细菌表面运动性实验的制备、成像与定量分析

摘要

群集运动受物理和环境因素的影响。我们描述了一种两阶段实验方案及相关指南，以克服群集实验制备和数据采集过程中常见的挑战。本方法采用宏观成像技术，获取当前分析技术无法提供的群集行为的详细信息。

摘要

细菌表面运动性（例如群集运动）通常在实验室中通过平板实验进行观察，这类实验需要特定浓度的琼脂，有时还需在培养基中添加特定营养物质。制备此类明确的培养基和表面生长条件，旨在提供有利环境，不仅支持细菌生长，还能促进细菌在这些表面的薄液膜内实现协调运动。群集平板及其他表面运动性平板实验的可重复性可能面临重大挑战。尤其对于那些仅在0.4%-0.8%（wt/vol）琼脂浓度范围内表现出运动性的“温和地区群集菌”，实验方案或实验室环境的微小变化都可能显著影响群集实验结果。“润湿性”（即平板实验中液-固-气界面的水分含量）通常是需要控制的关键变量。评估群集运动的另一项挑战在于如何量化任意两次（或多次）实验之间观察到的差异。本文详细介绍了一种灵活的两阶段实验方案，用于制备和成像群集实验。我们提供了相关指南，以规避群集实验培养基制备及实验数据量化过程中常见的问题。我们特别展示了本方法在表达荧光或生物发光遗传报告基因（如绿色荧光蛋白（GFP）、荧光素酶（lux 操纵子））或细胞染料的细菌中的应用，以实现延时光学成像。我们进一步展示了本方法在同一实验中追踪竞争性群集物种的能力。

引言

许多细菌通过多种自主推进方式在表面移动。某些运动表型可在实验室中使用平板检测方法进行研究，这些方法受与半固体平板检测体系相关的液体环境影响。一部分有用的表面运动平板检测还需涉及气相——通常是室温空气。因此，任何特定表面运动检测的结果都要求对三个相界面进行严格控制：局部环境的固体表面、液体环境以及气体环境的特性。

在这种三相实验中最常研究的运动模式被称为群集运动。群集运动是指细菌细胞依靠鞭毛推动，在表面的薄液膜中进行的协调性群体移动¹。通常在实验室中使用含有0.4%-0.8%（wt/vol）琼脂的半固体平板实验来研究这种运动方式¹。多种人类病原菌利用这种运动行为来探索并定植人体宿主。例如，Proteus mirabilis 通过群集运动沿尿道上行，到达并定植于膀胱和肾脏²。群集运动通常被认为是生物膜形成的前提步骤，而生物膜形成是许多人类病原菌致病的主要原因³。

不同细菌物种的群集运动表型具有高度变异性；实验的成功与可重复性在很大程度上依赖于多种因素，例如营养成分、琼脂类型与组成、灭菌方案（例如，高压蒸汽灭菌）、半固体培养基的固化过程以及环境湿度（例如，季节性变化）等^3-5。表面运动性反应的变异性凸显了此类研究中所面临的挑战，以及培养基和环境可能产生的显著影响。对于某些群集运动的物种，例如Pseudomonas，群集运动可在多种培养基组成上发生，但所观察到的表型及伴随的群集扩展速率将表现出极大差异³。综合来看，这些因素使得表面运动性研究极具挑战性。实验室内的季节性变化可能影响这类三相实验：实验在夏季潮湿空气中可能表现更佳，而在冬季干燥空气中则效果较差。本文提供了通用指南，以规避在进行表面运动性平板实验时最显著的一些挑战。

在某些表面运动性研究中，特定表型的形成备受关注。大多数（但并非全部）已发表的研究表明，P. aeruginosa 在群游时会从接种中心向外辐射形成须状或分形结构^3-9。不同 P. aeruginosa 菌株之间的差异已有文献记录^5,8，但是否形成须状结构在很大程度上取决于群游运动平板实验所使用的特定培养基和实验方案。本文详细介绍了如何促进 P. aeruginosa 形成须状群游的实验方法。由于 P. aeruginosa 仅仅是众多群游细菌中的一种，我们还提供了本方法用于研究 Bacillus subtilis 群游以及 Myxococcus xanthus 滑行运动的详细说明。与 P. aeruginosa 类似，目前对 B. subtilis 和 M. xanthus 的研究涵盖多个领域，研究人员正致力于解析其孢子形成、运动性、应激反应及过渡行为等方面的机制^1,10。因此，有必要对这些细胞在群游群体中的特定行为模式及其动态过程进行量化分析。

