本文报道了一种利用活体显微成像结合特定图像采集与分析方法，对小鼠肝脏血管系统中单个血管内血流速度进行动态测量与定量的详细实验方法。
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摘要
摘要
活体显微成像（IVM）是一种强大的光学成像技术，可实现在活体动物中实时可视化、监测和定量多种生物学事件。该技术极大地促进了我们对特定器官中生理过程及病原体介导现象的理解。
在本研究中，IVM 应用于小鼠肝脏，并设计了成像方案 体内 肝脏的循环系统，并测量单个肝血管中红细胞（RBC）的流速。为了可视化表征肝脏器官的不同血管亚型并进行血流速度测量，通过静脉注射将一种荧光血浆试剂注入C57Bl/6小鼠体内，以标记与肝脏相关的血管系统。IVM能够 体内 实时测量特定目标血管中红细胞的流速。建立该方法将有助于在生理和病理条件下研究肝脏血流动力学。最终，这种基于成像的方法对于研究各种因素对肝脏血流的影响具有重要意义。 L. donovani 感染 关于肝脏血流动力学。
该方法可应用于其他感染模型和小鼠器官，并可通过量化药物对血流的影响，进一步扩展至药物抗炎效应的临床前测试。
引言
器官特异性的血流动力学是任何哺乳动物器官的重要生理特征。血流异常可能是炎症的结果，也是器官功能障碍的征兆。1因此，血流的组织、结构和功能在生理和病理条件下的分析中显得至关重要。目前常用于分析特定器官血流的技术存在若干局限性，包括技术本身的空间分辨率限制（例如 多普勒血流成像），仅测量绝对血流量的能力（单位时间内供应器官的血液体积）（例如 光学相干断层扫描及在大量异质性血管群体中测量平均流速变化2,3肝脏的循环系统连接着在大小、结构和功能上具有异质性的不同血管亚型。本研究应用活体显微成像（IVM）技术评估肝脏血流动力学 体内 实时、高分辨率、并行地揭示构成肝脏器官的单个血管的特征。这一强大光学成像技术的最新发展使研究人员能够在高空间和时间分辨率下采集活体动物的动态数据。通过实现对特定且快速生物过程的直接可视化和实时监测 体内, IVM 为研究者提供了独特的机遇，可对单个血管进行成像，并对特定选择的肝血管内单个红细胞（RBC）的速度进行测量与定量分析。
在本研究中，我们已在小鼠肝脏中应用活体显微技术（IVM），以探究嗜肝性Leishmania寄生虫感染对肝脏血流动力学的影响。L. donovani是引起内脏利什曼病的病原体，该病是一种严重疾病，其特征为急慢性叠加的炎症反应，并累及多个器官，包括脾脏和肝脏。在内脏利什曼病的小鼠实验模型中，肝脏感染可自行消退，而脾脏感染则呈进行性发展4。 目前，Leishmania感染在不同器官中呈现不同结局的机制尚未完全阐明。在病理条件下对肝脏和脾脏血流动力学的研究将有助于进一步揭示宿主与寄生虫之间的相互作用及疾病发生机制。
我们的实验模型系统基于对接受静脉注射特异性荧光染料以标记肝内血管系统的麻醉小鼠进行肝脏暴露和成像。肝脏是活体显微观察的理想器官。在腹部做一小切口后，将肝脏轻柔地外置，置于湿润的纱布上，随后放置于盖玻片上，以尽量减少由心跳和呼吸引起的各种运动伪影。 然后将肝脏置于显微镜物镜视野内。与脾脏和淋巴结等需要使用双光子显微镜进行活体显微（IVM）研究的器官相比，肝脏的优势在于其均一的三维结构/解剖特征，使得可以使用常规共聚焦显微镜进行活体显微成像，其最大穿透深度约为 50 μm5-8。
本研究描述了两种独立的成像方法，用于定量测量单个血管中红细胞（RBC）速度和血流速度。第一种方法采用随时间连续采集的xy二维模式获取肝脏血流图像。所得的xyt数据通过免费的ImageJ软件中的MtrackJ插件进行分析，该插件可实现对单个红细胞随时间运动的追踪。第二种方法选择单个血管，利用共聚焦激光扫描显微镜的线扫描快速采集模式分析其相应的血流情况。对目标血管沿其中心轴向进行高频轴向线扫描，根据未标记的暗色红细胞与荧光标记血浆之间的对比度差异来量化血流速度。将线扫描过程中获取的红细胞和血浆的荧光强度随时间变化绘制成图，得到条纹图像，其条纹角度与单个红细胞的运动速度成正比。
