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利用多细胞模式生物 C. elegans 研究类朊病毒蛋白的扩散与毒性

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DOI：

10.3791/52321

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2015年1月8日

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1Department of Molecular Biosciences, Rice Institute for Biomedical Research, Northwestern University

通讯作者： Carmen I. Nussbaum-Krammer <c.nussbaum@zmbh.uni-heidelberg.de>

本文内容

摘要

蛋白质聚集体的朊病毒样传播最近被发现与多种神经退行性疾病相关。本实验方案的目的是介绍如何利用线虫 C. elegans 作为模式系统来监测蛋白质的扩散，并研究朊病毒样现象。

摘要

朊病毒是一类非传统的、可自我传播的蛋白质颗粒，不含任何编码核酸。这些蛋白质种子可作为模板，介导其良性细胞异构体的构象转换与复制。越来越多的证据表明，许多蛋白质聚集体可作为自我传播的模板，并诱导同源蛋白质发生错误折叠。尽管在某些情况下聚集体具有功能作用，但这一过程通常会破坏细胞内的蛋白质稳态（蛋白稳态），最终导致阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）或传染性海绵状脑病（TSEs）等毁灭性疾病。目前，关于朊病毒传播机制以及蛋白质聚集体在细胞间扩散的具体过程仍在深入研究之中。为了进一步推动该领域的认知，近期已建立了一种在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中表达酵母细胞质朊病毒蛋白Sup35朊病毒结构域的多细胞动物模型。该朊病毒模型具有多项优势，例如可在活体动物中直接监测荧光标记的朊病毒结构域，并便于开展遗传学研究。本文所述方法可用于研究蛋白质聚集体的类朊病毒行为，并利用C. elegans鉴定调控朊病毒诱导毒性的相关因子。

引言

许多神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）和传染性海绵状脑病（TSEs），均与易于聚集的蛋白质相关，因此统称为蛋白质错误折叠疾病（PMDs）。TSEs 或朊病毒疾病是一类独特的 PMDs，因其在人类和动物中均具有传染性1。在分子水平上，朊病毒通过招募并转化单体形式、富含α-螺旋的宿主编码细胞型PrP（PrPC）成为富含β-折叠的致病型PrPSc构象来实现自我复制2,3。自我传播的蛋白质聚集体也在真菌中被发现，其具有与哺乳动物朊病毒相似的重要特征4,5。此外，哺乳动物朊病毒能够在细胞间传播并感染未受感染的细胞6,7。

尽管除TSEs以外的PMDs不具有传染性，但它们与朊病毒疾病具有一种共同的致病机制8,9尽管与每种PMDD相关的蛋白质在结构或功能上并无关联，但它们均通过一种类似结晶的过程（称为成核或种子化聚合）形成聚集体；此外，这些蛋白质种子通过招募其可溶性同种异型体而不断生长。2,10,11自我增殖的效率存在差异 体内，取决于蛋白质的内在特性，这些特性与分子伴侣等其他细胞因子共同最终决定了聚集体的成核、接种、断裂和扩散速率12-15因此，这些因素之间必须存在一种精细的平衡，以实现蛋白质聚集的高效传播。这也可能解释为何仅部分淀粉样聚集物具有朊病毒的特征，因而并非所有蛋白质构象病（PMDs）都具有传染性。朊病毒似乎代表了广泛存在的自复制蛋白聚集物中的“高性能者”，这使其成为研究蛋白质构象病的有力工具8,13.

引人注目的是，与疾病相关的蛋白聚集物所引发的毒性通常具有非细胞自主性成分16,17。这意味着它们会影响那些不表达相应基因的邻近细胞，这与严格的细胞自主性效应不同，后者仅指表达该基因的细胞表现出特定表型。这一现象已在多种神经退行性疾病模型中通过组织特异性表达或敲低相关蛋白得到了有力证明18-26。目前已有多种机制被提出用于解释蛋白质错误折叠疾病（PMDs）中的非细胞自主性毒性，包括营养供应减少、神经元信号失衡、谷氨酸兴奋性毒性以及神经炎症16,27,28。此外，疾病相关聚集物在细胞间的类朊病毒样传播也可能参与其中29,30。越来越多的证据表明，除朊病毒外的其他蛋白包涵体也可在细胞间传递，这或许可以解释许多蛋白质错误折叠疾病中所观察到的病理特征的典型扩散模式30-36。然而，目前尚不清楚致病蛋白的细胞间传播与对邻近细胞的毒性效应之间是否存在明确的因果关系。因此，深入理解介导蛋白在细胞间传播及非细胞自主性毒性的细胞通路，对于开发新型治疗策略至关重要。然而，在多细胞生物中，尤其是从整体生物体水平来看，关于类朊病毒样扩散过程以及影响错误折叠蛋白细胞间传递的细胞因子，仍有许多方面尚未明确。

线虫 秀丽隐杆线虫 具有多项优势，提供了潜在的可能性 发现后生动物中类朊病毒传播的新层面17透明，便于观察 体内 在活体生物中对荧光标记蛋白进行示踪。此外，许多受疾病影响的细胞和生理过程从线虫到人类均具有保守性， 秀丽隐杆线虫 也可进行多种遗传操作以及分子和生化分析37-39成年雌雄同体秀丽线虫由恰好959个体细胞组成，其身体结构简单，但仍包含多种不同的组织类型，包括肌肉、神经元和肠道。