表面运动性数据的获取、分析与解释可能较为繁琐且具有定性性。我们开发了一种用于细菌群游详细宏观分析的方案，该方案不仅能提供群游区域的形态和大小（例如，直径），还能提供关于群游扩展速率以及细菌或生物产物密度分布的定量动态信息⁷。此外，该方法可利用现有的荧光蛋白、发光信号和染料，全面观察细菌间的相互作用⁸，并追踪群游过程中生物产物（例如，P. aeruginosa 鼠李糖脂^7,8）的合成情况。

方案

1. 群体迁移实验培养基的制备与接种^4,5,7,8,11

1. 培养基制备
   注意：下述培养基成分适用于 P. aeruginosa 卷须形成研究。请参见培养基的具体要求 表1 用于 P. aeruginosa, B. subtilis，以及 M. xanthus 表面运动性实验
   1. 混合 200 ml FAB-minus (NH₄⁺) 培养基与 0.8 g 琼脂，完全溶解后分装至 50 ml 锥形瓶中，每瓶 25 ml。₄)₂SO₄ 群游培养基（材料表）、0.9 g Noblе 琼脂和 0.2 g 酪蛋白氨基酸（Casamino acids）表1) 通过磁力搅拌器搅拌实现。使用小体积（100–300 ml）以提高实验间的一致性。
   2. 使用22分钟暴露时间和121.1℃暴露温度对200 ml琼脂/培养基混合物进行高压灭菌 °C，并提供快速排气选项。高压灭菌设置可确保充分灭菌和琼脂融化，同时防止琼脂焦化。
      注意：Noble 琼脂易发生焦糖化；焦糖化的琼脂会改变细菌的运动性。
   3. 灭菌程序结束后，立即关闭培养基瓶的瓶盖，以防止水分蒸发损失。但需注意，过紧地盖紧瓶盖可能会在瓶内产生类似“真空密封”的效应。
   4. 将培养基冷却至 50 °C，同时加入 2 ml 无菌的 1.2 M 葡萄糖。或者，将培养基置于 60 °将培养基置于C培养箱或水浴中，待用时取出（最多可保存15小时），并按指示进行后续操作。为防止培养基中产生气泡，需使用磁力搅拌子充分混匀；琼脂表面的气泡会阻碍细菌的均匀蔓延。
      注意：对于其他实验，可根据需要在此步骤添加不能高压灭菌的热敏感成分，如额外的营养物质或染料（例如，添加8 µ每 100 ml 熔化的琼脂中加入 l Invitrogen Syto 63 染料以用于成像 M. xanthus 如代表性结果部分所示）。添加某些染料可能影响基础的群集运动行为，应通过与不含染料的对照组比较进行验证。
   5. 在实验室生物安全柜中，将7.5 ml无菌培养基分装至每个直径为60 mm的聚苯乙烯培养皿中，并将培养皿单层放置（不可叠放）。对于较大的群游表面，将25 ml培养基分装至每个直径为100 mm的培养皿中。必须在水平的台面上进行培养皿的加样操作。使用圆形气泡水平仪检查台面是否水平。
      注意：对于 P. aeruginosa 使用每块平板特定的培养基体积可提高一致性与可重复性。 B. subtilis 以及 M. xanthus 检测中，手工倾注所得结果与特定体积移取相当。
2. 平板干燥处理
   1. 对于小型培养皿（60 mm），将融化的琼脂培养基置于超净台中，敞口静置使其充分凝固（既形成半固体状态，又蒸发掉多余液体）即，不加盖）30 分钟。较大的培养皿（100 mm）需要更长的凝固时间（见讨论部分）。
      注意：或者，某些实验可能需要将平板在台面上覆盖放置过夜（20–24 小时）进行固化即，盖上盖子）单层放置表1）。群集运动对湿度过高和不足均敏感。实验室的湿度、气流和温度条件可能需要调整平板干燥时间，以促进目标细菌的最佳群集运动。
   2. 干燥期结束后立即接种平板。不要将平板储存以供后续使用。
      1. 通过在测试平板上点加10 μL墨水进行“墨水扩散试验” µ0.50%（体积/体积）Higgins 防水炭黑墨水与细菌接种物的混合液¹¹. 如果墨水/接种物混合液迅速扩散（即 当液滴在培养基表面无法保持原有形态（即不能维持液滴形状）时，培养基需要更长的干燥时间。
         注意：对于对湿度特别敏感的物种（例如, P. aeruginosa），进行快速的“墨水扩散测试”¹¹ 以确定平板是否已足够干燥。
3. 群游实验接种
   1. 接种6 ml液体培养基（参见 表1 有关细节，请使用新鲜培养基上单个分离菌落（< 室温下放置5天的LB（Lysogeny Broth）平板培养物。将液体培养物在30℃下培养过夜（≤18小时）。 °C 或 37 °C，水平摇动（240 rpm）。
   2. 通过点样1-5 μL菌液接种 swarm 平板 µ过夜肉汤培养物的1微升，或用无菌牙签或金属接种针轻戳琼脂。
      注意：我们更倾向于后一种方法，因为它降低了接种物飞溅的可能性，并避免向 swarm 表面区域添加额外的水分。
4. 群游实验培养
   1. 对于常规实验，将群游实验平板在30℃下孵育 °C 或 37 °C（甚至42 °C for B. subtilis; 表1——这取决于具体的细菌种类。培养期间将平板倒置，使多余的水分凝结在盖子上，而非琼脂表面。
      注意：温度可能影响表型及动力学过程。 P. aeruginosa 群游，37℃培养 °C 下的生长和群集扩张速度比 30 °C 培养更快 °C；然而，这些群落的形态通常会因温度的改变而有所不同。
   2. 对于延时成像，将 swarm 平板在适宜温度下孵育，待其转移至成像工作站前（参见 表1 详情见下文。
      注意：此成像前孵育步骤可使菌群在转移至新环境之前开始发育并稳定建立，而新环境可能对群游运动有利，也可能不利。

