细菌表面电位测量用开尔文探针力显微镜

Summary

在这里，我们提出了一个协议，解释了使用开尔文探针力显微镜作为生成高分辨率纳米级表面电位图的工具。该工具用于评估表面电位对微生物与基材表面结合能力的作用。

Abstract

表面电位是起着微生物到基材表面的密合性的主导作用，一个经常被忽视的物理特性。开尔文探针力显微镜（KPFM）是原子力显微镜（AFM）的模块，其测量在纳米尺度表面之间的接触电势差。 KPFM的通过AFM的组合允许同时产生表面电位和生物标本的地形图，如细菌细胞。在这里，我们采用KPFM检查表面电位对微生物的粘附性医学相关的表面的效果，如不锈钢和金。表面电位的地图显示在不同的材料基板微生物膜在表面电位差。的工序高度图形生成显示在表面电位差在衬底表面和微生物之间的边界区域。变化在细胞膜表面电位已经与变化S IN细胞代谢和蠕动。因此，KPFM表示可被用来考察微生物膜表面电位在粘结到各种基底的表面的变化的有力工具。在这项研究中，我们展示的过程来描述个人的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 USA100细胞的表面电位使用KPFM不锈钢和黄金。

Introduction

对生产设备表面和皮肤伤口生物膜存在一个问题，医疗行业作为生物膜是顽抗移走，并可能导致疾病传播和抗菌药物耐药率增加。附件是在生物膜形成的第一步，是由于它的可逆性^1-3中最关键的步骤。基材表面特性发挥的微生物附着了至关重要的作用。因素，如表面硬度，孔隙度，表面粗糙度，和疏水性已被证明以进行微生物附着;然而，一些研究考察的基材表面电位（SP）对微生物粘附的作用已经做了^4,5。带负电荷的表面防止苏云金芽孢杆菌的孢子附着到云母，硅和金^6。变化细胞膜电位是指示改变的细胞附着和蠕动^5,7的。已经观察到，电坎ogeneous表面更容易促进微生物黏附^5。表征细菌的表面电位在纳米可以提供一种新的方式来理解细菌附着动力学到各种表面，从而可以在防生物结垢策略的发展提供帮助。不像用于表征细菌，如电泳光散射，ζ电位和等电点测定的电动力学的其他方法，开尔文探针力显微镜（KPFM）允许单个细胞而不是整个培养^8-11的检查。想要以比较细胞 - 细胞或生物膜电特性与高准确度和精度时，这是有利的。

KPFM是原子力显微镜（AFM）的模块。 AFM是作为扫描隧道显微镜^（STM）12的直接结果。利用STM首次公布的图像是由格尔德Binnig和海因里希Rorhrer于1982年¹²完成。其发明是能够解决的原子结构由....

Protocol

1.准备玻璃器皿和文化

1. 在继续进行这个实验，准备5％绵羊血琼脂（SBA）板种植MRSA。孵育SBA板放置24小时，在37℃。此时间之后，单一的，良好的分离的菌落应存在以用于后续接种到液体介质中。商店划线SBA板的单菌落，在4℃下进行1 - 2个月。
   注：羊的血琼脂平板进来20之间含有预先制备的包装 - 根据制造商25板，并通常由用加入了5％w / v的羊的血液中的胰蛋白酶大豆琼脂基。
2. 制成500毫升的胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）中补充有1％葡萄糖和0.1％的NaCl。在此之后，收集并清洗2玻璃试管。如果高温高压消毒的盖子是试管不可用，用铝箔作为上限。蒸压TSB和试管随着一箱1毫升枪头。
3. 在生物安全柜或接近面包连接刻录机，吸管5毫升以前蒸压TSB为蒸压试管。要小心，以确保有足够的时间已经给出，让TSB和试管冷却至室温。从以前条纹5％SBA板，接种单菌落到6毫升TSB肉汤。一种将包含MRSA，并且第二试管将被用作阴性对照，以确保无菌。
4. 取接种TSB试管，并放置在往复培养箱24小时，在37℃和在200rpm。在此时间后微生物的生长应该是在MRSA的试管表观而没有生长应该发生在控制试管。
5. 就拿1毫升24小时的文化和吸管为6毫升新鲜TSB。孵育在37℃下6小时以200rpm。
6. 吸取1毫升6小时亚文化到1.5 ml离心管。离心3分钟，在850×g下。除去上清液并在1ml去离子H ₂ O的重新悬浮颗粒....