建立新的朊病毒模型 秀丽隐杆线虫， 我们选择外源表达细胞质酵母朊病毒蛋白 Sup35 的特征明确的富含谷氨酰胺/天冬酰胺（Q/N）的朊病毒结构域 NM，因为线虫中不存在已知的内源性朊病毒蛋白4,40酵母朊病毒在阐明朊病毒复制的基本机制方面具有重要价值41-44此外，NM 是首个在哺乳动物细胞培养中被证实能够重现朊病毒完整生命周期的胞质类朊蛋白。45,46同样，当表达在 秀丽隐杆线虫与酵母细胞相比，Sup35 朊病毒结构域在动物细胞中传播的不同需求下表现出显著的适应性，并展现出朊病毒生物学的关键特征40. NM 聚集与显著的毒性表型相关，包括在线粒体完整性受损和细胞水平上出现多种与自噬相关的囊泡，以及在个体水平上导致胚胎和幼虫停滞、发育延迟，以及蛋白质折叠环境的广泛紊乱。值得注意的是，朊病毒结构域表现出细胞自主性和非细胞自主性毒性，可影响未表达该转基因的邻近组织。此外，可在活体中实时监测朊病毒结构域在细胞内及细胞间的囊泡运输过程。 体内40.

本文介绍了如何在C. elegans中研究类朊病毒的扩散过程。我们将阐述如何利用延时荧光显微镜监测含有朊病毒结构域的囊泡在细胞内和细胞间的运输。我们将重点介绍使用组织特异性折叠传感器和普遍表达的应激报告系统，以评估对细胞适应性的细胞自主性和非细胞自主性影响。最后，我们将描述最近开展的一项全基因组范围RNA干扰（RNAi）筛选实验的操作流程，以鉴定调控朊病毒诱导毒性的新修饰因子。综合这些方法，有助于解析参与蛋白质细胞间转移及其非细胞自主性毒性的遗传通路。

方案

1. 通过跨细胞传播监测类朊病毒蛋白 体内 延时成像

注意：培养 秀丽隐杆线虫 野生型（WT）（N2）及转基因品系，按照标准方法培养，并严格控制培养温度47.

  1. 生成转基因品系 秀丽隐杆线虫 表达带有单体红色荧光蛋白（mRFP）标签的类朊病毒蛋白。观看此视频，了解如何使用显微注射技术48有关整合这些染色体外品系的更多详细信息和方法，请参见49.
  2. 根据标准方法通过产卵或漂白制备同步化群体50.
    1. 通过产卵进行同步化
      1. 将10 - 20只怀卵成虫转移至培养皿中，让其产卵1 - 2小时。移除成虫，让后代在培养皿中生长至所需年龄。
    2. 漂白同步化
      1. 收集未同步的成年 gravid 线虫群体，用碱性次氯酸盐溶液（250 mM NaOH 和商用漂白剂在 H₂O 中 1:4 (v/v) 稀释）处理2O). 用M9缓冲液洗涤卵子两次（218 × g，1分钟）47 (21 mM Na2HPO4·7H2O₂, 22 mmol/L KH2PO4，86 mM NaCl，1 mM MgSO₄4·7H2O，加入dH₂O2最多可达 1 L。
      2. 在M9缓冲液中，于温和振荡条件下过夜孵化 20 °C线虫在缺乏食物来源时，其发育将在L1阶段停滞，从而获得同步化的群体。将L1幼虫转移至接种了OP50的大肠杆菌的新型线虫培养基（NGM）平板上。 E. coli 细菌并让后代发育至所需年龄47.
  3. 制备2%琼脂糖垫（溶于H2O）置于载玻片上，具体操作如所述50.
    1. 准备两张载玻片，在其整个长度上贴上标签胶带，用作间隔物。将第三张载玻片置于二者之间。
    2. 将2%琼脂糖溶解于H2O，用移液器吸取一滴至洁净的载玻片上。
    3. 将第四张载玻片垂直置于琼脂液滴上方的另外三张载玻片之上，轻轻按压，使琼脂垫的厚度与标签胶带的厚度一致。
    4. 静置1分钟使其干燥，然后移除间隔物，轻轻将载玻片分开。琼脂垫将附着在其中一张载玻片上。
  4. 移液器 ~10 µl 麻醉剂（M9缓冲液中含2 mM左旋咪唑）滴加到载玻片上，用铂金丝挑取约10只动物转移至液滴中，盖上盖玻片（约22 × 22 mm），并在1小时内完成成像。
  5. 或者，为了延长成像时间，或进一步降低动物移动的可能性，可采用麻醉剂与微珠固定相结合的方法51.
    1. 制备10%琼脂糖垫（使用M9缓冲液），方法如所述51 并加入线虫 3 µl 纳米球尺寸标准溶液（聚苯乙烯微珠，100 nm）加 3 µl 麻醉剂（M9缓冲液中含4 mM左旋咪唑）。轻轻盖上盖玻片。为防止干燥，用VALAP（等量凡士林、羊毛脂和石蜡的混合物）密封盖玻片。
  6. 使用共聚焦显微镜对固定在载玻片上的线虫进行成像。
    注意：结果使用配备 EM-CCD 相机和显微镜自动系统的转盘共聚焦显微镜获得 & 图像分析软件（如 MetaMorph）可实现下述具体功能，但其他类似的共聚焦成像系统也可使用。
    1. 使用63X或100X/1.4NA油镜物镜，将载有线虫的显微镜载玻片放入显微镜载物台夹中。
    2. 打开软件。调整激光功率和滤光片以进行 mRFP 成像。使用 561 nm 激光，功率设为 10%，并选择相应的发射滤光片 >600 nm
    3. 打开“多维采集”模块。在“主”选项卡下，勾选“时间序列”和“运行日志”（硬件自动对焦：关闭）。
    4. 在“保存”选项卡中，选择或创建用于保存文件的目录文件夹，并为文件命名。
    5. 在“Wave Length”选项卡下选择合适的照明条件，并调整曝光时间和增益。使用“YokoQuad Red”（或适用于mRFP成像的等效照明设置），曝光时间设置在100至300毫秒之间，相机增益设置在100至300之间，具体数值根据样品情况（通过实时图像评估）进行调整。
    6. 在“时间序列”选项卡中，选择“时间点数量” = 301，“持续时间” = 5 min，“时间/间隔” = 1 sec。
    7. 在“Journals”选项卡下，选择期刊：“AFC SET Z HOLD”和“AFC Return to Z HOLD”，类型：“Special”（两次），起始点：“Start of time point”和“End of time point”。此自动对焦选项对于在较长时间内对同一区域进行成像至关重要。
    8. 当设置完成后，按下“Acquire”。时间序列视频将被保存为独立的 TIFF 文件。
    9. 打开 ImageJ 中给定时间序列的所有 .tiff 文件。依次选择“图像”→“堆栈”→“图像成堆栈”。可选地，调整亮度和对比度，添加比例尺等。在“文件”→“另存为”→“AVI…”中导出视频（示例见对应于 图1).

