该技术的目的是使研究人员能够对任意年龄的黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）蛹眼碟进行解剖、免疫染色和封片操作。
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摘要
摘要
黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的复眼原基是一个强大的研究系统，可用于研究多种不同的生物学过程。它包含约800个独立的眼单位，称为小眼（ommatidia）1。每个小眼包含八个神经元型感光细胞，这些细胞在三龄幼虫期形态发生沟（morphogenetic furrow）经过后，由未分化的细胞逐步发育而来2。在感光细胞依次分化之后，非神经元细胞也随之发育，包括晶锥细胞、色素细胞以及机械感受性刚毛细胞3。最终的分化过程，如所有小眼细胞类型的有序排列、未分化细胞类型的程序性死亡以及视紫红质的表达，主要发生在蛹期4-7。本技术聚焦于对蛹期复眼原基的操作，提供了解剖蛹期眼原基的详细指导与操作要点，该阶段的解剖难度明显高于常用的三龄幼虫眼原基解剖。此外，本技术还详细描述了免疫染色方法，以实现对多种蛋白质及其他细胞组分的可视化观察。
引言
发育生物学和细胞生物学领域深受模式生物黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的影响。在该模式生物中，对眼盘的研究已为信号传导、细胞生物学及其他领域贡献了大量知识。三龄幼虫晚期的眼盘已被广泛研究，是一个极具价值的模型，因为它能够呈现一系列发育阶段的快照，随着形态发生沟在眼盘上的推进，每个阶段都具有独特的信号分子和生物学过程8。然而，有必要进一步将我们对发育过程的理解拓展至蛹期。尽管已有针对蛹期眼盘的研究3-7，但相关知识的广度远不及对三龄幼虫眼盘的研究。这一差距部分源于蛹期眼盘解剖难度更大。因此，系统展示正确的解剖方法将有望极大推动该领域的研究进展。
尽管果蝇蛹眼盘发育的某些阶段（特别是在蛹期中期）较容易解剖，但其他时期的解剖则困难得多。本方案提供了一种适用于所有蛹期发育阶段的通用解剖方法。该方案可作为另一种方案9的替代方法，后者展示了从中蛹期样本中更简便、快速地解剖眼盘的技术。本方案最初由加州大学洛杉矶分校功能基因组学本科生研究联盟（URCFG）10,11为培训高年级本科生掌握蛹眼盘解剖技术而拍摄和开发。许多本科生已成功利用该视频和方法掌握了这一具有挑战性的技术。
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方案
该实验步骤需要两天时间完成。
第1天（2小时 + 解剖时间）
1. 蛹期眼盘解剖
- 选择一只蛹进行解剖。
注意：待解剖蛹的发育时间应根据实验需求确定。然而，若需观察细胞形态，通常选择在25 °C条件下蛹壳形成后42小时（APF）的蛹，视频中展示的即为此龄期的蛹。使用湿润的画笔收集白色蛹（定义为0小时APF），并按采集时间顺序将其排列于维持在25 °C的新鲜果蝇培养管中。解剖时也应按照此时间顺序进行，以尽可能减小各蛹之间的发育时间差异。 - 将蛹转移至置于硅胶解剖板上的一滴磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4，配方见材料部分）中。
- 用镊子夹住蛹壳顶端，用另一把尖头镊子刺穿并打开蛹壳下部。通过所形成的开口将蛹体从蛹壳中取出。
- 用剪刀在蛹的中胸部位进行斜向剪切。清除碎片，或将蛹头转移至新的一滴PBS中。根据需要使用吹管（详见材料部分及图1）吹洗清洁，并适时补充PBS。注意避免组织脱水。
- 用镊子牢固夹住蛹头角质层的顶部。使用吹管尖端轻轻推动蛹壳，使脑组织及其他组织（包括眼原基）从蛹壳中挤出。注意避免镊子夹到角质层内的组织。
- 用充满PBS的吹管轻轻吹出脂肪体及其他碎片，以清晰分离并识别脑组织和眼原基。
注意：保持脑组织与蛹头角质层相连，可使研究者利用角质层作为“手柄”对组织进行后续操作，避免损伤眼原基或脑组织。然而，脑组织和眼原基从角质层脱落也是常见情况，这并不会对整体实验过程和结果造成不利影响。通常需要多次吹打和推动，才能成功将眼原基和脑组织从蛹头角质层中完整分离，并使其与周围组织清晰分开。眼原基与周围组织分离得越干净、越彻底，越有助于防止无关组织附着于眼原基上。 - 解剖完成后，立即将组织转移至预冷的三孔玻璃培养皿中，加入0.5 ml固定液（见材料部分）。让组织漂浮在固定液表面数分钟（通常为解剖下一组眼原基所需的时间）。
