需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

小鼠主嗅觉系统中纤毛的全组织染色标记

11.1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/52299

⸱

2014年12月27日

 , 
1Pharmacology and Toxicology, Universitaetsklinikum Jena, 2Charite-Universitaetsmedizin Berlin

本文内容

摘要

嗅觉感觉神经元的纤毛中含有信号转导级联相关的蛋白质，但在冷冻切片中对其分布进行精细的空间分析较为困难。本文介绍了一种优化的全装片标记及纤毛蛋白的正面观（en face）可视化方法。

摘要

小鼠的嗅觉系统包含位于鼻腔内衬上皮中的600万至1000万个嗅觉感觉神经元。这些嗅觉神经元向嗅上皮表面延伸出一条单一树突，末端形成一种称为树突小球的结构。纤毛由此小球发出，伸入覆盖上皮表面的黏液层中。嗅觉信号转导级联中的蛋白质主要定位于纤毛膜内，可直接与环境中的挥发性物质接触。为了深入理解嗅觉信号转导机制，一个关键方面是对信号蛋白分布进行精确的形态学分析。在传统的冷冻切片中使用光学显微镜方法时，由于纤毛结构密集，难以准确确定蛋白在嗅觉纤毛中的定位。为解决这一问题，我们优化了一种全组织染色标记纤毛的方法，从而更清晰地呈现其形态及信号蛋白的分布情况。我们通过比较Kirrel2蛋白在全组织染色与传统冷冻切片染色中的标记效果，展示了该方法的优势。这种轴突导向性黏附分子已知会以依赖神经活动的方式定位于特定亚群的感觉神经元及其轴突中。而全组织纤毛标记揭示了该蛋白定位的额外且全新的图景。

引言

小鼠鼻腔内的嗅觉上皮包含600万至1000万个双极嗅觉感觉神经元1每个嗅觉神经元从1,200个嗅觉受体基因中选择一个进行表达。嗅觉识别始于气味分子与嗅觉受体的结合。2，进而激活腺苷酸环化酶III型（ACIII）3 通过嗅觉特异性G蛋白Gα嗅觉4. 随之升高的环磷酸腺苷（cAMP）会打开环核苷酸门控（CNG）非选择性阳离子通道，导致 Ca²⁺ 内流2+ 和 Na+，随后是 Ca2+ 内流导致Ca通道开放2+ 活化的 Cl- 通道5,6. 所产生的外向Cl⁻电流- 通过细胞内高浓度 Cl⁻ 实现促进性转运- 由稳定 Cl 维持的浓度- 摄取，可能通过 Na+/+/Cl- 共转运蛋白 NKCC1，Cl⁻-/HCO₃⁻- 交换体 SLC4A1，以及可能其他尚未被鉴定的转运蛋白6-8.

双极性的嗅觉神经元具有单根无分支的轴突，直接投射至嗅球，以及一根树突，该树突延伸至上皮表面，并终止为一种特化的结构，即树突结。从此树突结发出10至30根纤毛，其长度可达50–60 µm，伸入覆盖上皮表面的黏液层中9。经典的信号转导级联中的蛋白质主要定位于这些纤毛的膜上。上皮感觉表面积的增加增强了对气味分子的检测能力。由于感觉神经元密度较高，来自相邻树突结的纤毛相互交错混杂。这种交错导致表达不同类型嗅觉受体的不同神经元的纤毛在上皮表面随机混合。因此，在冷冻切片中，对仅存在于部分感觉神经元中的纤毛蛋白进行检测和细胞定位十分困难。此外，由于冷冻切片的厚度通常小于纤毛的平均长度，几乎无法精确确定这些蛋白在纤毛上的具体定位。

为了研究尚未表征的膜蛋白在嗅觉神经元纤毛中的定位，我们优化了一种en face制片技术，该技术可实现对纤毛内蛋白定位的详细分析。简言之，处死小鼠后沿中线附近将头部切开，去除鼻甲、鼻骨和额骨以暴露鼻中隔。通过切断鼻腔内所有连接，将带有嗅觉上皮部分的鼻中隔游离。将鼻中隔置于盛有任氏液的培养皿中后，将上皮剥离并转移至经包被处理的玻片上。经过短暂固定后，可进行免疫染色操作，操作过程中需尽可能轻柔，以避免损伤脆弱的组织。我们通过比较两种不同膜蛋白在经典冷冻切片与上述en face制片中的染色结果，展示了该方法所能达到的分辨率。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