2. 表面运动性实验的宏观成像^7,8

1. 对于延时成像，在预成像孵育期结束后，将群集运动检测平板放置于商用成像仪内的透明成像板上 在体内 成像工作站。每次可同时成像最多六块直径60 mm或四块直径100 mm的培养皿。由于相机从成像平面下方采集图像，需将培养皿倒置，以确保光路不受阻碍⁸. 或者，在30℃下孵育 °C 或 37 °C表1在整个实验过程中保持恒温，并在设定的时间间隔将待成像的平板从培养箱中取出。
2. 将培养皿的皿盖倒置在盛有接种培养基的对应培养皿上方。向培养皿的皿盖中加水，以防止成像过程中样品过度干燥，并用另一个透明托盘将整个装置罩住，以在整个实验过程中维持湿度。
3. 使用分子成像（MI）软件¹²，在室温下使用所述成像条件进行实验 表 2对于延时成像，设置包含必要步骤和参数的实验方案。

3. 数据处理与解读^7,8

1. 图像处理
   1. 使用 MI 软件批量导出图像为 16 位 TIFF 文件：文件 > 导出或批量导出 > 选择要导出的文件及导出位置。
   2. 使用 ImageJ 打开单张图像或导入延时成像序列：
      1. 打开单个图像：文件 > 开放
      2. 导入延时图像序列：文件 > 导入序列，然后选择“按数字顺序排序名称”。
         1. 对于较大的延时成像文件，在“导入序列”窗口中选择“使用虚拟堆栈”，以将导出的图像按适当类别堆叠即，GFP，RFP， 等等。).
   3. 如有需要，将图像从16位文件转换为8位文件：图像 > 类型 > 8位
      注意：某些 ImageJ 工具需要 8 位图像。
   4. 确定图像或时间序列的强度信号是否需要反转。将光标置于图像中的亮斑处例如，荧光标记的生长）并从 ImageJ 工具栏中记录信号强度“Value”。然后将光标移至培养皿区域外的暗区，记录该处的信号强度。如果暗区的信号强度大于亮区的信号强度，则需要对图像信号强度进行反转（按以下子步骤 1-2 操作）。
      1. 反转强度信号：编辑 > 倒置
      2. 反转查找表：图像 > 查找表 > 反转LUT
   5. 减去背景：处理 > 减去背景，并使用“滚动球半径”，其像素半径为图像某一维度的一半例如，2,000 x 2,000 像素图像对应的分辨率为 1,000 像素。
   6. 人工为图像或延时序列着色：图像 > 查找表，并从列表选项中选择适当的颜色。
   7. 对于包含两个或以上通道的视频，在保存为视频文件前需合并并平衡各通道颜色（图像处理）, 第8步）。要合并图像，请在ImageJ中打开所有图像堆栈，然后选择图像 > 颜色 > 合并通道，并将每个图像栈分配至相应的颜色通道。
   8. 将延时序列保存为 AVI 或 QuickTime 电影：文件 > 另存为，并选择所需的格式和参数。
2. 数据分析
   1. 获取细菌表面生长面积以量化扩张速率
      1. 在 ImageJ 中打开图像