本文的目的是提供一种简单且可重复的方法，用于成像和测量肝脏内单个血管中的血流速度，并提供成功实施小鼠手术、活体显微成像（IVM）以及单个红细胞流速定量分析所需的基本工具。该方法将使研究人员能够深入了解病理条件下血流速度的变化。
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方案
伦理声明：所有动物实验均按照法国艾克斯-马赛大学机构动物护理与使用委员会批准的指南和方案进行。8至10周龄的雌性C57Bl/6小鼠购自商业供应商，并依照法国《第2013-118号法令》（Décret N° 8 87–848，1987年10月19日，巴黎。所有使用 L. donovani LD1S 寄生虫的操作严格遵守法国及欧盟法律法规中的生物安全规定。
1. 小鼠感染 L. donovani 前鞭毛体寄生虫
- 制备培养基 体外 维持 L. donovani 前鞭毛体寄生虫，LD1S（MHOM/SD/62/1S-CL2D）。
- 使用M199培养基。在M199培养基中添加10%胎牛血清（56℃热灭活） °C 下孵育 30 分钟），25 mM HEPES（pH 6.9），12 mM NaHCO₃31 mM 谷氨酰胺，RPMI 16040 维生素混合物，10 mM 叶酸，100 mM 腺苷，7.6 mM 血红素，50 U/ml 青霉素和 50 mg/ml 链霉素。
- 在26°C下，将LD1S寄生虫培养于10 ml完全M199培养基中 °C，置于25 cm²培养瓶中2 通风烧瓶
- 通过连续差速离心步骤，制备富含前循环型的前鞭毛体寄生虫群体。
- 收获对数中期的寄生虫培养物。使用血细胞计数板进行计数。重悬为 5 x 105 在10 ml完全M199培养基中接种每毫升含一定数量的寄生虫。在厌氧条件下培养寄生虫，直至其进入晚期稳定期（约5-6天）。
- 在26℃下，以1,200 × g离心LD1S培养物10分钟 °C，以沉淀非后循环型寄生虫，收集上清液并再次在26℃下以2,500 × g离心 °10 分钟，4℃
注意：此最终沉淀物中富含前鞭毛体的代谢循环期寄生虫。 - 将沉淀重悬于 100 µ加入 PBS。取少量等分试样，用 25% 戊二醛按 1:100 体积比进行固定，使用血细胞计数板计数寄生虫。
- 将富集的后循环型寄生虫群体稀释至 1 x 107/100 µl 磷酸盐缓冲液中。使用带有30 G针头的1 ml注射器，将寄生虫悬液注入麻醉小鼠的尾静脉（见下文）。对于对照动物，注入100 µl PBS 注入尾静脉。
2. 手术操作
- 使用生物杀灭性消毒喷雾对工作区域进行消毒，并用70%乙醇对所有外科器械消毒30分钟。
- 根据动物体重配制麻醉溶液，其中包含125 mg/kg的氯胺酮（Ketamine）和12.5 mg/kg的赛拉嗪（Xylazine），用PBS稀释。
- 称量小鼠体重，使用带有30 G针头的1 ml注射器，腹腔注射相应剂量的麻醉剂。
- 保持小鼠体温，并在继续操作前通过捏压足垫确认小鼠已完全麻醉。每60分钟追加注射一次半剂量的麻醉溶液。
- 剃除小鼠腹部毛发，并用Vetedine清洁。在腹部左侧胸廓下方的皮肤和肌肉上做一个小切口。
- 在切口区域下方的腹部放置一块湿润纱布，暴露肝脏并将其置于纱布上，再用另一块湿润纱布覆盖肝脏。
- 将一块尺寸为24 × 60 mm2、厚度为150 µm的盖玻片（用氰基丙烯酸酯粘合在金属框架上）放置于肝脏表面，以便在显微镜下观察。
- 用湿纱布覆盖小鼠眼睛以保护眼部。
- 成像结束后，通过颈椎脱位法处死麻醉状态下的动物。
3. 肝脏结构的活体显微成像
- 在配备有温控培养室、63倍油甘油浸没式复消色差物镜（数值孔径1.4）、氩离子激光器（488 nm）、氦氖激光器（543 nm，633 nm）以及蓝色二极管激光器（405 nm）的倒置共聚焦显微镜上进行活体显微成像实验。
