一种无创评估血管功能与形态的方法学途径

摘要

本文介绍了在医学研究中常用于评估动脉粥样硬化不同阶段的多种血管功能和形态无创检测方法的方法学考量。

摘要

内皮是血管系统的最内层，参与维持血管稳态。内皮损伤可能使血管易于发生动脉粥样硬化，并增加心血管疾病的风险。外周内皮功能的评估是血管壁早期异常的可靠指标，且与冠状动脉内皮功能的评估结果具有良好的相关性。本文详细描述了利用激光多普勒成像结合离子导入法评估微血管内皮功能、利用血流介导的血管舒张功能评估大血管内皮功能，以及利用颈动脉超声评估颈动脉粥样硬化的关键方法学步骤。同时对每种技术的方法学考量进行了讨论，并对未来研究提出了建议。

引言

血管内皮是血管壁的最内层，通过调控多种血管活性过程参与维持血管稳态。这些过程的紊乱可能使血管易于发生动脉粥样硬化，并增加心血管疾病（CVD）的风险¹。外周内皮功能是血管壁早期异常的良好指标²。此外，外周内皮功能的检测已被证明能够反映冠状动脉内皮功能^3-5，因此被视为心血管疾病的良好预测指标^6-9。鉴于目前普遍认为动脉粥样硬化是一种全身性病变，这一现象并不令人意外¹⁰。对外周内皮功能的评估通常通过量化血管对特定刺激的舒张反应来实现，舒张反应减弱提示内皮功能障碍¹¹，且可在不同的血管床中进行测量。对血管结构进行更深入的评估则可通过超声检查内膜-中膜厚度来实现。

在微循环中，激光多普勒血流仪（LDF）结合血管扩张剂激动剂的离子电渗给药，以及激光多普勒成像（LDI）可提供有关微血管灌注的有用信息¹²。这两种技术均通过测量运动红细胞散射光所产生的多普勒频移来工作。灌注以血流通量（blood flux）表示，而非血流量（ml/min），其中血流通量反映的是红细胞平均速度和浓度。血流通量的测量与实际血流量呈线性相关¹³。相较于LDF，LDI的评估具有显著优势，因为与LDF不同，LDI能够扫描较大区域，从而考虑到皮肤血流的异质性，并提高该技术的可重复性¹²。

激光多普勒灌注成像（LDI）中增加血流的刺激是通过离子导入血管扩张激动剂乙酰胆碱（ACh）和硝普钠（SNP）进入皮肤实现的，该方法利用微弱电流将药物导入皮肤¹⁴，分别用于评估内皮依赖性和非内皮依赖性血管功能。药物透过皮肤后，ACh 与内皮细胞上的毒蕈碱受体结合，释放血管扩张剂一氧化氮（NO）。而 SNP 则直接激活平滑肌细胞受体，使血管达到最大程度的扩张，从而评估血管平滑肌的完整性¹⁵。目前尚存一定争议，即 ACh 介导的血管扩张是否完全依赖 NO，因为 ACh 可能还通过非 NO 通路（如环氧化酶介导的通路）发挥作用¹²。尽管如此，我们先前的研究已报道，在心血管疾病（CVD）风险升高的患者群体中，ACh 和 SNP 的反应均受到损害¹⁶，并且已知可提高 NO 生物活性的运动干预也能通过 LDI 改善 ACh 介导的血流响应¹⁷。将这些药物导入皮肤微血管的常用载体包括氯化钠溶液或去离子水^18,19。微血管内皮功能可通过多种方法进行量化，其中皮肤血管导率——即血流值除以动脉压——常用于研究过程中血压可能发生改变的情况（例如，运动或抗高血压治疗期间）¹²。另一种常用的量化方式是计算血流曲线下面积，或表达为相对于基线血流值的百分比增加。需要注意的是，目前尚无统一的数据呈现标准，但研究者应采用具有良好可重复性的分析方法。