2. 利用折叠传感器和应激报告基因研究细胞自主性和非细胞自主性对蛋白质稳态及毒性的效应

  1. 构建共表达折叠传感器或应激报告基因与朊病毒样蛋白的转基因品系。有关建立杂交或生成转基因品系的方法，请参见48,49,52。可用于本实验的C. elegans菌株列表见表1。
  2. 制备同步化的转基因动物群体，并按照上述方法（第1.2节）培养至所需年龄50。
  3. 使用体视显微镜观察折叠传感器或应激报告基因对应的表型。
    1. 对于折叠传感器，测定每次同步化后每一天含有蛋白聚集体的动物数量（示例见图2E和F）。
    2. 对于应激报告基因，检测共表达朊病毒样蛋白是否导致报告基因荧光增强（示例见图3）。

3. 在 C. elegans 中进行全基因组筛选以抑制朊病毒诱导的毒性

RNAi 实验流程、孵育步骤、L1 期线虫、方法：基因筛选、示意图。
图 4. RNAi 筛选实验流程的示意图。 有关各个步骤的详细说明，请参见第 3 节实验方案部分。

  1. 同步化 C. elegans 线虫与RNAi文库的扩增
    1. 对于RNAi筛选，使用Ahringer RNAi文库（或Vidal RNAi文库）53,54将RNAi文库从原始的384孔板重新排列至96孔板，通过向孔板中加入 100 µl LB-amp 培养基（50 μg/ml 在含氨苄青霉素的LB培养基中加入10%甘油，并使用96针复制器接种。于37℃培养 37 °C 过夜振荡，于 -80 °C.
    2. 维持 C. elegans 野生型和转基因品系在 20 °C 在接种了OP50的NGM平板上 E. coli 根据标准方法对细菌进行处理47.
    3. 通过漂白法同步化朊病毒样结构域转基因和野生型（对照）线虫（参见第1.2节）。
    4. 在对线虫进行漂白的同一天，准备添加补充剂的LB培养基 50 μg/ml 氨苄青霉素。使用自动试剂分配器分配（或手动移液） 65 μl 将LB-amp培养基加入96孔板的每孔中。
    5. 从 -80 °C 中取出 96 孔 Ahringer RNAi 文库板80 °C 并将它们放入铺有纸巾的无菌操作台中。在培养皿仍处于冷冻状态时，立即将培养皿倒置，小心撕去封口胶带，注意避免培养皿外表面的冰晶造成污染。随后将培养皿重新正置，室温解冻约30分钟。
    6. 将一个无菌的96针复制器浸入一个RNAi文库板，然后浸入一个新鲜的LB-amp平板中。每个平板均需使用新的无菌复制器。用压敏封板膜密封所有平板，并将文库板放回-80 °C复制器可浸泡在漂白剂中，冲洗后高压灭菌，以便再次使用。
    7. 让重复的RNAi平板在设定的培养箱中过夜培养 37 °C 和 300 rpm。使用 HT115 E. coli 携带空载体（L4440）的细菌作为对照，分别在培养管中培养，然后用移液器转移 65 μl 使用多通道移液器将培养物加入两块96孔板的各一个象限中。
  2. 诱导细菌产生双链RNA并添加线虫
    1. 将异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）用ddH₂O稀释至5 mM浓度2O. 使用带多通道头的自动化工作站进行分液（或手动移液） 10 μl 将稀释的IPTG加入RNAi细菌和对照组平板的每个孔中。重新密封后，将平板放回培养箱。在37°C下振荡培养3小时 37 °C.
    2. 当细菌处于振荡状态时，准备线虫。充分混匀M9/线虫悬液，并用移液器吸取少量样品（约5 - 10 µl) 转移至玻璃显微镜载玻片上。在体视显微镜下计数线虫数量，并计算每单位中的线虫数目 μl.
    3. 使用无菌技术，配制添加物M9（M9+）溶液，终浓度如下：0.20 mg/ml IPTG 8.0 μg/ml 胆固醇 50 μg/ml 氨苄青霉素 9.6 μg/ml 四环素， 0.0835 μg/ml 两性霉素B，每份15条蠕虫 50 μl.
      1. 分别为朊病毒样结构域转基因线虫和野生型线虫配制独立的溶液。所需M9缓冲液加线虫溶液的最终体积取决于复制的RNAi平板数量（见下文），此外若使用自动分配仪，还需额外预留约30 ml无法分配的残留体积。
    4. 在细菌dsRNA诱导3小时后，将培养板从培养箱中取出，室温下静置约30分钟，使其冷却，以避免对动物造成热应激。
    5. 分配 50 μl 将M9+ 朊病毒结构域转基因线虫溶液加入RNAi平板以及一个空载体对照平板的每个孔中。每次操作前务必混匀线虫溶液，因为线虫容易沉降到储液槽底部。
    6. 将野生型蠕虫分配至第二个对照培养皿中。保持培养皿未密封，以确保通气。为防止液体培养基蒸发，将4-5个培养皿叠放在一起，并用湿润的纸巾和铝箔包裹。在200 rpm条件下孵育。 20 °C 4天。
  3. 评分
    注意：线虫在培养箱中培养4天后将进入成虫第二天，此时可进行筛选。筛选前让动物在无振荡条件下适应30分钟，以确保其自由、不受干扰地运动。
    1. 使用连接至带显示器计算机的 Falcon 4M60 相机，观察与对照处理的朊病毒结构域转基因动物相比是否出现加剧的剧烈抽搐行为。
    2. 使用 wrMTrck 编制一份初步筛选结果列表以进行验证（见下一节）。

