本文介绍了一种利用开尔文探针力显微镜生成高分辨率纳米级表面电势图谱的实验方案。该技术被应用于评估表面电势对微生物与基底表面结合能力的影响。
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摘要
摘要
表面电势是一种常被忽视的物理特性，在微生物对基底表面的黏附过程中起主导作用。开尔文探针力显微镜（KPFM）是原子力显微镜（AFM）的一个模块，可测量纳米尺度下表面之间的接触电势差。将KPFM与AFM结合，能够同时生成细菌细胞等生物样品的表面电势图和形貌图。本文中，我们采用KPFM研究表面电势对微生物在医学相关表面（如不锈钢和金）上黏附的影响。表面电势图揭示了不同材料基底上微生物膜表面电势的差异。我们生成了台阶高度图，以显示基底表面与微生物交界区域的表面电势差异。细胞膜表面电势的变化已与细胞代谢和运动性的改变相关联。因此，KPFM是一种强大的工具，可用于研究微生物在黏附至不同基底表面时其细胞膜表面电势的变化。本研究中，我们展示了利用KPFM表征耐甲氧西林Staphylococcus aureus USA100单个细胞在不锈钢和金表面电势的操作流程。
引言
在设备表面和皮肤伤口上形成的生物膜对医疗行业构成了难题，因为生物膜难以清除，可能导致疾病传播率升高以及抗菌素耐药性增强。附着是生物膜形成的第一步，也是最关键的一步，因其具有可逆性1-3。基底表面特性在微生物附着过程中起着至关重要的作用。表面硬度、孔隙率、粗糙度和疏水性等因素已被证明会影响微生物的附着；然而，关于基底表面电势（SP）对微生物黏附作用的研究仍较少4,5。带负电荷的表面可阻止苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）芽孢在云母、硅和金表面的附着6。细胞膜电位的变化可反映细胞附着能力和运动性的改变5,7。已有研究发现，电学性质均一的表面更易促进微生物黏附5。在纳米尺度上表征细菌的表面电势，可为理解细菌在不同表面上的黏附动力学提供一种新途径，从而有助于抗生物污损策略的开发。与其他用于表征细菌电动力学特性的方法（如激光多普勒电泳、Zeta电位和等电点测定）不同，开尔文探针力显微镜（KPFM）能够对单个细胞进行检测，而非整个菌群8-11。这在需要高准确度和高精度比较细胞间或生物膜间电学特性时具有显著优势。
开尔文探针力显微镜（KPFM）是原子力显微镜（AFM）的一个模块。AFM 的发展直接源于扫描隧道显微镜（STM）的发明12。最早使用 STM 获得的图像由 Gerd Binnig 和 Heinrich Rorhrer 于 1982 年发表12。他们的发明通过在空气中用尖锐的导电探针在导电表面上进行光栅扫描，实现了原子结构的分辨。获得高分辨率图像的可能性激发了生物学家的兴趣，他们迅速尝试使用 STM 对 DNA、蛋白质和病毒的干燥样品进行成像12。STM 也可在液体中进行，需使用特殊的探针尖端13。Lindsay 等 人已证明，可在金电极上利用 STM 和 AFM 对 DNA 分子在 10 mM HClO4 及水中的状态进行成像13。KPFM 已被用于测定 DNA 和蛋白质分析中的表面电势25，以及生物分子与配体相互作用的研究26。
KPFM 通过测量 AFM 导电悬臂针尖与理想导电样品之间的接触电势差（CPD）来运行图1，i)14,15样品不一定需要具有导电性（即， 生物样品）。只要非导电表面较薄且其下方具有导电材料，成像可在云母、玻璃和硅表面（非导电）上进行6,7。接触电势差（CPD）相当于表面电势电压，可被描述为针尖（φ尖端）和样品（φ样本)，除以负电子电荷（-e）。当导电的原子力显微镜探针接近样品表面时（两者间距为 d），一种静电力（F是) 是由于费米能级（Fermi energies）的差异而产生的图1，ii，a)15此时，针尖与样品的真空能级（Ev处于平衡并相互对齐。当探针进一步靠近样品表面时，探针与样品表面发生电接触，并形成平行板电容器图1，ii，b)14,15此时，针尖与样品表面的费米能级达到对齐，进入稳态平衡（图1，ii，b）。