注意：所有动物实验均在夏里特医院或耶拿大学医院进行，遵循德国动物护理法律，避免动物遭受任何不必要的痛苦。

1. 溶液配制与解剖工作区准备

  1. 溶液
    注意：在开始上皮组织解剖之前，先准备好以下溶液。
    1. 解剖步骤所用溶液：
      1. 配制Ringer溶液（pH 7.4），其中含140 mM NaCl、5 mM KCl、10 mM HEPES、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2和10 mM葡萄糖。
      2. 配制PBS-/-溶液（pH 7.4），其中含2.68 mM KCl、1.47 mM KH2PO4、136 mM NaCl和8.1 mM Na2HPO4。
      3. 配制固定液（pH 7.2），其中含1x PBS-/-、0.2 mM CaCl2、4%蔗糖和4%多聚甲醛。固定液中的蔗糖有助于改善冷冻切片的质量以及切片的黏附性。储存于-20 °C。
    2. 染色步骤所用溶液
      1. 配制PBS+/+溶液，其中含1x PBS-/-、0.48 mM MgCl2和0.9 mM CaCl2。
      2. 配制PBST+/+溶液，其中含1x PBS+/+和0.1% Triton X-100。
      3. 配制封闭液，其中含1x PBST+/+和1%明胶。
  2. 工作台
    1. 解剖工作台需配备照明充足的体视显微镜以及防液笔。
    2. 准备一个盛有Ringer溶液的培养皿，以及带黏附性的载玻片。
    3. 准备以下手术器械：一对一端锋利、一端钝的手术剪，一对直头弹簧剪，两把细弯头镊子，以及一片剃须刀片（图1A）。

2. 鼻中隔的制备

  1. 将动物饲养在经批准的笼具中，确保其能正常获取食物和水，并维持适当的昼夜循环。
  2. 在密闭容器中使用浸有100%异氟烷的纱布进行麻醉，并通过检测后肢足底反射来监测镇痛效果。由于颈椎脱位可能导致鼻腔出血，因此应直接对已麻醉的小鼠进行断头处死。
  3. 去除皮肤以暴露整个颅骨和鼻部骨骼，用纸巾彻底擦去残留血液和组织。移除下颌骨和门齿。
  4. 沿鼻背缝线两侧平行切开1-2 mm，分离鼻中隔（内侧）与上颌骨（外侧），从而将鼻中隔一侧从上颌骨分离。通过一次切割将鼻部分开。若鼻中隔上仍附着骨碎片或鼻甲，应小心去除，以完全暴露鼻中隔，但避免直接触碰鼻中隔。
  5. 用精细弯头镊子沿鼻中隔背侧、鼻中隔与鼻骨之间的间隙轻轻滑动，以去除背侧鼻骨。对骨施加轻微压力，向上推动并将其移除。
  6. 为获取双侧鼻腔各自的鼻中隔组织，小心去除头颅另一侧的上颌骨。在制备较年长动物（P > 28）时，需去除覆盖嗅球的额骨前端部分。
  7. 通过略带黄色的颜色识别嗅上皮（图1B）。邻近的呼吸上皮呈白色，在解剖显微镜下可见其表面纤毛的运动。使用精细弹簧剪刀沿嗅上皮与呼吸上皮的边界进行剪切。
  8. 延长切口，分离鼻中隔与犁骨之间的腹侧连接。然后沿鼻中隔与筛骨筛板之间的边界剪开。此时鼻中隔已完全脱离与头颅的所有连接。操作时可参考图1C所示的切割位置。