4. 初筛阳性结果的验证

  1. 固体平板上的运动能力检测
    1. 根据标准方法制备含有NGM培养基的平板，并添加100 µg/ml氨苄青霉素、12.5 µg/ml四环素和1 mM IPTG47。如有可能，使用平板倾注仪以确保所有平板的培养基高度一致，从而便于后续视频采集过程的标准化。
    2. 在约1 ml LB培养基（含50 µg/ml氨苄青霉素）中培养不同的RNAi菌株，37 °C、250 rpm条件下过夜培养。
    3. 次日，加入1 mM IPTG诱导dsRNA表达，持续3小时。将每种RNAi细菌克隆各取150 µl接种至平板上，并涂布成薄层。将平板置于室温、避光条件下干燥2天。每种RNAi克隆准备3个平板。
    4. 按照标准方法通过漂白法同步线虫群体50（见第1.2节），并将卵置于M9培养基中过夜孵化。
    5. 取少量线虫悬液，在体视显微镜下测定每µl中的线虫数量。然后用移液器将适量的M9缓冲液与线虫加入各实验平板，使每个平板含有25–30条L1期幼虫。将线虫在20 °C下培养4天，直至其发育至成虫第2天。
  2. 使用ImageJ的wrMTrck插件对线虫运动能力进行定量分析
    注：视频使用体视显微镜在10倍放大倍数下拍摄，配备Hamamatsu Orca-R2数字相机C10600-10B及Hamamatsu Simple PCI成像软件。
    1. 打开相机和Simple PCI成像软件。点击“Live”以调整成像条件。
    2. 设置视频参数如下：增益（Gain）= 0；光照模式（Light Mode）= 高；速度指数（Speed Index）= 1；像素合并（Binning）= 2。点击“Auto Expose”，然后调整照明条件，调节显微镜反光镜以及亮度和对比度旋钮。
      注：视频需具有高对比度但不能过曝，使动物呈现为明亮背景上的黑色轮廓。
    3. 点击“Time Scan”，选择保存文件夹和文件名。将“Field Delay”设为20 msec，“Stop at Time”设为30秒。点击“Live Review”以选择待录制区域（线虫最集中的区域）。快速轻敲载物台上的平板3至4次，迅速确认其在视野中的位置，然后点击“Start”开始录制。
    4. 视频录制完成后，右键单击图像，选择“Export Montage Sequence”，将视频从.cxd格式导出为.avi格式。
  3. 分析运动视频
    1. 打开ImageJ软件，进入“Plugins”选项卡，选择“wrmtrck”，然后点击“wrMTrck Batch”。选择包含所有待分析文件的目录。
    2. 在wrMTrck_Batch的主输入窗口中，加载如图5C所示的输入参数。各参数的具体说明可在插件附带的使用说明中查阅。点击“OK”，开始运行运动分析程序。
    3. 为校验分析结果，确认所有检测到的轨迹均来自真实的C. elegans并排除伪迹，需打开每个视频生成的.txt文件，将数据复制到数据分析软件中。打开生成的“*_labels.zip”文件，运行其中的“*_labels.tif”图像，手动检查并删除错误的线虫轨迹。

结果

通过监测类朊病毒蛋白的细胞间扩散 体内 延时成像

转基因 C. elegans 表达朊病毒结构域的细胞系特别适用于对类朊病毒蛋白某些方面的分析， 例如，细胞间传播以及非细胞自主毒性。动物的透明性使得能够在整个生命周期的各个阶段，在活体生物体内追踪荧光标记的蛋白质。利用这一特性，可通过荧光显微镜观察类朊病毒蛋白在细胞和组织间的移动。必须使用63X或100X/1.4NA油镜物镜，以清晰分辨囊泡结构。重要的是，朊病毒结构域必须用mRFP标记，以便在这些可能呈酸性的囊泡中保持荧光可见性40黄色荧光蛋白（YFP）常被用作标签，但由于其在低pH环境中会发生荧光淬灭，因此不适用。40,55菌株 AM815 表达带有 RFP 标签的 R2E2（一种高度易于聚集且具有毒性的朊病毒结构域 NM 的形式），该蛋白会积聚在管状囊泡中，而单独的 RFP 标签则保持可溶状态图1A 和 B）。使用 体内 延时成像显示，这些管状囊泡可在细胞内及细胞间进行运输40 (图1C 和 D, 视频 1 和 2）[插入视频链接 1 和 2 此处]

