体外 小鼠结直肠传入末梢的功能表征

摘要

本视频演示了一种在单根神经纤维上进行电生理记录的实验方案 体外 小鼠结直肠-神经制备

摘要

本视频详细演示了一种 体外 使用小鼠结肠-神经制备物的单纤维电生理记录方案。该方法可无偏倚地识别并进行单个结肠传入神经的功能表征。通过细胞外记录方式获取源自一个或少数几个传入神经的传播性动作电位（APs）。即， 单纤维）感受野（RFs）通过分离神经纤维束获得。结肠直肠标本连同盆神经（PN）或腰内脏神经（LSN）一并切除，并沿纵轴切开。将组织置于记录腔室中，展平并用氧合的克雷布斯（Krebs）溶液持续灌流。采用局部电刺激定位结肠直肠传入末梢，并通过三种不同的机械刺激（钝性探压、黏膜刷拭和环形牵张）对其进行测试，以将传入纤维功能分类为五种机械敏感类型。对上述机械刺激均无反应的末梢归类为机械不敏感传入纤维（MIAs）。机械敏感性传入纤维和MIAs均可用于评估致敏性（即， 增强的反应、降低的阈值和/或通过将感受野局部暴露于化学物质而获得的机械敏感性）例如， 炎症性混合液（IS）、辣椒素、三磷酸腺苷（ATP）。本文描述了相关设备及结肠直肠–神经记录制备方法，包括带附着的盆神经（PN）或腰骶内脏神经（LSN）的结肠直肠组织获取、结肠直肠内感受野（RF）的定位、神经束单纤维记录，以及化学物质在感受野的局部应用。此外，还讨论了该制备方法中的技术难点以及标准化机械刺激应用的相关挑战。

引言

疼痛和感觉过敏是功能性胃肠道疾病患者的主要主诉，包括肠易激综合征（IBS），这些症状在无明显病理生物学原因或组织损伤的情况下存在。例如，IBS 患者表现出感觉过敏，包括对直肠气囊扩张的反应增强、在正常肠道功能期间敏感性增加，以及躯体牵涉性过敏（即 腹部区域触诊时压痛）¹。由于靶向结直肠传入神经已被证明可有效缓解 IBS 患者的疼痛和感觉过敏（例如 直肠内给予局部麻醉剂^2,3；口服鸟苷酸环化酶-C 激动剂利那洛肽^4-6），因此加深对结直肠传入神经支配的理解具有重要意义。

内脏传入神经，包括结直肠传入神经，能够对化学/营养物质和温度刺激产生反应（例如，^7-9）。然而，对机械刺激（即，机械敏感性传入神经）发生反应的内脏传入神经被研究得最为深入，因为机械刺激（例如，管腔扩张、牵拉）通常是引发意识感知（包括不适和疼痛）的主要原因^10-16。此外，内脏还受到机械不敏感传入神经（MIAs）的支配，这类神经通常被称为“静息性”或“休眠性”伤害感受器¹⁷。在正常的生理条件下，MIAs 对机械刺激无反应或反应阈值极高¹⁸，但在病理生理状态下可被激活并获得机械敏感性，从而参与痛觉过敏的形成。

使用 体外 根据此处所述的制备方法与实验方案，我们开发并采用了一种电刺激策略来搜寻感受性末梢，从而能够无偏倚地识别结直肠中的机械敏感性末梢和MIA末梢¹⁹结直肠的神经支配来源于腰交感神经（LSN）和盆神经（PN）通路，包括可划分为五类机械敏感性传入纤维（浆膜型、黏膜型、肌层型、肌层-黏膜型、肠系膜型）以及一类MIA传入纤维²⁰. 使用这种方法 体外 制备过程中，我们发现结直肠机械不敏感传入纤维（MIAs）在短暂暴露于炎症混合物（IS）后获得了机械敏感性。该处理使盆神经（PN）通路中71%的MIAs发生致敏，以及下腹神经（LSN）通路中23%的MIAs发生致敏。¹⁹我们还记录了在长期行为性内脏高敏感性背景下，MIAs的长期致敏现象（长达28天）。即， 在经结肠内给予酵母聚糖治疗的小鼠中²¹ 或2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）²²).