注意：若本次解剖并非该轮操作中的第一对眼原基，请将之前解剖得到的眼原基完全浸入固定液中。若需进行特殊染色处理（例如，活性氧、溶酶体等检测），则必须在固定前完成。为此，应在继续相应染色方案前，将已解剖的眼原基保存在冰上预冷的PBS中。 - 在所有待解剖的眼原基完成解剖并浸入固定液后，将三孔玻璃培养皿置于摇床上，室温下振荡固定30分钟。
2. 免疫染色
- 小心移除固定液，加入 0.5 ml 含 0.3% Triton X-100 的 PBS 缓冲液（0.3% PBT，见材料部分），在摇床上清洗组织 10 分钟。重复此步骤三次，共洗涤 4 次（每次 10 分钟）。
注意：可在解剖显微镜下小心移除孔中的溶液，以防止组织损伤或丢失。可用移液器小心吸除溶液；我们推荐使用细尖的一次性转移移液器，并将其开口压平，以降低吸入组织的风险。 - 第 4 次洗涤结束后，移除洗涤液，向孔中加入 0.5 ml 封闭液（见材料部分），于室温孵育 30 分钟。
注意：可根据实验需要适当延长孵育时间。 - 30 分钟封闭结束后，用移液器将 10 μl 一抗溶液（用封闭液稀释）加入多孔板中相应数量的孔内。
注意：一个多孔板的单个孔可容纳约 4 对附着于蛹壳的眼盘组织，或 8 对分离的带脑眼盘组织。本实验方案中代表性数据所使用的一抗为抗磷酸化酪氨酸抗体（1:500 稀释）和抗 Cut 抗体（1:200 稀释）。 - 将解剖好的组织从三孔玻璃培养皿转移至已加入一抗溶液的多孔板孔中。
- 将多孔板置于铺有湿润纸巾的移液器吸头盒（或其他类似容器）中（以防止干燥），于 4 °C 过夜孵育。
第2天（4小时 + 封片时间）
- 将组织从微孔板转移至含有0.3% PBT的新3孔玻璃培养皿中（≈0.5 ml），在摇床上洗涤组织10分钟。重复此步骤三次，共洗涤4次（每次10分钟）。
- 去除最后一次洗涤液，向孔中加入0.5 ml封闭液。封闭30分钟。
注意： 此时间范围可根据您的需求延长。 - 移除封闭液，向孔中加入0.5 ml二抗溶液（使用与一抗相匹配且适合荧光波长的荧光标记抗体，用封闭液稀释制成），用盖子或铝箔将3孔玻璃培养皿避光覆盖，并在室温下孵育至少2小时。
注意： 所有后续步骤均应同样避免光照。此孵育步骤可延长至4℃过夜 °C，在类似于一抗孵育的条件下进行，但也可在覆有实验室封口膜的3孔玻璃培养皿或微量孔板中进行，若需节约抗体则推荐后者。 - 抗体孵育结束后，移除二抗溶液，向孔中加入0.5 ml 0.3% PBT，在摇床上洗涤10分钟。重复此步骤，共洗涤4次（每次10分钟）。
注意： 如果需要进行 DAPI 染色，在开始第一次洗涤之前，加入 0.5 μDAPI 储存液（见材料）至 500 μ用于第一次洗涤的 PBT 溶液（1:1,000 稀释）
3. 装载
- 最后一次洗涤结束后，使用70%甘油或PBS作为封片介质，将触角/眼原基组织置于载玻片上，并将脑组织及其他不需要的组织移至载玻片一侧的液滴中去除。
- 使用镊子间的流体静压力或镊尖极其轻柔地移动组织，将眼盘排列成一列，朝向载玻片中央。
- 用实验室擦拭纸的毛细作用或镊子将组织周围多余的甘油或PBS去除。
- 取少量（≈10 μ沿眼盘列的一侧滴加适量封片剂，将盖玻片置于组织上，使封片剂均匀覆盖眼盘。
- 让载玻片静置1至2分钟，使组织/封片介质充分展开。
- 用透明指甲油擦去盖玻片周围多余的封片剂并进行封固。
- 使用共聚焦显微镜捕获眼盘的荧光图像。
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结果
作为本实验方案应用的示例，图2展示了在25 °C条件下发育至中蛹期（出芽后42小时）的眼碟组织，经不同抗体免疫染色后的结果。图2A 使用针对磷酸化酪氨酸残基的抗体，可观察到细胞膜结构。该染色可用于识别在中蛹期之前完成最终模式形成后，小眼细胞在蛹眼中的规则排列。另一幅代表性图像（图2B）显示了使用针对Cut转录因子的抗体来识别锥形细胞的细胞核。
图1：解剖过程中所用吹管的组装示意图。 吹管各组件的详细信息请见材料部分。
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讨论
尽管这一过程看似简单易行，但实际上，要掌握该技术需要大量练习。通常情况下，我们会从指导学生学习解剖和制备三龄幼虫的 eye discs 开始12，操作起来要容易得多。这种练习有助于形成正确的手臂、手部和手指解剖姿势13 从而使解剖显微镜下操作镊子稳定、简便且得心应手。本质上，练习阶段应达到将镊子变为手指与拇指的自然延伸，能够完成解剖过程中所需的精细而微妙动作的目标。