利用折叠传感器和应激报告系统研究蛋白质稳态和毒性中的细胞自主性与非细胞自主性效应

朊病毒能够交叉诱导相关蛋白质成核，并破坏细胞内的蛋白质折叠环境。这一现象可通过共表达适当的折叠传感器来揭示。折叠传感器是一类非必需的亚稳态蛋白质，其正确折叠依赖于功能完整的蛋白质稳态网络。一些典型的例子包括熟知的萤火虫荧光素酶以及携带温度敏感性（ts）突变的蛋白质56-66。当蛋白质稳态网络受到干扰时，报告蛋白会发生错误折叠，可通过观察聚集体的形成，或在允许温度下出现相应的ts突变表型来检测。含有接近聚集阈值长度（约40个残基）的多聚谷氨酰胺（polyQ）序列也常被用作传感器，因其表现出年龄依赖性的聚集特性67-69。聚集现象的提前出现表明蛋白质折叠环境已受损。在此，我们采用了朊病毒突变体RΔ2-5，该突变体在秀丽隐杆线虫（C. elegans）体壁肌（BWM）细胞和肠道中表达时保持可溶状态40（图2A和C）。当其与R2E2在体壁肌细胞中同时表达时，RΔ2-5迅速形成聚集体（图2B），表明R2E2对蛋白质折叠环境具有细胞自主性的影响。为了评估对蛋白质稳态的广泛影响以及跨组织错误折叠的诱导情况，可在不表达高聚集倾向性朊病毒结构域的组织中表达折叠传感器。实验中，R2E2在体壁肌细胞特异性启动子（myo-3p）驱动下表达，而RΔ2-5则在肠道特异性启动子（vha-6p）驱动下表达。肠道中RΔ2-5的聚集表明R2E2以非细胞自主性方式影响蛋白质折叠40（图2D）。除了使用仅能在高分辨率下检测到聚集体的RΔ2-5外，还可使用在肠道中表达的polyQ44（Q44i），其聚集体可在体视显微镜下以较低分辨率直接观察（图2E和F）。此外，这种方法还能够定量统计出现聚集体的个体数量，以及聚集体的数量。

为了研究朊病毒结构域的非细胞自主毒性，我们先前通过透射电子显微镜检查了不表达R2E2的邻近组织，发现肌肉细胞中朊病毒结构域的表达会导致相邻组织（如肠道）中线粒体完整性的非细胞自主性破坏40。线粒体功能障碍会导致活性氧（ROS）产生增加和氧化应激。一种无创性可视化氧化应激反应诱导的方法是使用氧化应激诱导型报告基因70。菌株CF1553在氧化应激诱导型启动子sod-3的驱动下表达绿色荧光蛋白（GFP）70。当该菌株与在体壁肌（BWM）细胞中表达朊病毒结构域R2E2的线虫杂交后，报告基因不仅在BWM细胞中显著上调，也在多种非BWM组织中显著上调（图3）。该菌株可用于检测特定候选基因是否影响这种非细胞自主性的氧化应激反应诱导。表1列出了可类似使用的、表达折叠传感器和应激报告基因的C. elegans菌株。

全基因组筛选抑制朊病毒诱导毒性的因子 秀丽隐杆线虫

在 C. elegans 中表达的朊病毒结构域所表现出的复杂毒性表型尤其引人关注，原因在于大多数体外（in vitro）朊病毒模型中并未观察到明显的毒性71。该模型可能揭示影响多细胞动物中朊病毒相关毒性的新通路。为探讨这一问题，我们筛选了在RNA干扰（RNAi）敲低后能够改善R2E2转基因动物运动缺陷的基因。可将经对照处理的野生型（WT）线虫用作阳性对照，尽管大多数候选基因可能无法完全挽救运动表型，这是由于RNAi的渗透性存在变异以及转基因本身的高毒性所致。实验中，动物从L1幼虫期至成虫第2天连续接受4天的RNAi处理。此时，未经处理的R2E2动物的摆动频率显著低于野生型动物，这一点至关重要，因为我们旨在筛选出运动能力改善的基因。F1子代（约处于L1阶段）会同时存在，但易于与P0代区分。仅对P0代进行评分。该初筛为视觉观察且非定量分析，因此采用较低的阈值来识别初步阳性结果，即任何看似能提高表达朊病毒动物摆动频率的细菌RNAi克隆，均会在定量爬行实验中进行复测。图4概述了筛选实验的主要步骤。Falcon 4M60相机的高分辨率使得可在计算机屏幕上一次观察培养板的四分之一区域，从而更高效地完成筛选。尽管这一方法具有帮助作用，但并非必需。线虫摆动行为的视觉检查也可通过体视显微镜在低倍率（10X）下完成。

初步筛选结果的验证

高通量筛选作为一种研究方法，可用于分析全基因组范围内的效应，从而获得候选基因的初步列表，后续可通过互补方法进一步优化。因此，对筛选结果进行验证至关重要，以排除可能的假阳性结果——此类假阳性可能源于每个RNAi仅使用一个实验样本进行筛选。我们将R2E2转基因动物饲喂初级筛选命中基因的RNAi克隆，并在成虫期第二天测量其在NGM平板上的运动速度，以此作为运动能力及毒性降低的可量化读出指标。我们使用了本实验室开发的ImageJ插件wrMTrck，该插件能够精确识别 秀丽隐杆线虫 在视频中追踪其运动。用于自动分析的wrMTrck插件及脚本为开源软件，可从http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html免费获取，同时提供详细的使用说明。下载后，请将整个wrMTrck文件夹复制到ImageJ的Plugins文件夹中。本方案描述的是wrMTrck_Batch方法，适用于同时分析大量视频；但插件下载包中也提供了逐个视频手动分析的操作指南。WrMTrck_Batch可将原始视频（图 5A) 转换为二值化格式并进行背景扣除，每条线虫被分配一个轨迹。处理后的视频可随后以叠加轨迹的形式进行回放，以便手动剔除被错误识别为线虫的伪影（例如第1音轨 图5B）。消除背景伪影的一种有效方法（箭头所示为背景伪影） 图5B）是仔细选择待识别对象的最小和最大尺寸（图5C）。从 wrMTrck 插件的不同输出结果中，我们采用每秒体长（BLPS）参数来衡量每只动物的平均速度，该参数通过将每条轨迹的长度除以对应目标的体长得到，从而对线虫个体间可能存在的体型差异进行归一化处理（图 5D）。利用该方法，我们鉴定了35个抑制朊病毒诱导毒性的抑制因子（sopt），这些因子可增强表达R2E2的个体的运动表型 秀丽隐杆线虫 与空载体处理的线虫相比，至少增加至133%，最高可达256%（图6）。这些 sopt 基因是我们通过高通量筛选最终确认的阳性结果。