在机械敏感性传入神经中，肌层和肌层-黏膜传入神经是唯一能够持续编码结直肠周向牵张的类别（即， 对拉伸敏感）并介导有害性结直肠扩张的编码^23,24使用计算机控制的力致动器，我们对展平的结直肠组织沿周向施加了标准化、均一且可重复的渐进式拉伸，并进一步将对拉伸敏感的传入神经分为低阈值和高阈值两类²³此外，还研究了结肠内注射酵母聚糖后牵张敏感传入神经元致敏作用的时间进程²¹ 或TNBS²² 治疗对应于行为性内脏高敏感性的起始、持续和/或恢复，提示牵张敏感性结直肠传入神经在内脏痛和内脏高敏感性中的作用。

方案

注意：本方案已通过匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会的审查与批准。

1. 改良克雷布斯溶液和测试药物等分试样的制备

1. 配制6 L改良Krebs溶液，其成分如下（单位：mM）：117.9 NaCl，4.7 KCl，25 NaHCO₃₃, 1.3 NaH₂PO₄，1.2 MgSO₄₄，2.5 CaCl₂11.1 D-葡萄糖，2 丁酸钠，20 醋酸钠，0.004 硝苯地平（用于阻断自发性肌肉收缩），以及 0.003 吲哚美辛（用于抑制内源性前列腺素的合成）。组织解剖使用冰冻的克雷布斯液，单纤维记录使用温热的克雷布斯液。
2. 配制任何化学溶液（例如， IS、辣椒素（capsaicin）、ATP）按所需浓度分装。

2. 结肠直肠-神经组织的解剖

1. 将雄性小鼠（6 - 8 周龄，20 - 30 g）置于 CO₂ 麻醉/安乐死舱中，气体流速设定为每分钟置换舱内体积的 10 - 30%，直至小鼠完全停止呼吸，以胸壁运动完全消失为准。
2. 安乐死后立即行放血操作：切开胸腔，穿刺右心房，并将小鼠尸体浸入足量（约 500 ml）冰浴（4 °C）、持续通入碳合气（95% O₂，5% CO₂）的 Krebs 溶液中。
3. 小心去除除结肠及盆腔器官外的所有内脏组织。在略高于膈肌的 T12 脊髓节段处将小鼠身体横断，将尾侧半段转移至盛有冰浴、通碳合气 Krebs 溶液的解剖腔室中。
4. 在体视显微镜下，于膀胱和生殖器官与尿道连接处进行横断以将其去除，并游离腹主动脉至其分叉为左右髂总动脉处。通过钝性分离松解 PN 或 LSN 与其周围组织，沿髂嵴外侧追踪神经，直至其从前侧进入 L6 和 S1 脊柱节段（PN）或 T13 和 L1 脊柱节段（LSN）的位置。
5. 切断耻骨联合以及左右髋臼关节，去除髂骨。小心地从靠近直结肠处开始，将 PN 或 LSN 从附着的肌肉和结缔组织中游离，直至神经进入脊柱的入口处。
6. 进一步切除髂骨以暴露远端直结肠。连续完整地解剖出远端直结肠及其附着的 PN 或 LSN。
7. 将带有神经附着的直结肠转移至组织浴槽的灌流腔室中。通过进一步解剖去除多余的结缔组织，并沿对系膜缘纵向剖开直结肠。
8. 将直结肠黏膜面朝上，用针固定其系膜侧边缘于腔室硅胶基底上，靠近记录腔室一侧；将对系膜侧的直结肠段连接至与力传感器相连的钩状支架（如 图 1 所示，图 2A 所示为实物照片）。
9. 将 PN 或 LSN 延伸至记录腔室，该腔室通过小鼠孔和闸门与灌流腔室相连。轻柔地将神经干置于记录腔室内的小玻璃镜面上，该镜面提供亲水表面以利于神经附着。以温热（30 - 32 °C）、含氧 Krebs 溶液持续灌流灌流腔室，并在记录腔室内填充石蜡油。

