的整体结构，不同细胞类型或区域中的蛋白表达也易于识别。然而，嗅纤毛中的表达有时难以检测。即使纤毛定位明显，冷冻切片也难以全面呈现纤毛层的形态结构。en face制备则为观察上皮提供了另一种视角。

本文所述的嗅觉上皮制备方法特别适用于研究在少量嗅觉神经元中表达的蛋白质。在此情况下，单个嗅球结构清晰可辨，因此可方便地分析蛋白质在嗅球及延伸纤毛中的定位。与冷冻切片中信号蛋白的染色相比，该方法能够确定每个嗅球上的纤毛数量以及纤毛的长度。此外，en face 制片可实现蛋白质沿纤毛的精确定位。还可分析蛋白质是否在纤毛膜上均匀分布。此外，可研究施加气味配体后蛋白质定位的变化。另一个应用方向是研究发育过程中蛋白质定位的动态变化。我们不仅在成年小鼠的 en face 制片中获得了良好的结果，也在直至 E18 阶段的幼龄动物中取得了理想效果。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
弹簧剪			直头，多个供应商
手术剪			尖头和钝头，多个供应商
精细镊子			弯头，Dumont #7，多个供应商
剃须刀片			超薄型，多个供应商
带照明的双目显微镜			多个供应商，Stemi 2000-C，Zeiss
培养皿			多个供应商
液阻笔	Science Services	N71310
多聚赖氨酸包被载玻片	Thermo Scientific	J2800AMNZ
共聚焦显微镜	Leica Microsystems	TCS SPE
一抗 Goat anti-Kirrel2	R&D Systems	AF2930	1:200
一抗 Rabbit anti-mOR-EG	Baumgart et al., 2014		1:200
二抗	Life Technologies	A21206, A11057	1:500
封片剂，ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂	Life Technologies	P36930
多聚甲醛	Sigma	441244	有毒，需在通风橱中操作