荧光显微镜，蛋白质定位，延时成像，实验，细胞，图像序列。
图1. 朊病毒结构域通过囊泡运输在C. elegans的细胞与组织间扩散。(A) 表达体壁肌细胞（BWM）中RFP（RFPm）的线虫的共聚焦z轴层扫图像合并图。(B) 表达具有高度毒性且易于聚集的NM变异体R2E2于BWM细胞（R2E2m）的线虫的共聚焦z轴层扫图像合并图。箭头指示管状囊泡，箭头末端指示聚集体。(C+D) 表达RFPm (C) 和R2E2m (D) 的动物的延时成像序列。箭头指示囊泡运动区域。RFPm主要呈现弥散性染色。即使RFPm出现在囊泡中，这些囊泡也几乎不移动。R2E2m定位于多个囊泡，并在细胞内和细胞间被运输。比例尺：10 µm。对应的视频1和视频2 [在此处插入视频1和视频2的链接] 分别对应于图1C和图1D。

蛋白质聚集的荧光显微镜图像，图A-D为叠加图像；E-F为聚集数据图。
图 2. 折叠传感器揭示朊病毒结构域对蛋白质稳态的广泛影响。（A+B） R2E2m的共表达促进RΔ2-5m的聚集。BWM细胞中（A） RΔ2-5m对照组和（B） RΔ2-5m与R2E2m共表达的共聚焦图像。（C+D） 在肌肉中表达的R2E2m促进肠道中RΔ2-5i的聚集。（C） 在肠道细胞中表达RΔ2-5i的对照动物的共聚焦图像。（D） 在BWM细胞中表达R2E2m、在肠道中表达RΔ2-5i的动物的共聚焦图像。比例尺：10 µm。（E+F） R2E2m诱导Q44i发生非细胞自主性聚集。（E） 同步化L1幼虫转移至新鲜涂有OP50的NGM平板后第4天，Q44i和Q44i;R2E2m动物的代表性荧光图像。在BWM细胞中表达R2E2导致肠道中Q44i聚集更早出现。（F） 同步化后指定天数具有聚集物的动物百分比的定量分析。误差条表示标准差。本图改编自40。

秀丽隐杆线虫中的基因表达比较；显示 sod-3p::GFP 的荧光显微镜结果。
图3. sod-3p::GFP 转录应激报告系统显示，朊病毒结构域可引发细胞自主性和非细胞自主性的氧化应激反应。(A+B) 成年第2天的 sod-3p::GFP 表达对照动物 (A) 和 sod-3p::GFP;R2E2m 动物 (B) 的代表性荧光图像（曝光时间相同）。(C) 在体壁肌细胞（BWM细胞）中表达 R2E2 可导致报告基因不仅在BWM细胞中被诱导（I），也在肠道（II）、神经索（III）、咽部及头部神经元（IV）中被诱导。

细胞追踪分析；图像阈值处理；Weka插件设置；数据表；显微镜实验结果。
图5. 使用ImageJ的wrMTrck插件分析线虫运动。 (A) 使用适当放大倍数（约10倍）生成的输入视频示例，用于同时监测多只动物。(B) “*_labels.tif”文件是wrMTrck_Batch的输出结果，可用于对分析结果进行人工校正。箭头指示由于正确设置了最小和最大尺寸参数而被准确排除在分析之外的目标。(C) wrMTrck_Batch的输入窗口，显示本实验方案所用参数。这些参数需根据具体的显微镜和视频设置进行调整。(D) 对(B)中数据进行运动分析的输出结果，其中BLPS列以黄色高亮显示。请点击此处查看该图的放大版本。

RNAi 实验结果，柱状图，运动性百分比比较及统计显著性水平。
图6. 经RNAi克隆处理的R2E2线虫，这些克隆为朊病毒诱导毒性的抑制因子（sopt），其运动能力得到改善。 运动性以相对于阴性对照（空载体）的BLPS表示。图中显示了HTP筛选中鉴定出的所有具有统计学显著性（学生t检验）的RNAi克隆。静态平衡符号，黑色星形图，物理学概念示意图。 代表在图5中作为示例展示的命中克隆。结果来自3次录像，每种条件下包含17