3. 单纤维记录及感受野定位

1. 在体视显微镜下以高倍放大（50 - 60X）小心剥离坐骨神经（PN）或下腹下神经（LSN）的神经外膜（神经鞘）。使用精细镊子将神经干分离成5 - 8束直径约100 µm的神经束。
2. 将铂铱参考电极与组织浴槽中的Krebs溶液接触。依次将各神经束放置于由相同材料制成的记录电极上。
3. 使用柔软的画笔轻轻上下刷拭结肠直肠表面，以诱发结肠直肠传入神经的动作电位（AP）。通过可检测到的动作电位（AP）记录，定位支配结肠的神经束。
   注意：PN和LSN还支配膀胱及其他盆腔器官。
4. 使用一对30 G针尖进一步将神经束分离为直径约10 µm的细小束膜纤维，并将单根纤维置于记录电极上。
5. 将圆头同心电极垂直置于黏膜表面，以超阈值刺激强度（10 mA，0.5 msec持续时间，频率0.3 Hz）电刺激传入末梢，产生约2 mm半径的电流扩散。沿展平的结肠直肠长度和宽度方向系统移动电极（步进约1.5 mm），以定位感受野末梢。
6. 当传入末梢被激活时，调整电极位置以精确定位所需刺激强度最小的激活位点（感受野，RF），即刺激阈值。弃用刺激阈值>3 mA¹⁹的末梢。
7. 根据以下两项计算传导速度（CV）：1）感受野（RF）处刺激电极与记录位点之间的距离；2）刺激伪迹与动作电位起始之间的传导延迟（例如，图2B）。
   CV（m/sec）= 距离（mm）/ 传导延迟（msec）。

4. 机械敏感性结直肠传入神经的功能分类

1. 通过电刺激定位到感受野（RF）后，对RF施加以下三种机械刺激：
   1. 使用校准的类似von Frey的尼龙单丝（0.4 和 1 g 力）垂直按压扁平化结肠直肠上的RF，进行探触刺激。
   2. 使用细尼龙丝（10 mg 力）轻轻划过结直肠黏膜，对RF产生轻微的表面剪切应力，进行拂刷刺激。
   3. 使用计算机控制的力致动器沿结肠直肠对系膜缘，通过步骤 2.8中所述的钩耙装置施加环向牵张，产生梯度增加的牵张力（0 - 170 mN，以5 mN/sec速率递增）。
2. 根据反应特征将传入神经分类为：仅对钝性探触有反应的浆膜型、对黏膜拂刷和钝性探触均有反应的黏膜型、对环向牵张和钝性探触有反应的肌层型、对环向牵张、黏膜拂刷和钝性探触均有反应的肌层-黏膜型，或对上述三种机械刺激均无反应的MIA型（机械不敏感传入神经）。
3. 对于主要分布于LSN支配区域且难以通过电刺激选择性激活的肠系膜传入神经，可通过机械性拂刷或探触肠系膜来定位其感受末梢。
4. 对于牵张敏感的传入神经（肌层型及肌层-黏膜型），测定其反应阈值，定义为在梯度牵张过程中引发首个动作电位（AP）所需的力值。
5. 对于浆膜型传入神经，记录其在计算机控制的力致动器驱动下，对感受野施加递增强度的点状探触刺激所产生的反应。

5. 感受末梢的化学应用/调节

1. 记录对机械刺激的基线反应（即， 对梯度拉伸、点状探压或黏膜刷拭的反应。
2. 将一段管材（黄铜或不锈钢，高10 mm，4 × 4 mm）的底边涂覆² 用凡士林密封方形或直径4-5 mm的区域，并将其置于结肠直肠的感受野上。
3. 移除管路内的克雷布斯液，将感受末端暴露于含有待测化学物质的溶液中 3 至 5 分钟，溶液体积为 170 μl。
4. 在化学物质施加期间监测传入神经的反应（某些传入神经具有化学敏感性）。
5. 移除化学溶液及管路以终止化学作用。在4至6分钟内，用与基线反应相同的机械刺激测试传入反应。
6. 在充分洗脱后，再次施加机械刺激>15 分钟。