探针尖端与样品表面将带电并产生静电 VCPD 将由于差异而形成 Ev的和功函数。A F是 由于形成的电接触区域而产生作用 VCPD该力随后通过施加外部作用而被抵消 V直流 与所形成的具有相同大小的尖端 VCPD (图1，ii，c）。该施加的直流电压可消除电接触区域的表面电荷，且消除的电荷量与 V直流 必要以消除 F是 的 VCPD 等于样品表面与针尖之间功函数的差值15需要注意的是，探针的功函数是已知的，由制造商提供。在所有开尔文探针力显微镜（KPFM）方法中，均施加一个交流电压（V交流电，同时在针尖施加约100 - 500 mV的电压，以在针尖与样品之间产生交变的电场力14。这在测量变化时能提供更高的分辨率 VCPD 和/或 F是在这方面，电振荡频率或振幅的变化可通过以下方式校正 V直流, 并可生成表面电势图。可对这些图中特定区域的数据进行进一步分析，以提供有关特定形貌特征的电学信息。
开尔文探针力显微镜（KPFM）可在三种模式下运行：（1）抬升模式，（2）振幅调制（AM）模式，以及（3）频率调制（FM）模式14,16。抬升模式是KPFM的最初实现形式。该模式采用双扫描法：首先，使振荡的探针在样品表面移动以获取形貌图像；在第二次扫描时，将探针抬升至样品表面上方预设距离（10 - 100 nm），并重新扫描同一区域。由于采用双扫描方式，与AM-KPFM和FM-KPFM相比，抬升模式的成像时间最长。将探针远离表面抬升可确保仅测量长程静电力 Fes 。此外，这种操作方式虽以牺牲一定的横向分辨率和灵敏度为代价，但可有效消除形貌与表面电势测量之间的串扰。
AM-KPFM 通过使用双频率同时测量样品形貌和表面电势（单次扫描），提高了横向分辨率和灵敏度14在振幅调制模式下，悬臂梁被机械振荡，通常在其第一共振频率（f0），并通过电振荡（通过一个 V交流电）在其第二共振频率（f1). f信号振幅的变化0 导致地形数据的生成，而f振幅的变化1，由于变化在 F是 和 VCPD，给出表面电位测量数据。f0 和 f1 悬臂的各模式在频率和能量上相距较远，表明串扰被最小化14原子力显微镜的头部电子控制箱（HEB）可分离出两个信号，从而在一次扫描中同时获得形貌和表面电势数据。与AM-KPFM相比，FM-KPFM在生物表面可进一步提高分辨率。14FM-KPFM 与 AM-KPFM 的工作原理不同，前者测量的是静电力梯度的变化，而非静电力本身。F是)15与AM模式类似，FM模式利用双频率和单次扫描机制，同时获取形貌和表面电势数据14在FM模式下，悬臂在频率f处被机械振荡0 并在低修正频率（f）下进行电振荡mod，通常为1 - 5 kHz）。在发生静电相互作用时，f0 和 f模 混合以产生边带 f0 ± fmod这些边带对静电作用力的变化非常敏感，并且可以与f分离0 通过原子力显微镜的 HEB。由于调频开尔文探针力显微术（FM-KPFM）测量的是静电作用力梯度的变化，探针尖端的形状及其维护/完整性对整体表面电势分辨率起着关键作用14, 15使用调幅（AM）和调频（FM）模式在横向上的表面电势分辨率可达1 nm14-16需要注意的是，开尔文探针力显微镜（KPFM）成像可在非极性液体中进行，且最近已证明可在低离子浓度环境中实现。<10 mM）的极性液体（在无需偏压反馈的开环KPFM模式中，无需施加直流偏压），例如MilliQ水；然而，目前尚未在极性溶液中的活细胞上实现KPFM成像17-20. 液体中SP成像的其他挑战在于，常用于维持细胞活性的溶液（即， 磷酸盐缓冲液含有高浓度的可移动离子，这会导致法拉第反应、偏压诱导的电荷动力学以及离子扩散/重新分布20因此，本实验在室温条件下，对固定于聚-L-赖氨酸功能化的不锈钢和金表面的干燥且已死亡的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）细胞进行了测量。成像可在空气或真空条件下对预先干燥或固定于表面的生物样品进行。20潮湿条件也被证明会影响表面的开尔文探针力显微镜（KPFM）成像6.