      2. 使用“直线”工具在培养皿中心画一条线，测量其长度（单位为像素），以计算培养皿的像素直径：分析 > 测量
      3. ImageJ 中的默认测量单位是像素。通过将实验平板的直径（例如，60 mm 培养皿则除以此前步骤中获得的像素长度。
      4. 将测量单位从像素更改为毫米：图像 > 特性
         1. 将“长度单位”更改为“mm”，并将“像素宽度”、“像素高度”和“体素深度”设置为上一步计算出的转换系数。勾选“全局”选项，以在多幅图像中保持该转换系数的一致性。
            注意：如果关闭并重新打开 ImageJ，或更改了图像的视野（即，一张图像的放大倍数高于另一张），则必须重新计算转换系数。或者，可先以像素为单位进行所有分析，再转换为毫米。
      5. 对于每一帧，使用工具栏中的“自由选择”工具勾勒群集边缘，并通过以下步骤测量面积：分析 > 测量。这将生成一个可保存的测量日志，用于在 Microsoft Excel 或类似程序中进一步分析：文件 > 另存为
   2. 获取细菌表面生长强度以量化表面生长速率
      1. 背景扣除后（图像处理，步骤5），使用序列的最后一帧来确定群集运动的最大面积（数据分析，步骤1）。
      2. 使用工具栏中的“椭圆”选择工具，在细菌表面生长区域周围绘制一个框。
      3. 使用“分析”功能设置框内像素的平均强度测量值 > 设置测量参数，并选择 "平均灰度值".
      4. 为了获取延时序列中每一帧的强度信号测量值，在序列的第一帧时进入：Analyze > 测量。这将生成一个可保存的测量日志，用于在 Microsoft Excel 或类似程序中进一步分析：文件 > 另存为
   3. 替代前一部分（数据分析，步骤2）。使用 ImageJ Macros 插件设置并运行 Macros 表面生长强度测量脚本。
      1. 设置自动化测量脚本以同时分析多个图像帧：插件 > 新 > 宏，并将提供的脚本（如下）粘贴到该框中，保存为 ImageJ 宏文本文件：文件 > 保存，并保存到 ImageJ 应用程序文件夹下的“macros”目录中。
         numberOfFrames = N
         for(i=0; i< numberOfFrames; i++){
         运行（测量）；
         运行('下一帧 [>]');
         }
         注：此处变量“N”代表未定义数量的图像帧。
      2. 在运行脚本之前，根据图像序列中的帧数，编辑宏插件中每次实验的“numberOfFrames”参数。使用：插件 > 宏 > 编辑，并在序列中输入正确的帧数，然后保存（文件 > 保存
      3. 按照数据分析-步骤2中的子步骤1-3操作，在序列的第一帧上运行宏插件：插件 > 宏 > 运行。这将生成一个测量日志，可保存并在 Microsoft Excel 或类似程序中进行进一步分析：文件 > 另存为