3. 用于免疫染色的嗅觉上皮分离

  1. 将一张粘附性载玻片放入盛有林格氏液的培养皿中，放置在培养皿边缘，使载玻片的一半浸入林格氏液中（图1A）。
  2. 使用镊子小心地将带有嗅上皮的筛骨转移至培养皿中。提起时避免用镊子尖夹取。
  3. 用一把镊子夹住筛骨的垂直板，用另一把镊子小心地从鼻中隔一侧剥离嗅上皮。将弯曲的镊尖插入垂直板与上皮之间，轻轻剥离上皮组织。
  4. 务必始终注意识别纤毛面，以防嗅上皮在林格氏液中翻转。一旦上皮翻转，后续将很难再辨别纤毛面。通常情况下，上皮会卷曲，且纤毛面朝内。
  5. 将卷曲的组织形态与图1C所示切割位置进行比对。在组织边缘处用镊子夹住，并将其拉至载玻片上。切勿用镊子接触纤毛面，以免损伤组织。
  6. 翻转鼻中隔，重复上述操作，取另一侧的嗅上皮。
  7. 用纸巾将两块嗅上皮周围的载玻片区域擦干，并用防液体扩散笔在组织周围画圈。
  8. 在室温下用150 µl固定液固定组织10分钟。针对多种经测试的抗体，为保持纤毛的稳定性和完整性，建议采用较短的固定时间。在此10分钟内 ，纤毛可被固定，但整个上皮组织可能尚未完全固定。因此，染色后应立即进行显微镜观察。然而，不同抗体所需的固定时间可能有所差异。

4. 染色方案

注意：操作组织时需格外小心，以保护嗅觉感觉神经元的纤毛结构。使用移液器移除溶液。切勿将任何溶液直接滴加到上皮组织上，因为机械力可能破坏纤细的纤毛。除非另有说明，所有步骤均在室温下进行。

  1. 去除固定液，并用 PBS+/+ 洗涤 2 次。
  2. 用封闭液在室温下孵育上皮组织至少 1 小时。
  3. 将一抗按 1:200 的比例溶于封闭液中配制一抗溶液（本研究所使用的一抗稀释比例），并在最高速度下离心 5 分钟以去除任何沉淀物。
  4. 将上皮组织置于湿盒中，于 4 °C 过夜孵育一抗溶液。
  5. 用 PBS+/+ 洗涤上皮组织，每次 5 分钟，至少洗涤 3 次。
  6. 将二抗按 1:500 的比例溶于封闭液中配制二抗溶液，并在最高速度下离心 5 分钟。
  7. 将上皮组织在避光环境中孵育二抗溶液 1 小时。
  8. 用 PBS+/+ 洗涤上皮组织，每次 5 分钟，至少洗涤 3 次。
  9. 用刀片或纸巾去除液封剂，再用蒸馏水洗涤上皮组织 5 秒。
  10. 用抗荧光淬灭封片试剂保存组织。
    注意：背景荧光在数天内会迅速增强，因此建议在封片后不超过 2 天内完成显微镜观察。寻找正确焦平面时需特别注意避免挤压组织，否则可能严重损坏样本。由于存在离焦荧光信号，建议进一步采用共聚焦显微镜进行观察。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

嗅觉上皮en face制备物可用于研究感觉神经元纤毛中蛋白质的定位，从而对在冰冻切片分析后定位尚不明确的蛋白质进行深入研究。这一问题可通过Kin of IRRE样蛋白2（Kirrel2）染色的实例加以说明。Kirrel2（亦称为Neph3）属于膜蛋白免疫球蛋白（Ig）超家族成员，具有同嗜性黏附蛋白的功能。研究表明，Kirrel2在嗅觉系统轴突导向中发挥作用，并以依赖神经元活动的方式在部分嗅觉神经元中表达10。

对嗅上皮典型冰冻切片进行 Kirrel2 免疫染色，结果显示 Kirrel2 定位于轴突、胞体和树突中（图 2A）。所有溶液的配制均如上文所述，采用 en face 制备技术进行。尽管部分标记出现在由树突 knob 构成的层上方，但通过冰冻切片分析仍难以确定 Kirrel2 是否定位于纤毛。某些神经元在其嗅结节内部及周围呈现染色，但单根纤毛难以分辨。相比之下，按照上述方案制备的嗅上皮 en face 样本则明确显示了 Kirrel2 的纤毛定位（图 2...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本方案中描述的en face制备技术为嗅觉系统的详细分析提供了一种强有力的工具。迄今为止，大多数关于信号蛋白定位特征的研究均采用冷冻切片的免疫染色方法。该方法能够较好地展示嗅上皮的整体结构，不同细胞类型或区域中的蛋白表达也易于识别。然而，嗅纤毛中的表达有时难以检测。即使纤毛定位明显，冷冻切片也难以全面呈现纤毛层的形态结构。en face制备则为观察上皮提供了另一种视角。