在本研究中，我们采用荧光显微镜-开尔文探针力显微镜（FM-KPFM）和原子力显微镜（AFM）来考察SP在耐甲氧西林 金黄色葡萄球菌 美国100型（MRSA）对聚-L-赖氨酸功能化的不锈钢和金表面的黏附。MRSA由于其天然选择性对多种β-内酰胺类抗生素和头孢菌素类药物具有耐药性，近年来已被视为多重耐药（MDR）“超级细菌”。21耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染如今更难治疗，更具挑战性和严重性，导致需要使用毒性更强的抗菌药物，如万古霉素或噁唑烷酮类，这些药物对人体的毒性较高，因此不能作为长期治疗方案。22不锈钢因其在医学上的相关性以及作为皮下注射针头、便盆、门把手、水槽等物品的常用材料而被选用。金作为对比金属使用。采用FM-KPFM技术检测微生物膜在附着于基底后表面电位是否发生变化。
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方案
1. 玻璃器皿和培养物的准备
- 在进行本实验之前，准备用于培养耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的5%羊血琼脂（SBA）平板。将SBA平板在37 °C下孵育24小时。此后，应出现单个分离良好的菌落，可用于后续接种至液体培养基中。将划线后含有单个菌落的SBA平板在4 °C下保存1至2个月。
注意：羊血琼脂平板通常以预包装形式提供，每包根据制造商不同包含20至25个平板，其成分为胰蛋白胨大豆琼脂基础培养基，添加5% w/v羊血。 - 配制500 ml含1%葡萄糖和0.1% NaCl的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）。随后，收集并清洗2支玻璃试管。若试管无可用的可高压灭菌盖子，可用铝箔作为封口。对TSB、试管以及一盒1 ml移液器吸头进行高压灭菌。
- 在生物安全柜内或靠近本生灯的位置，将5 ml先前已高压灭菌的TSB加入已灭菌的试管中。注意确保有足够时间使TSB和试管冷却至室温。从先前划线的5% SBA平板中，挑取单个菌落接种至6 ml TSB肉汤中。其中一支试管接种MRSA，另一支作为阴性对照，以确保无菌操作。
- 将接种后的TSB试管置于往复式摇床中，在37 °C、200 rpm条件下孵育24小时。此时，MRSA试管中应可见明显的微生物生长，而对照试管中应无任何生长。
- 从24小时培养物中取1 ml加入6 ml新鲜TSB中。在37 °C、200 rpm条件下孵育6小时。
- 将6小时继代培养物1 ml转移至1.5 ml微量离心管中。在850 × g下离心3分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于1 ml去离子H2O中。再次离心，重复一次，并重新悬浮。
2. 不锈钢和金基底的清洗与接种
- 取不锈钢和金质原子力显微镜样品盘（直径分别为20 mm和10 mm），每侧用5 ml去离子水清洗2用镊子将样品圆盘持于主手，非主手使用移液器在样品圆盘两侧各加入5 ml溶液。清洗完两侧后，将样品圆盘放入含有20 ml去离子水的烧杯中2O，随后超声处理1分钟。
- 超声处理后，用镊子将样品圆片从烧杯中取出。将圆片以60°角倾斜靠在敞开的培养皿边缘，并置于纸巾上。用培养皿的盖子盖住待干燥的圆片。待圆片完全干燥后再进行后续操作。干燥时间通常为4至8小时。
- 干燥后，用镊子将样品圆片放入培养皿中。
- 可选地，用任意材料对样品圆盘的表面进行功能化处理（例如， 胶原蛋白、透明质酸、银纳米颗粒 等等。).
- 在本实验中，使用多聚-L-赖氨酸（poly-L-lysine）对基底表面进行包被。进行多聚-L-赖氨酸功能化时，用移液器吸取200–400 µl的0.1%多聚-L-赖氨酸（溶于H₂O中）2将O）加入样品圆盘中，置于培养皿内，室温孵育1小时。
- 孵育1小时后，用镊子夹取样本圆盘，加入1 ml去离子水洗涤2O. 如所述，在纸巾上晾干 步骤 2.2.