- 将小鼠放置于显微镜载物台上，使覆盖肝脏的盖玻片朝下紧贴物镜。将培养室温度设定为29 °C。利用肝脏自发荧光调节焦距，以清晰观察肝窦状隙结构。
- 为观察血管系统，每只小鼠准备一份将500 µg BSA-Alexa 647溶于100 µl PBS中的溶液。使用1 ml注射器配合30 G针头，将该溶液经尾静脉静脉注射至麻醉小鼠体内。
- 为观察肝细胞核，配制Hoechst 33342的PBS溶液。使用1 ml注射器配合30 G针头，按每公斤小鼠体重8 mg的剂量，将该溶液腹腔注射。
- 采用常规顺序扫描模式，使用63倍浸没物镜及400 Hz扫描速度对肝细胞核和肝脏血管系统进行成像。开启405 nm蓝色二极管激光以激发Hoechst，开启633 nm激光以激发BSA-Alexa 647，同时开启488 nm氩离子激光，并设置较宽的信号采集波段以观察肝脏自发荧光。
4. 用于血流速度测量的肝脏活体显微成像
- 打开显微镜的 LAS 软件（LAS-AF Viewer 版本 3.1.0 build 8587）。启动显微镜软件时，选择共振扫描模式。
- 点击配置选项卡以设置硬件。点击激光器并选择 HeNe 633 激光器。点击设置并选择 12 位分辨率。
- 点击采集菜单。在光路设置窗口中，选择 63X 物镜，并将 633 激光器功率设置为 100%。通过在 PM1-3 下拉菜单中选择 Alexa-633，激活信号增益和偏移参数。
- 在采集选项卡中，选择“xyt”采集模式。将格式宽度设置为 1,024 × 1,024。选择扫描速度为 8,000 Hz。选择针孔大小为 3 个艾里单位。设置放大倍数为 3。不要选择双向扫描模式。
5. 使用 xyt 图像对红细胞速度进行定量分析（方法 1）
- 点击“Live”图标以实时模式观察血流情况。选择感兴趣的区域，并选定特定血管进行分析。通过调整USB控制面板上的“X”、“Y”坐标及扫描视野旋转角度，将目标血管调整至水平位置。
- 当目标血管调整到位后，停止“Live”模式。在采集模式设置窗口中，将格式设置宽度改为1,024 × 256，线平均值 = 1，帧平均值 = 1，选择“stacks”为150。点击“start”开始采集图像。
- 为使用“xyt”图像对红细胞（RBC）速度进行定量分析，请打开ImageJ软件。在ImageJ中选择“File”选项卡，点击“Open”，然后选择所需文件。
- 进入ImageJ的“plugin”菜单，选择LOCI和Bio-formats导入选项。在此窗口中，将堆栈查看参数设置为“hyperstack”，在堆栈顺序选项中选择“xyzct”。注意：此操作将打开一个包含所有采集序列的窗口。
- 在ImageJ菜单中点击“Plugins”，选择MTrackJ选项。在弹出的小窗口中点击“add”图标，然后点击待追踪的红细胞。在后续每一帧中点击同一红细胞，并点击“measure”图标以测量其速度。
注意：生成的文件可保存为.exl格式。 - 每条血管至少追踪五个红细胞，并至少分析三条相同尺寸的独立血管。
6. 使用 xt 线图像对红细胞速度进行定量分析（方法 2）
- 点击“Live”以实时模式观察血流情况。选择特定血管进行分析。将目标血管调整至水平位置。在设定好目标血管后，停止“Live”模式。
- 选择“xt”扫描模式，并将所选血管的中心管腔对准线扫描路径。设置图像格式为1,024 × 512，扫描速度为8,000 Hz，线平均值为32，时间为512。点击“start”以获取xt线扫描图像。
- 通过打开.lif文件并选择感兴趣的xt线图像，生成用于红细胞速度定量分析的条带图像。在LAS-AF软件中，选择“experiments”，打开.lif文件并选择相应图像。注意：系统将自动打开一张显微运动图（kymograph）。