表1. C. elegans 表达折叠传感器和应激报告基因的品系。

菌株名称基因型备注菌株来源
折叠传感器
转基因品系
AM140unc-54p::polyQ35::yfp多聚谷氨酰胺35（polyQ35）的肌肉特异性表达，具有年龄依赖性聚集CGC 或 Morimoto 实验室
AM141unc-54p::polyQ40::yfp多聚谷氨酰胺40（polyQ40）的肌肉特异性表达，具有年龄依赖性聚集CGC 或 Morimoto 实验室
AM801unc-54p::RΔ2-5::yfp成核缺陷型朊病毒结构域的肌肉特异性表达Morimoto 实验室
OG412vha-6p::polyQ44::yfp多聚谷氨酰胺44（polyQ44）的肠道特异性表达，具有年龄依赖性聚集CGC
AM809vha-6p::RΔ2-5::gfp;      myo-2p::mcherry成核缺陷型朊病毒结构域的肠道特异性表达Morimoto 实验室
AM47F25B3.3p::polyQ40::cfp多聚谷氨酰胺40（polyQ40）的神经元特异性表达，具有细胞类型特异性聚集Morimoto 实验室
AM982unc54p::luciferase::yfp野生型萤火虫荧光素酶的肌肉特异性表达Morimoto 实验室
myo-3p::luciferase::gfp; rol-6野生型萤火虫荧光素酶的肌肉特异性表达Behl 实验室
sng-1p::luciferase::gfp; rol-6野生型萤火虫荧光素酶的肌肉特异性表达Behl 实验室
FUH55unc54p::FLUC::egfp; rol-6野生型萤火虫荧光素酶的肌肉特异性表达Hartl 实验室
FUH134unc54p::FLUCSM::egfp; rol-6R188Q突变型萤火虫荧光素酶的肌肉特异性表达Hartl 实验室
FUH135unc54p::FLUCDM::egfp; rol-6R188Q+R261Q双突变型萤火虫荧光素酶的肌肉特异性表达Hartl 实验室
FUH48F25B3.3p::FLUC::egfp; rol-6野生型萤火虫荧光素酶的神经元特异性表达Hartl 实验室
FUH136F25B3.3p::FLUCSM::egfp; rol-6R188Q突变型萤火虫荧光素酶的神经元特异性表达Hartl 实验室
FUH137F25B3.3p::FLUCDM::egfp; rol-6R188Q+R261Q双突变型萤火虫荧光素酶的神经元特异性表达Hartl 实验室
温度敏感突变体
CB1402 unc-15(e1402) I副肌球蛋白（ts），温度敏感型Unc麻痹，致死型（Let）CGC
CB1157unc-54(e1157) I肌球蛋白（ts），温度敏感型UncCGC
CB1301unc-54(e1301) I肌球蛋白（ts），温度敏感型UncCGC
CB286unc-45(e286) IIIUnc-45（ts），温度敏感，运动缓慢的Unc，产卵缺陷（Egl）CGC
HE250unc-52(e669su250) IIPerlecan（ts），温度敏感型Unc，僵直性麻痹CGC
SD551let-60(ga89) IVRas（ts），温度敏感型多阴道（Muv）、不育（Ste）、致死（Let）、卵滞留（Lva）、渗透敏感（Osm）CGC
CX51dyn-1(ky51) X动力蛋白（ts），温度敏感型UncCGC
CW152gas-1(fc21) XGas-1（ts），温度敏感型乙醇敏感性CGC
ZZ26unc-63(x26) I乙酰胆碱受体（ts），温度敏感型左旋咪唑抗性CGC
应激报告基因
CL2070hsp-16.2p::gfp;rol-6热应激；细胞质未折叠蛋白反应（UPRcyto）CGC
TJ375hsp-16.2p::gfp热应激；细胞质未折叠蛋白反应（UPRcyto）CGC
TJ3000, TJ3001hsp-16.2p::gfp;                       Cbr-unc-119(+)热应激；细胞质未折叠蛋白反应（UPRcyto）CGC
AM446hsp70p::gfp;rol-6热应激；细胞质未折叠蛋白反应（UPRcyto）Morimoto 实验室
AM722hsp70p::mcherry; myo-2p::cfp热应激；细胞质未折叠蛋白反应（UPRcyto）Morimoto 实验室
AM799hsp90p::gfp热应激；细胞质未折叠蛋白反应（UPRcyto）Morimoto 实验室
OG497hsf-1p::hsf-1::gfp; Cbr-unc-119(+)热应激；细胞质未折叠蛋白反应（UPRcyto）CGC
CF1553sod-3p::gfp;rol-6氧化应激CGC
KN259sod-3p::gfp;rol-6氧化应激CGC
CL2166gst-4p::gfp::nls氧化应激CGC
LD1171gcs-1p::gfp;rol-6氧化应激CGC
LD1skn-1p::skn-1::gfp;rol-6氧化应激CGC
IG274nlp-29p::gfp渗透应激CGC
BC20309mtl-1p::gfp金属应激Baillie 实验室
BC20342mtl-2p::gfp金属应激Baillie 实验室
BC20314elt-2p::gfp金属应激Baillie 实验室
SJ4005hsp-4p::gfp内质网未折叠蛋白反应（UPRER）CGC
SJ4100hsp-6p::gfp线粒体未折叠蛋白反应（UPRmito）CGC
SJ4058hsp-60p::gfp线粒体未折叠蛋白反应（UPRmito）CGC

CGC：秀丽隐杆线虫遗传学中心；ts = 温度敏感型；UPR = 未折叠蛋白反应；cyto = 细胞质；mito = 线粒体；ER = 内质网。

讨论

本文所述方法有助于阐明类朊病毒蛋白的扩散行为及其复杂的细胞自主性和非细胞自主性毒性。我们最近发现，一个易于聚集的细胞质朊病毒结构域可通过一种与自噬相关的过程被摄入膜结合囊泡中。其中特定亚群的囊泡可在细胞内以及细胞与组织之间运输该朊病毒结构域40。在活体动物中监测这些囊泡运动的关键在于，目标蛋白必须标记mRFP，因为只有标记mRFP的蛋白才能在这些可能呈酸性的囊泡中被观察到。采用相同方法，我们目前正在研究某些与疾病相关的蛋白是否具有潜在的类朊病毒特性，例如超氧化物歧化酶1（SOD1）（与肌萎缩侧索硬化症ALS相关）、α-突触核蛋白（与帕金森病PD相关）或TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）（与ALS相关）。尽管这种囊泡介导的细胞间运输可能也被其他多种蛋白所利用，但仍可能存在其他促进扩散的途径。