结果

平板制备过程中的差异会显著影响细菌群游运动。倾注熔化的琼脂培养基后的凝固或干燥时间，会影响表面运动性实验中表面液膜的厚度，以及细菌随时间推移的运动能力。营养成分的变化也会影响多种细菌的群游行为。图1A展示了干燥时间对墨水扩散以及Bacillus subtilis¹¹初始接种物扩散的短期影响。图1B显示了干燥时间的影响，图1C则展示了硫酸铵[(NH₄)₂SO₄]对群游型P. aeruginosa⁵后续须状结构发育的影响。

通过多种成像策略获取表面运动性的终点图像，可得到可量化的数据。图2展示了铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）群集运动及其相应的GFP荧光图像、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）群集运动及其相应的生物发光图像，以及黄色粘球菌（Myxococcus xanthus）表面生长和SYTO 64染色细胞的相应红色荧光图像。

将数据采集范围扩展至不仅限于终点结果的检测与成像，可实现对表面生长细菌动态行为的研究。 图3⁷ 展示了一个示例 P. aeruginosa 群集运动（通过GFP表达细胞成像）及其相关的鼠李糖脂产生（使用尼罗红脂质染色成像）——这些图像数据的定量分析也一并展示，以显示扩张速率 P. aeruginosa 群集运动 视频 1 显示了一段延时影像 B. subtilis 利用发光成像的群集运动 lux表达菌株。 视频 2⁸ 显示了一段延时影像 P. aeruginosa （绿色—表达GFP）和 沙门氏菌 enterica 血清型鼠伤寒沙门氏菌（红色—表达 lux在竞争性群体迁移实验中。

图 1：表面运动性实验制备中影响实验结果的各种因素示例。 （A）琼脂干燥时间对琼脂表面湿度及枯草芽孢杆菌（B. subtilis）接种物扩散的影响（引自参考文献⁸）；（B）琼脂干燥时间对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）群游运动的影响（经许可转载自参考文献⁵）；以及（C）硫酸铵的有无对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）群游运动及菌丝形成的影响。

图2： 使用Bruker成像系统对细菌表面生长与运动性进行成像的替代方法 并排图像，左侧为相机图像，右侧为Bruker图像，显示（A) P. aeruginosa 表达GFP——使用绿色荧光设置成像，（B) B. subtilis 表达 lux 生物发光报告基因——使用发光成像设置进行成像, 以及（C) M. xanthus 用SYTO 64染色——使用Red Fluorescence II设置成像。参见 表2 用于设置详细信息。

图3：表面运动性实验的定性与定量分析。（A）细胞密度分布的时间序列分析，鼠李糖脂产生情况（使用红光荧光I设置拍摄的尼罗红脂质染色图像；比例尺 = 15 mm），以及（B）基于P. aeruginosa群集运动的细胞密度分布图像对扩展速率的定量分析。（转载自参考文献⁶，经许可。）

视频 1. 延时成像 B. subtilis 群集 B. subtilis 表达 lux 并使用发光设置进行记录。参见 表2 用于设置详细信息。

视频 2. 通过延时成像可视化种间竞争。 蜂群的 P. aeruginosa （绿色；表达GFP并使用绿色荧光设置记录）和 S. enterica 血清型鼠伤寒沙门氏菌（红色；表达 lux 并使用发光设置进行记录）。参见 表 2 设置详情请参见参考文献（经许可重印自参考文献）⁷.)