- 在该显微运动图上，测量一个粒子条带（表现为暗色反射）移动一定距离（d，X轴所示）所需的时间（t，Y轴所示）。选择“draw line”工具，并沿条带水平画一条线。记录图像底部结果栏中显示的距离（单位：µm）和时间（单位：秒）。
- 利用显微运动图获得的数值，按公式 V = 距离/时间 计算速度。
- 每张xt图像至少量化五个粒子条带，且至少分析三条相同尺寸的独立血管。
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结果
基于肝脏的自发荧光特性（图1，B和C图，绿色）、腹腔注射Hoechst标记肝细胞核（图1B，蓝色）以及静脉注射荧光标记BSA染色肝循环系统（图1C，红色），可清晰观察到肝脏中窦状隙的特定结构组织。肝脏由多种不同功能、结构和尺寸的血管亚型组成，其直径（D）范围为40–700 μm2（小血管直径为40–80 μm2，大血管直径超过300 μm2）。通过活体显微成像技术可高分辨率地观察肝脏血管系统的异质性与复杂性（图1C）。
为了监测单个血管中的血流速度，采用两种不同的方法对活体肝脏血管进行图像采集和数据分析。in vivo。第一种方法使用xyt扫描模式对目标血管中的血流进行实时成像（影片 1）。利用ImageJ软件中的MTrackJ插件对单个血管内单个红细胞（RBC）的速度进行定量分析（图 2A 和 <...
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讨论
小鼠肝脏活体显微技术的最新发展为研究感染在体内的生理反应以及实时动态提供了新的可能性体内和 实时5,9,10。器官血流是许多疾病中常发生改变的关键生理参数。 然而，肝脏在生理状态及感染条件下的血流动力学状态仍是一个研究较少的领域。本研究采用基于活体显微成像（IVM）的方法，此前该方法已被用于脾脏和肿瘤血管系统的研究，现被应用于定量单个血管内的肝脏血流速度，并在体内测量单个红细胞的速度11,12。本研究所用方法依赖于静脉注射小鼠体内的一种血浆荧光标记物（如荧光标记的BSA）与保持暗态的红细胞之间的对比度。体内血流测量有望加深我们对疾病过程的理解。
本文采用并比较了两种用于测量肝脏血管血流的方法。第一种方法在数据分析上耗时且繁琐，需要使用者借助 ImageJ 软件中的 MTrackJ 插件，手动追踪单个血管中红细胞的运动。第二种方法则更为简便快捷，其核心是对通过共振扫描模式进行线扫描采集所生成的 xt 图像中的血管进行分析。对于相似的血管，这两种方法所得数据具有可比性。...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由法国国家健康与医学研究院（INSERM）、艾克斯-马赛大学以及CL Forestier获得的国际人类前沿科学计划组织（HFSPO）职业发展奖资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| 500 分子量 FITC 标记葡聚糖 | SIGMA | 46947 | |
| 氯胺酮 | PanPharma | 20434 | |
| 赛拉嗪 | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| 氰基丙烯酸酯液体 | Cyanolit | 5833300005 | |
| 盖玻片框架：显微切割用膜片，部件编号 N°：5013 | Molecular machines | 50103 | |
| DiaPath 24×60 盖玻片，厚度：1.6 mm | DiaPath | 61061 | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Leica | TCS-SP5 | |
| LAS-AF 查看器 | Leica 软件 | 版本 3.1.0 构建 8587 |
参考文献
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