- 取经过两次洗涤并重新悬浮的细胞，在生物安全柜内将200–400 µl细胞悬液接种至样品载片上。若样品载片已包被多聚-L-赖氨酸，则于室温孵育0.5小时。
- 细胞在样品圆盘上孵育后，用1 ml去离子水轻轻洗涤样品圆盘2O. 成像前将圆片室温晾干过夜。
3. KPFM 成像
注意：本实验请使用 Agilent 5500 系列 ILM-AFM。
- 启动AFM时，打开计算机单元以及AFM的HEB和MAC III控制器，然后启动AFM成像软件例如， Agilent 的 PicoView）。务必首先在原子力显微镜上选择ACAFM或适用于间歇接触模式成像的正确模式。
- 使用AFM镊子（主手操作），同时用非主手打开弹簧加载的夹持器，将KPFM悬臂梁放入探头组件中。在操作和转移AFM探头组件至AFM仪器时需格外小心，因为该部件（至少在5500 ILM-AFM型号上）包含控制X、Y和Z扫描方向的易损压电晶体单元。
注意：本实验所用的开尔文探针力显微镜（KPFM）悬臂为 Mikromasch 导电型 DPE（低噪声）悬臂，其平均共振频率为 80 kHz，弹簧常数为 2.7 N/m。选择具有此类共振频率和弹簧常数的悬臂是因其使用方便。具有更大弹簧常数和更高共振频率的悬臂也可用于成像。 - 小心地将探头组件装入原子力显微镜（AFM）中，并连接相应的导线（本例中需插入两根导线：激光光源和载物台升降电机）。
- 将激光对准悬臂的尖端。某些设备配有摄像头功能，可实现更便捷的对准。若原子力显微镜（AFM）未配备摄像头功能，则按以下步骤对准悬臂尖端：
- 顺时针旋转前后调节旋钮，使激光移动至悬臂芯片上方。当激光到达芯片时，光束将被遮挡而不再可见。仅需旋转旋钮数次即可。
- 逆时针旋转前后调节旋钮，直至激光光斑重新出现。此时激光已位于芯片边缘。
- 旋转从左到右的旋钮，将激光对准悬臂。当激光快速扫过悬臂时，会连续地消失和重新出现。激光光斑应能在磨砂玻璃盖上清晰可见，该位置即为后续放置光电二极管组件的位置。
- 逆时针旋转前后调节旋钮，使光斑沿悬臂向针尖方向移动，直至磨砂玻璃上的光斑消失。
- 将前后调节旋钮顺时针轻微旋转，以调整激光位置，使其恰好位于悬臂尖端。激光光斑将重新出现在磨砂玻璃上。
注意：这是针对跳板式悬臂梁的激光定位方法。对于三角形悬臂梁，对准过程略有不同。
- 激光对准后，将样品台升降电机保持在“打开”位置10秒，以确保在将样品安装到原子力显微镜时，悬臂与样品之间留有足够空间。
- 将样品置于KPFM样品台上。使用铜线将样品接地。将AFM的相应导线连接至样品台。将样品台连接至AFM。大多数情况下，样品台通过磁铁固定在位。
- 在原子力显微镜（AFM）软件中，调节悬臂梁，然后开始使悬臂梁探针接近样品。确保稳定时间不超过10毫秒，且接近速度不超过2.0 µm/sec，以避免探针损坏。
- 当探针尖端接触样品表面后，选择成像窗口尺寸和理想的成像区域。调节积分增益（I）和比例增益（P）以及探针设定点，以优化形貌成像。
- 当形貌成像优化后，开启开尔文探针力显微镜（KPFM）模块（可选择调频或调幅模式，此处使用调频模式）。需要注意的是，在5 µm × 5 µm成像范围之外进行KPFM成像极具挑战性。此外，为获得最佳KPFM成像效果，建议采用512 × 512的分辨率，并使用较慢的扫描速度（0.02 – 0.05线/秒）。
- 对于FM-KPFM设置（非ACAFM设置），将驱动百分比设为5%–10%，悬臂梁频率设为1–5 kHz，带宽设为2 kHz。将FM-KPFM设置的I增益和P增益均设为0.3%。
- 在不同样品表面调整信号带宽以及I增益和P增益。为优化SP成像，需进一步调节信号带宽以及I增益和P增益，以获得最佳图像。推荐的I增益和P增益范围为0.22%–0.35%。
- 使用图像后处理软件对采集的开尔文探针力显微镜（KPFM）图像进行处理和分析，以获取表面电势（SP）数据。
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结果