	P. aeruginosa	P. aeruginosa 菌丝形成研究	B. subtilis	M. xanthus
过夜液体培养基	FAB 加 30 mM 葡萄糖	FAB 加 30 mM 葡萄糖	LB	CTT
过夜液体培养孵育温度	37 °C	37 °C	37 °C	30 °C 下孵育 30 小时
群集迁移培养基	FAB	FAB 去除 (NH4)2SO4	2% (wt/vol) LB	CTT
群集迁移培养基：额外组分	12 mM 葡萄糖a	10% (wt/vol) CAA，12 mM 葡萄糖a	n/a	SYTO® 64a
琼脂类型	Noble 琼脂	Noble 琼脂	颗粒状琼脂	Noble Affymetrix 琼脂
琼脂浓度 (wt/vol)	0.45%	0.45%	0.60%	1.50%
群集迁移平板尺寸	60 mm	60 mm	100 mm	150 mm
每板培养基体积	7.5 ml	7.5 ml	手工倾注	手工倾注
群集迁移培养基凝固/干燥方法	通风橱；平板敞口	通风橱；平板敞口	台面；平板加盖	台面；平板加盖
群集迁移培养基凝固/干燥时间	30 分钟	30 分钟	过夜（20–24 小时）	过夜（20–24 小时）
群集迁移实验孵育温度	30 或 37 °C	30 °C	37 °C	30 °C
延时成像孵育条件	30 °C 至少 4 小时	30 °C 至少 4 小时	37 °C 2 小时	室温 12 小时
延时成像持续时间	24 小时	24 小时	10 小时	66 小时
延时成像设置	每 10 分钟 1 帧	每 10 分钟 1 帧	每 6 分钟 1 帧	每 10 分钟 1 帧
a高压灭菌后添加。

表1：表面运动性检测制备规格。包含铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）和黄色粘球菌（M. xanthus）的表面运动性检测制备规格。

信号	绿色荧光	红色荧光 I	红色荧光 II	生物发光
蛋白或染料	绿色荧光蛋白 (GFP)	mCherry 蛋白或尼罗红鼠李糖脂染料	SYTO® 64	lux 操纵子来源的荧光素酶
激发波长 (nm)	480 ± 10	540 ± 10	590 ± 10	关闭
发射波长 (nm)	535 ± 17.5	600 ± 17.5	670 ± 17.5	无滤光片
曝光时间 (秒)	30	60	60	240
f-值	4.0	4.0	2.5	1.1
视场 (mm)	190	190	140	120
焦平面 (mm)	27.5	27.5	12.2	4
像素合并 (像素)	无	2 x 2	无	8 x 8

表2：成像参数。 Bruker成像系统用于细菌表面生长的红色和绿色荧光及生物发光成像的技术参数。

讨论

在实验室中实现可重复的细菌群游运动具有挑战性，因为群游实验对湿度和营养物质等环境因素高度敏感。表面运动平板实验最关键的要素是琼脂表面的湿度。接种前，群游培养基必须足够干燥，以防止细菌在表面液层中游动，但又不能过于干燥而抑制群游运动。⁵孵育应在足够湿润的环境中进行：湿度过低可能导致实验体系在孵育过程中干燥，而湿度过高则可能引起人为或非真实的表面扩散现象。除非具备可控制湿度的孵育箱，否则孵育箱及实验室内的湿度可能波动显著。因此，可能需要在孵育箱内增设额外的水源、加湿器或除湿器，以防止过度干燥或湿气积聚，同时将相对湿度维持在接近80%的水平。若季节性湿度变化较大，则维持这一理想湿度可能具有挑战性。在此情况下，需对 swarm 实验方案进行适当调整以适应季节性湿度变化。我们发现，调整 swarm 培养基的干燥时间是应对季节性湿度变化最简便的方法。建议持续监测孵育箱内外的湿度。此外，建议研究人员对其仪器、孵育箱、天平等设备进行校准和验证 等等。 因为温度、体积或培养基成分用量上的微小误差都可能影响这些实验的可重复性。

还应注意，实验中所用培养皿的类型和大小会影响平板的湿度，从而影响群集运动。密封的培养皿无法排出多余的水分，容易导致细菌的游动运动。相反，敞口的培养皿则会散失过多水分。而培养皿（Petri dish）提供了理想的环境，因其可排出足够的多余水分以防止液体积聚，同时保留足够的湿度以避免培养基干燥。本方法详细描述了一种适用于高质量成像的表面运动性实验方案。为了保持琼脂透明以利于成像，直径为60 mm的培养皿中加入7.5 ml琼脂培养基。如果不需要精细成像，使用最多20 ml的培养基体积也可获得可重复的结果。