Results

以测量的SP使用KPFM的能力依赖于原理，这两个样品表面和悬臂刀片是导电的，以某种程度。不锈钢和黄金采取行动，而MRSA被装导电表面。 KPFM拍摄图像15的MRSA细胞的两个表面上具有512×512的分辨率，并与扫描区域范围从5×5微米至10×10微米。扫描，进行与线速度范围为0.02行/秒至0.05行/秒。因此，有512个数据点每行512线扫描采集，扫描时间范围为2.84小时至7.11小时。采集到的图像的种类可以看出，在图2中 。KPFM操作使用双频率，正因为如此，地形图像同时与左右的表面的电特性数据收集沿。施加热的过滤器到SP的地图，以更容易地辨别在表面电势（ 图2）的微小变化。从SP地图数据W作为分析后的图像处理软件来测定平均表面电位和标准偏差。使用R打开源代码统计程序进行统计分析。学生t检验进行到以P <0.05比较组正在考虑显著。

SP的图像进行分析，以确定微生物膜表面电位。这些是随后与不同基材表面上的生长比较。这是为了确定是否表面类型对微生物膜表面电位的效果进行。最初我们试图静态孵育MRSA细.......

Discussion

KPFM被用作一种新的技术，用于获得表面电数据。它通常被用作研究化学电荷分布的方法和最近才开始被应用于对微观和纳米尺度的生物系统的研究。从收集到的数据，我们发现，微生物并未以容易地连接到清洗不锈钢和金表面，即使经过3小时的静态培养。聚-L-赖氨酸的官能表面呈30分钟后快速微生物附着。在功能化表面微生物的潜伏期较长时间导致电池过分拥挤样品表面，差的地形图像。表面功能化导致由负SP转向积极的SP不锈钢和黄金表面。以前的研究已经表明，微生物通常具有负的SP由于带负电的离子的周围细胞的螯合剂来保持渗透压和离子平衡^23。它也被称为该磷酸基团中的革兰氏于革兰氏阳性微生物阴性微生物和磷壁酸的存在下进一步导致负的SP ²⁴的形成。知识革兰氏阳性和阴性细胞膜的基本化学促使我们假定阳性基材的SP将导致快速微生物附着。然而，可以看出在图2 - 4，即有一个大的转变，从正到负的MRSA细胞的SP在不锈钢和金基板上。微生物附着可以最初从周围的膜负离子封存发生。经洗涤细胞，并让它们在基板表面上的干的，我们可能已被洗去这种离子的介质。此外，应该指出的是，KPFM数据是仅包括革兰氏阳性（M.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5500ILM 原子力显微镜	Agilent Technologies	#N9435S
AFM/STM 金属样品盘	TED PELLA， INC.	#16219	不锈钢样品盘
DPE （Low-Noise） 导电 SPM 探针	Mikromasch	#HQ：DPE-XSC11	每个芯片有 4 个 Pt 涂层悬臂。我们使用悬臂 B 进行实验。
PELCO 镀金 AFM/STM 金属样品盘	TED PELLA， INC.	#16218-G	金样品盘
PicoView 软件	Agilent Technologies	#N9797B	5500ILM 原子力显微镜成像软件
Pico Image Software （Pico Image Basic）Agilent	Technologies	#N9797AU-1FP	5500 ILM 原子力显微镜 后成像处理软件
Scilogex D3024 高速微量离心机	Thomas Scientific	#91201513	离心机用于细胞洗涤步骤，以从培养基中分离细胞（沉淀）
胰蛋白酶大豆琼脂含 5% 羊血	BD	#221261	预制板
胰蛋白酶大豆肉汤	BD	#257107	为干粉。关于如何制作容器的说明。