利用开尔文探针力显微镜（KPFM）测量表面电势（SP）的能力依赖于样品表面和悬臂探针尖端在一定程度上均具有导电性的原理。不锈钢和金作为导电表面，用于附着耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。在两种表面上分别采集了15个MRSA细胞的KPFM图像，分辨率为512 × 512，扫描区域范围为5 × 5 µm至10 × 10 µm。扫描时的扫描线速度范围为0.02线/秒至0.05线/秒。因此，每条线采集512个数据点，共需扫描512条线，扫描时间范围为2.84小时至7.11小时。所采集图像的类型见图2。KPFM采用双频率模式工作，因此在获取表面电学特性数据的同时，也同步采集了形貌图像。为更清晰地识别表面电势的微小变化，对SP图应用了热滤波处理（图2）。SP图的数据在图像处理软件分析后，用于确定平均表面电势及其标准偏差。统计分析使用R开源统计编程软件进行，采用学生t检验比较组间差异，以P < 0.05为差异具有统计学意义。
通过分析SP图像以确定微生物膜表面电位，并将其与不同基底表面的生长情况进行比较，旨在探究表面类...
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讨论
开尔文探针力显微镜（KPFM）作为一种获取表面电学数据的新技术被采用。该技术通常用于化学领域中电荷分布的研究，而近年来才开始应用于微米和纳米尺度的生物系统研究。根据所收集的数据，我们发现即使在静态孵育3小时后，微生物似乎也不易附着于洁净的不锈钢和金表面。而经聚-L-赖氨酸功能化的表面在孵育30分钟后即表现出微生物的快速附着。微生物在功能化表面上孵育时间延长会导致样品表面细胞过度密集，从而影响形貌成像质量。表面功能化使不锈钢和金表面的表面电势（SP）由负变正。以往研究表明，由于细胞周围会富集带负电荷的离子以维持渗透压和离子平衡，微生物通常具有负的表面电势23。此外，已知革兰氏阴性微生物中的磷酸基团以及革兰氏阳性微生物中的磷壁酸会进一步导致负表面电势的形成24。基于对革兰氏阳性与阴性细胞膜基本化学性质的了解，我们曾推测正的基底表面电势将促进微生物的快速附着。然而，如图2 - 4所示，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）细胞在不锈钢和金基底上的表面电势均出现了从正到负的显著转变。微生物的初始附着可能源于细胞膜周围负离子的富集作用。但在清洗细胞并使其在基底表面干燥的过...
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披露
作者无任何利益冲突披露。
致谢
作者衷心感谢加拿大自然科学与工程研究理事会、安大略省研究与创新部以及加拿大创新基金会对本研究的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5500ILM 原子力显微镜 | Agilent Technologies | #N9435S | |
| AFM/STM 金属样品圆盘 | TED PELLA, INC. | #16219 | 不锈钢样品圆盘 |
| DPE（低噪声）导电 SPM 探针 | Mikromasch | #HQ:DPE-XSC11 | 每枚芯片含 4 个铂涂层悬臂梁。实验中使用 B 号悬臂梁。 |
| PELCO 金镀层 AFM/STM 金属样品圆盘 | TED PELLA, INC. | #16218-G | 金样品圆盘 |
| PicoView 软件 | Agilent Technologies | #N9797B | 5500ILM 原子力显微镜成像软件 |
| Pico Image 软件（Pico Image Basic） | Agilent Technologies | #N9797AU-1FP | 5500 ILM 原子力显微镜图像后处理软件 |
| Scilogex D3024 高速微型离心机 | Thomas Scientific | #91201513 | 用于细胞洗涤步骤中的离心，以分离细胞（沉淀）与培养基 |
| 含 5% 羊血的胰蛋白酶大豆琼脂 | BD | #221261 | 预制平板 |
| 胰蛋白酶大豆肉汤 | BD | #257107 | 以干粉形式提供。配制方法见容器说明。 |
参考文献
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