虽然多种琼脂浓度均可实现细菌群游运动，但不同物种进行群游所需的最适琼脂浓度范围各不相同。总体而言，较高的琼脂浓度会抑制群游运动，从而延长获得适合成像的群游结果所需的时间。P. aeruginosa 通常在0.4–0.7%的琼脂浓度下发生群游¹，但我们发现其最佳群游范围更窄（0.4–0.5%）。其他细菌如B. subtilis和S. enterica在0.6%琼脂中群游，而Vibrio parahaemolyticus则在1.5%琼脂中群游¹⁰。所需琼脂浓度还受琼脂类型和品牌的影响。高纯度琼脂（如贵族琼脂，Noble agar）可显著增强P. aeruginosa的群游能力，优于颗粒状琼脂^13,14。然而，这类高纯度琼脂在高压灭菌过程中更容易发生焦糖化；根据所用设备的不同，可能需要采用缩短或修改后的灭菌程序（例如调整排气阶段以避免长时间受热），以成功制备含贵族琼脂的群游培养基。

培养基成分在观察到的群集表型中也起着重要作用³。P. aeruginosa 的群集运动研究通常使用最低营养培养基进行。我们更倾向于使用FAB培养基^4,8（材料表），但其他培养基（如M9、LB或这些常用培养基的微小变体）也已成功应用^9,15,16。在以葡萄糖为碳源并添加酪蛋白氨基酸（CAA）但不额外添加氮源（即不含(NH₄)₂SO₄）的FAB最低培养基上，最有利于触须结构的形成^6,13。如果研究重点并非触须形成或形态，则建议使用不含CAA的FAB最低培养基（材料表；表1），以便详细研究特定碳源和/或额外营养成分的影响。其他物种（如本文所展示的B. subtilis）具有较强的群集适应性，能够在LB培养基和颗粒状琼脂上进行群集运动。这些物种易于群集，仅需约10小时即可形成完整的群集。这种快速的群集速度可能使追踪群集进程变得困难，但我们的方案使此类追踪变得非常可行。进行群集延时成像的能力显著简化了群集数据的获取过程，尤其对于此类活跃群集的菌种而言更为便利。

我们提出了一种可靠且全面的两阶段实验方案及配套指南，旨在提升细菌表面运动性研究的实施效果与可重复性，并重点强调了与鞭毛介导的群集运动研究相关的关键环节。该群集运动实验方案详细阐述了培养基组成及表面运动平板操作中的重要步骤，有助于提高不同研究团队内部及团队之间实验结果的一致性与可重复性，从而改善不同研究之间比较的基础。此外，本方案通过提高研究人员对环境因素影响的认识，并提供可能的解决方案（例如，琼脂浓度的微小变化如何影响群集运动^4,5），使群集运动与表面运动性研究对环境波动的敏感性降低。同时，本方案中提供的宏观群集运动量化方法，使得许多以往难以量化的细菌表面生长特征得以被精确测量。