使用特征明确的折叠传感器是监测 C. elegans 细胞内蛋白质折叠环境变化的有力工具63-66。本文展示了如何利用在组织特异性启动子驱动下表达的荧光标记易聚集蛋白，通过其随年龄增长的累积情况，实现对不同组织折叠能力的可视化同步监测。研究生物体蛋白质稳态网络的其他方法还包括使用内源性的温度敏感型（ts）突变蛋白。这些亚稳态蛋白在允许温度（15 °C）下可正常发挥功能，但在限制温度（25 °C）下会错误折叠并失去活性，从而表现出其特有的突变表型。当存在易聚集蛋白或处于衰老过程中时，即使在允许温度下，ts 突变表型也会显现63-66。部分 ts 突变体仅在特定组织亚群中表达，或表现出组织特异性表型，因此特别适用于检测细胞自主性和非细胞自主性的蛋白毒性效应。例如，LET-60 是 GTP 结合 RAS 原癌基因家族成员，其温度敏感型突变体 Ras(ts) 在全身广泛表达，但表现出组织特异性突变表型63,66。利用该 ts 突变体，已证明多聚谷氨酰胺（polyQ）扩增对细胞蛋白质稳态的影响具有细胞自主性63。在 ras(ts) 遗传背景下表达 polyQ 时，仅在目标蛋白表达的特定组织中观察到相应的突变表型。若多个组织出现突变表型，则表明该蛋白具有非细胞自主性的蛋白毒性效应。

此外，为了检测对细胞应激通路的影响，秀丽隐杆线虫（C. elegans）中已有大量可用的体内荧光应激报告系统72。这些报告系统通常是转录报告系统，在应激诱导型启动子（如分别响应热应激或氧化应激的hsp-16.2p或sod-3p）驱动下表达绿色荧光蛋白（GFP）72。通过将适当的报告系统与类朊病毒蛋白联合使用，可以监测在非转基因表达组织中是否潜在诱导了应激反应。然而需要注意的是，这些应激报告系统通常敏感性不足，难以揭示特定通路的轻微上调（未发表观察结果）。

为了探究影响非细胞自主毒性的基因是否也影响蛋白质的扩散，我们首先筛选了那些在表达下调时能够改善运动缺陷的基因。通过目视评估线虫的游泳速率作为检测指标，我们每次实验可轻松检测约25块培养板，并且每周可完成两轮实验，从而在6周内完成了初步筛选。随后，我们使用wrMTrck软件对线虫在固体培养板上的运动进行三复孔的定量分析，以验证筛选结果，该验证过程额外耗时3周。然而，需要注意的是，若采用在培养板上的爬行行为而非液体中的游泳行为作为检测指标，可能会遗漏某些候选基因，因为游泳与爬行并非完全相同的运动方式，且可能受到不同信号通路的调控73。因此，若某些候选基因在固体培养板上未能得到验证，应重新在液体环境中进行测试，通过在特定时间内计数线虫的摆动频率来量化其游泳能力。

本文所述筛选方案采用自动化液体处理工作站，可显著降低实验变异性。其缺点是机器人储液槽需要过量的液体，这在某些情况下可能难以实现。该筛选体系可轻松适用于其他以C. elegans运动频率作为读数的筛选实验。本筛选并未设计用于直接鉴定影响朊病毒结构域扩散或非细胞自主毒性的基因，因为全基因组筛选应尽可能简化设计，以确保能够及时完成。运动能力缺陷不仅可能源于肌肉损伤，还可能由神经元损伤及其他多种基因缺陷引起53。因此，通过该读数方式，我们可能发现的不仅是肌肉特异性毒性的调控因子。目前我们正利用上述方法检测候选基因对朊病毒结构域扩散及非细胞自主毒性的影响。这些实验最终将揭示蛋白质聚集体的跨细胞传播是否与在其他组织中观察到的毒性直接相关，或细胞间传播与非细胞自主毒性是否可被分离。

综上所述，所描述的方法可用于在细胞和生物体水平上研究蛋白质在 C. elegans 中潜在的朊病毒样行为。

披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

感谢Cindy Voisine和Yoko Shibata对本文手稿提出的有益讨论和宝贵意见。感谢西北大学高通量分析实验室（HTAL）和生物成像中心（BIF）提供的协助。本研究由美国国立卫生研究院（NIGMS、NIA、NINDS）、艾略特医学基金会以及丹尼尔·F·和阿达·L·赖斯基金会（资助对象：R.I.M.）提供的资助支持。C.I.N.-K. 受德国研究基金会（KR 3726/1-1）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
纳米球尺寸标准 100 nm赛默飞世尔科技3100A
左旋咪唑SigmaL-9756
IPTGSigma15502-10G
Ahringer RNAi文库来源 生物科学 生命科学 http://www.lifesciences.sourcebioscience
.com/克隆产品/非哺乳动物/秀丽隐杆线虫/秀丽隐杆线虫RNAi文库/
设备
Sorvall Legend XTR 制冷离心机，120 VAC赛默飞世尔科技75004521http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_
XTR_制冷离心机_120
VAC/EW-17707-60
96针复制器 Scionomix  http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro 高容量恒温培养摇床 Digilabhttp://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Combi 试剂分配器 Titertrekhttp://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 自动化工作站 Beckman Coulterhttp://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44 摇床新不伦瑞克http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec
04&action=products&内容编号=1&
catalognode=83389
M205 FA Leicahttp://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10B 数字化 CCD 相机滨松http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
转盘共聚焦显微镜 Leicahttp://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 相机 Teledyne Dalsa http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
软件
MetaMorph 显微镜自动化 & 图像分析软件Molecular Deviceshttp://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
滨松 SimplePCI 图像分析软件Meyer Instrumentshttp://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJ美国国立卫生研究院http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
ImageJ 的 wrMTrck 插件http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
秀丽隐杆线虫 品系
N2（野生型）秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC）http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                    rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp]Morimoto 实验室可从本实验室获取 
参见表1获取折叠传感器和应激报告基因品系的来源

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利用多细胞模式生物 C. elegans 研究类朊病毒蛋白的扩散与毒性
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