如果使用 PBS 进行封片，务必准备额外的 PBS，因为在封片过程中少量 PBS 会迅速蒸发。另一个常见问题是眼盘在固定液中发生折叠，从而导致眼盘以此方向被固定。为避免此问题，可先将眼盘漂浮在固定液表面一段时间（通常为下一个眼盘解剖所需的时间），再将其完全浸入固定液中。
尽管其他已发表的技术主要关注在蛹期中期解剖蛹眼盘9当解剖操作较为简便时，该技术可适用于任何蛹期发育阶段，但围蛹成虫期或早期白蛹除外。我们认为，本技术为已发表的蛹期眼盘解剖方法提供了一种替代且互补的途径。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢霍华德·休斯医学研究所（Howard Hughes Medical Institute）授予U.B.的HHMI教授奖，该奖项使本项目得以实施。我们感谢加州大学洛杉矶分校学院为本研究提供了设施和教学基础设施支持。本工作还获得了中西部大学的资金支持以及慈善菲迪亚斯捐赠基金（Charity Fidelity Gift Fund）的慷慨捐助。我们感谢John VandenBrooks对稿件提出的宝贵意见，以及Krista Pearman在技术方面提供的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4） | 80 g NaCl，2 g KCl，14.4 g Na2HPO4，2.4 g KH2PO4，加液体至总体积为1 μl，调节pH至7.4，高压灭菌或过滤除菌，用灭菌去离子水稀释至1x PBS2使用前请置于 O。 | ||
| Triton X-100 | Promega | H5142 | 注意：有刺激性！请戴手套。 |
| 0.3% PBT | 1.5 ml Triton X-100，500 ml 1X PBS。 | ||
| 37% 甲醛溶液 | Fisher Scientific | F75P1GAL | 注意：有毒，可能对人体致癌！请佩戴手套。 |
| 固定液 | (≈4% 甲醛 PBS 溶液) 50 μ37%甲醛溶液，450升 μl 1× PBS，使用前新鲜配制 | ||
| 正常山羊血清 | Rockland 抗体 &和检测方法 | B304 | 分装为1 ml体积，于-80℃保存 °C |
| 封闭液 | PBT 中含 10% NGS 这可以制备并在4℃下保存 °使用前于 C 保存数天。 | ||
| DAPI 储存液 | Life Technologies | D3571 | 用于细胞核复染。用 ddH₂O 配制 1 mg/ml 的溶液2O. |
| VectaShield 封片剂 | Vector Labs | H-1000 | 封片剂 |
| 甘油 | Sigma | G5516 | 用于封片。用 ddH₂O 配制 70% 的稀释液。2O. |
| 设备 | |||
| 往复式混匀器 | VWR | 82007-202 | 用于在3孔玻璃培养皿中摇动组织 |
| Sylgard 182 硅胶弹性体试剂盒 | Krayden | NC9897184 | 用于制作硅胶解剖皿 |
| 硅胶解剖皿 | 按照说明小心混合Sylgard弹性体试剂盒（见上文），避免产生气泡。将混合物倒入任一尺寸的培养皿中，在37℃下静置过夜使其固化。 °C 培养箱 | ||
| 3孔玻璃培养皿 | 康宁 | 7220-85 | 3孔规格的此类产品已不再供应，此为9孔产品。 |
| 72孔微型培养板小托盘 | Nunc | 438733 | |
| 尖头镊子（Dumont #55） | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas型显微剪，直型，5 mm刀刃 | Ted Pella | 1346 | |
| 100 毫米硼硅酸盐玻璃毛细管 | World Precision Instruments | 1B100-4 | 用拉针仪拉制针头，以形成细尖端，使 PBS 能流出细小液流。 |
| 一次性移液管，细尖头 | Samco Scientific | 231 | |
| 所给出的管路尺寸为内径（ID）× 外径（OD）× 壁厚，单位为英寸 | |||
| PVC管（1/8 × 3/16 × 1/32） | Nalgene | 8000-0010 | 使用拉制好的针头按照图2所示组装吹管。 |
| Tygon 硅胶管（3/32 × 5/32 × 1/32） | 圣戈班高性能塑料 | ABW00004 | |
| Tygon 硅胶管（1/32 × 3/32 × 1/32） | 圣戈班高性能塑料 | ABW00001 |
参考文献
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