在本方案的开发过程中，我们并未考察所有具有表面运动能力的细菌。因此，对于本文未涉及的菌种，可能需要对方案进行相应修改。本方案的效率受限于所用设备和材料的固有局限。例如，由于布鲁克成像系统不具备温度控制功能，目前尚无法开展与温度相关的研究。此外，染料的使用（如用尼罗红染色鼠李糖脂）可能存在动力学和浓度方面的限制⁸。该技术高度依赖于数字图像的处理与分析；若能进一步实现数据分析的自动化（例如，在 ImageJ 中使用额外的宏脚本功能），将减少分析所需时间，并提升数据的可用性。最后，鉴于成像方案具有良好的稳健性，未来的研究应用应致力于将该技术扩展至更不均一的生长表面，以更贴近环境和致病菌所定植的自然表面。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂a
FAB 最小培养基：			每约4周制备一次。补至1 L 加 nanopure H2O.
（NH4)2SO4	Sigma	A4418	2 g 未使用于 P. aeruginosa 卷须形成研究。
Na2HPO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	S9390	9 g
KH2PO4	Sigma	P5655	3 g
NaCl	BDH	BDH8014	3 g
MgCl2 x 6H2O溶液（198 g/L）	Fisher Scientific	M33	1 ml
CaCl2 × 2H2O溶液（14 g/L）	Fisher Scientific	C79	1 ml
微量元素溶液（见下文）	n/a	n/a	1 ml
微量元素溶液：			加纳米纯水至 1 L2O. 用玻璃瓶保存，搅拌并用铝箔覆盖。
CaSO4 × 2H2O	Sigma-Aldrich	255548	200 mg
MnSO₄4 x H2O	Sigma-Aldrich	M7634	20 mg
CuSO₄4 x 5H2O	Fisher Scientific	C493	20 mg
ZnSO₄4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	Z4750	20 mg
CoSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	C6768	10 mg
NaMoO4 × 2H2O	Sigma	S6646	10 mg
H3BO3	Fisher Scientific	A74	5 mg
FeSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	F7002	200 mg
CTT 培养基：			根据需要配制，用纳米纯水定容至 100 ml2O.
Tris-HCl，1 M 溶液（调节至 pH 8.0）	Amresco	0234	1 ml 制备1 M的储存液，使用纳米纯水溶解，定容至所需体积。2O. 将pH调整至8.0，并通过滤膜除菌（0.2 μm 孔径）。
K2高倍显微镜观察4，1 M 溶液（调节 pH 至 7.6）	Sigma-Aldrich	P3786	0.1 ml 制备1 M的储存液，使用纳米纯水2O. 调节pH至7.6，并通过滤膜除菌（0.2 μm 孔径）。
MgSO₄4 溶液	Fisher Scientific	M65	0.8 ml 制备1 M的储存液于纳米纯水中2O. 过滤除菌（0.2 μm 孔径）。
胰蛋白胨	BD 诊断	225930	1 g
附加试剂：
LB肉汤，Lennox型	BD 诊断	240230	2%（wt/vol）
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G5767	30 mM 用于过夜液体培养；12 mM 用于 swarm 培养基。 制备1.2 M的滤膜除菌储备液，使用纳米纯水2O. 在高压灭菌后加入培养基中。
酪蛋白氨基酸（Casamino acids，CAA）	Amresco	J851	0.10%（wt/vol） 推荐用于 P. aeruginosa 卷须形成研究。在培养基灭菌前加入。
琼脂，Noble	Sigma-Aldrich	A5431	0.45%（wt/vol） 首选 Noble 琼脂用于 P. aeruginosa 表面运动性研究。在高压灭菌前加入培养基中。
琼脂，Noble	Affymetrix	10907	1.50%（wt/vol） 用于 M. xanthus 表面运动性研究。不推荐用于 P. aeruginosa 运动性研究。在高压灭菌前加入培养基中。
琼脂，颗粒状	Fisher Scientific	BP1423	0.60%（wt/vol）
Higgins 防水黑色印度墨水	Higgins	HIG44201	0.50%（vol/vol） 将墨水与接种物混合以检测 swarm 培养基表面湿度。
SYTO® 64 红色荧光核酸染料	Invitrogen	S-11346	使用 4 μ升（用于 P. aeruginosa）或 8 μ升（用于 M. xanthusSYTO的）® 每100 ml熔融琼脂中加入64
相关材料与设备
培养皿，无菌，150 毫米 × 15 毫米（直径 × 高）	VWR	25384-326
培养皿，无菌，100 毫米 × 15 毫米（直径 × 高）	VWR	25384-342
培养皿，无菌，60 mm × 15 mm（直径 × 高）	VWR	25384-092
In-Vivo Xtream	Bruker		用于表面运动性研究的宏观成像。http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html
Bruker MI 软件	Bruker		http://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/PreclinicalImaging/Brochures/MI-software-brochure.pdf
ImageJ 软件	美国国立卫生研究院		http://imagej.nih.gov/ij/
a参见试剂的材料安全数据表（MSDS）以获取操作和处置信息。