6. 记录和区分动作电位尖峰

1. 以 20 kHz 的频率对从轴突记录的电信号进行数字化，并将数据保存至计算机。通过音频监视器实时监测信号。
2. 离线分析动作电位（AP）峰电位，并基于单个峰电位波形的主成分分析来区分单个神经元单位²⁵。
   注意：一个记录中应包含不超过两个易于区分的活跃单位。

结果

实验装置如图1所示。该装置包含一个定制的组织浴槽，其硅胶衬里的浴室部分用于容纳结肠直肠组织，相邻的矿物油填充室则用于放置与其相连的神经。双室浴槽由一整块丙烯酸塑料经数控机床加工而成；两个腔室的底部均衬有坚固的硅胶，以便于将结肠直肠组织固定。从分离的神经束中记录的细胞外动作电位（APs）通过一台低噪声、电池供电的差分放大器进行采集，该放大器具有高共模抑制比（CMRR ~ 60 dB）。放大器增益设置为10,000倍，带通滤波范围为0.3至10 kHz。结肠直肠的电刺激通过一个光耦合刺激器以恒流模式输出，经由与结肠直肠黏膜接触的同心电极传递。机械刺激（结肠直肠牵张和点状探压）则由计算机控制的力致动器施加。模数转换器（A-D转换器）及配套软件通过发送电压指令信号，控制机械和电刺激的启动，同时记录并数字化来自差分放大器的细胞外动作电位信号。为避免机械和电噪声干扰，组织浴槽、显微镜和差分放大器均置于安装在气浮平台上的法拉第笼内。

如图2A所示，从小鼠体内分离出带有附着神经的结肠直肠组织，沿对系膜缘剪开，展平并固定在硅胶衬里的...

讨论

该 体外 此处描述的结肠-直肠神经制备方法已被证明是研究单个结肠直肠传入神经神经编码功能的有力手段，可很好地补充其他非功能性研究方法例如， 细胞、分子和组织学研究）对内脏感觉神经元（参见综述 ²⁷ 有关细节，请参见正文）。参与伤害感受及长期结直肠高敏感性的神经机制已被揭示，并已开展药理学干预实验，明确了可能缓解内脏疼痛的作用靶点。以下将讨论成功实施该实验准备工作的几个关键要点：1）降低电噪声干扰；2）提高信号检测灵敏度；3）选用标准化刺激以评估传入信号编码的变化。此外，本文还讨论了该技术的若干局限性。

沿神经轴突在细胞内传播的动作电位（APs）通常具有100 - 130 mV的跨膜电位。然而，由于轴突膜的比电容较小，这种相对较大的去极化仅导致跨细胞膜的微小电荷位移，该电荷极易消散到周围的细胞外组织/间质液中（其电导率远低于脂质膜）。在对神经细丝/轴突进行细胞外记录时，电信号通常处于微伏级别，接近典型生物电信号记录系统中热噪声/白噪声的幅度，因此成功记录的首要任务是降低噪声。为了最有效地屏蔽环境电噪声，可将组织浴槽、记录电极和...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Leica MZ16 体视显微镜	Leica Microsystems Inc.
Leica IC D 相机	Leica Microsystems Inc.
放大器	World Precision Instruments, Inc.	SYS-DAM80	低噪声差分放大器
双室组织浴槽	定制
Power1401	Cambridge Electronic Design Limited	Power1401	数据采集，模拟信号输入/输出
Spike2 v5.02	Cambridge Electronic Design Limited		与 Power1401 配合使用的软件包
音频监测器	Natus	Am 8
方波脉冲刺激器	Natus	S48	用于施加电刺激
光电隔离单元	Natus	PSIU6	刺激隔离以降低噪声
同心双极微电极	FHC Inc.	CBFFG75	用于施加电刺激
双模式杠杆系统	Aurora Scientific Inc.	Series 300C	用于施加机械刺激
镊子	Fine Science Tools	11252-00	尖端精细的镊子