本文所述的嗅觉上皮制备方法特别适用于研究在少量嗅觉神经元中表达的蛋白质。在此情况下，单个嗅球结构清晰可辨，因此可方便地分析蛋白质在嗅球及延伸纤毛中的定位。与冷冻切片中信号蛋白的染色相比，该方法能够确定每个嗅球上的纤毛数量以及纤毛的长度。此外，en face 制片可实现蛋白质沿纤毛的精确定位。还可分析蛋白质是否在纤毛膜上均匀分布。此外，可研究施加气味配体后蛋白质定位的变化。另一个应用方向是研究发育过程中蛋白质定位的动态变化。我们不仅在成年小鼠的 en face 制片中获得了良好的结果，也在直至 E18 阶段的幼龄动物中取得了理想效果。

<...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由德国研究基金会 DFG（Exc257，SFB958）资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
弹簧剪直头，多个供应商
手术剪尖头和钝头，多个供应商
精细镊子弯头，Dumont #7，多个供应商
剃须刀片超薄型，多个供应商
带照明的双目显微镜多个供应商，Stemi 2000-C，Zeiss
培养皿多个供应商
液阻笔Science ServicesN71310
多聚赖氨酸包被载玻片Thermo ScientificJ2800AMNZ
共聚焦显微镜Leica MicrosystemsTCS SPE
一抗 Goat anti-Kirrel2R&D SystemsAF29301:200
一抗 Rabbit anti-mOR-EGBaumgart et al., 20141:200
二抗Life TechnologiesA21206, A110571:500
封片剂，ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂Life TechnologiesP36930
多聚甲醛Sigma441244有毒，需在通风橱中操作

参考文献

  1. Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
  2. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
  3. Wong, S. T., et al. Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice. Neuron. 27 (3), 487-497 (2000).
  4. Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. Mice deficient in G(olf) are anosmic. Neuron. 20 (1), 69-81 (1998).
  5. Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17 (4), 681-693 (1996).
  6. Reisert, J., Lai, J., Yau, K. W., Bradley, J. Mechanism of the excitatory Cl- response in mouse olfactory receptor neurons. Neuron. 45 (4), 553-561 (2005).
  7. Hengl, T., et al. Molecular components of signal amplification in olfactory sensory cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 6052-6057 (2010).
  8. Smith, D. W., Thach, S., Marshall, E. L., Mendoza, M. G., Kleene, S. J. Mice lacking NKCC1 have normal olfactory sensitivity. Physiolog., & Behavior. 93 (1-2), 44-49 (2008).
  9. Menco, B. P. Ultrastructural aspects of olfactory signaling. Chemical Senses. 22 (3), 295-311 (1997).
  10. Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127 (5), 1057-1069 (2006).
  11. Baumgart, S., et al. Scaffolding by MUPP1 regulates odorant-mediated signaling in olfactory sensory neurons. Journal Of Cell Science. 127 (11), 2518-2527 (2014).
  12. Strotmann, J., Wanner, I., Krieger, J., Raming, K., Breer, H. Expression of odorant receptors in spatially restricted subsets of chemosensory neurones. Neuroreport. 3 (12), 1053-1056 (1992).
  13. Jenkins, P. M., McEwen, D. P., Martens, J. R. Olfactory cilia: linking sensory cilia function and human disease. Chemical Senses. 34 (5), 451-464 (2009).
  14. Tadenev, A. L., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome protein-8 (BBS8) perturbs olfactory function, protein localization, and axon targeting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (25), 10320-10325 (2011).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

嗅觉纤毛嗅觉上皮免疫荧光显微镜蛋白质定位小鼠嗅觉系统纤毛可视化组织解剖固定方案抗体染色
小鼠主嗅觉系统中纤毛的全组织染色标记
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。