在大血管中，通过血流介导的扩张（FMD）和硝酸甘油介导的扩张（GTN）分别评估内皮依赖性和非内皮依赖性血管功能²⁰。FMD通常在肱动脉中进行，使用袖带阻断动脉血流5分钟；释放袖带后，肱动脉内的血流会突然增加（反应性充血），从而引起剪切应力介导的血管扩张。通过超声成像测量血管在袖带释放前后的直径，并采用人工方法²⁰或自动边缘检测软件^21,22对血管直径进行后续分析。GTN的使用有助于判断血管舒张异常是由于平滑肌细胞完整性受损，还是内皮细胞一氧化氮（NO）释放功能障碍所致²³。FMD和GTN均以刺激后血管直径相对于基线直径的百分比增加来表示。

正确评估FMD需要在研究方案中考虑多个重要因素^24,25。止血带阻塞的持续时间必须精确控制；5 min 的阻塞时间足以引发一氧化氮（NO）介导的血管扩张，而更长时间的阻塞则会导致非NO介导的扩张²⁶。同样，将阻塞止血带置于腕部且远离超声探头的位置，主要引发NO介导的扩张；而将止血带置于上臂且位于探头近端时，仅能部分激活NO通路²⁷。此外，在止血带放气后需持续观察较长时间以测量最大扩张峰值，因为在放气后最初60 sec 内测量最大直径可能会使FMD值低估25–40%²⁸。实际上，观察180 sec 通常足以捕捉到真实的最大直径，大多数峰值出现在放气后前120 sec 内²⁸。

FMD 的刺激因素涉及剪切应力的产生，后者可激活特定的内皮受体以释放一氧化氮（NO）²⁹。然而，剪切应力也可能激活多种其他血管活性因子（其中部分因子可能引起血管收缩）³⁰，因此必须确保所诱发的剪切应力刺激能够反映来自 NO 通路的血管舒张效应²⁶。在进行 FMD 检测时，还应考虑剪切应力刺激的影响，其中剪切速率（流速/血管直径）的计算可作为剪切应力的适当衡量指标，但未必能反映峰值血流³¹。近期的生理学建议指出，当超声系统支持脉搏波速度与主动 B 模式成像在双工模式下同步测量时，应始终对剪切应力的时相特征进行表征²⁵。

采用B型超声评估颈动脉可提供颈动脉内膜中层厚度（cIMT）的信息，该方法最早由Pignoli及其同事于1986年描述³²。cIMT的评估反映了平滑肌细胞向血管内膜的增殖，是早期动脉粥样硬化临床事件的有用预测指标³³。与磁共振成像或放射学评估等类似技术相比，颈动脉超声通常能更准确地预测动脉结构³⁴。此外，cIMT与多种经典的CVD危险因素相关，包括衰老、高血压和血脂异常³⁵。颈动脉壁的改变通常由一氧化氮（NO）生物利用度降低引发，从而促进血管内的炎症反应³⁶。颈总动脉、颈内动脉以及颈动脉分叉处均可用于测定cIMT，因为这些部位均能类似地预测心血管事件³⁷。

在本论文中，我们提供了关于微血管内皮功能（激光多普勒血流成像结合离子导入法）、大血管内皮功能（血流介导的血管舒张功能及硝酸甘油介导的血管舒张功能）以及血管形态学（颈动脉内膜中层厚度）评估的详细方法学。动脉粥样硬化是一个多阶段的过程，起始于内皮功能障碍，并最终在大动脉中形成局灶性动脉粥样硬化病变。选择上述检测方法的理由在于，它们能够反映动脉粥样硬化的不同阶段，并有助于解释血管系统的异质性³⁸。此外，我们先前的研究已表明，在心血管疾病风险升高的患者人群中，微血管内皮功能与大血管内皮功能相互独立³⁹，且血管的功能性评估与结构性评估亦彼此独立⁴⁰。因此，对血管系统的整体评估有助于解析动脉粥样硬化的各个发展阶段。

方案

注意：本方案遵循达德利区NHS基金会信托人类研究伦理委员会的指南。所有所述技术均应在温度受控的实验室（21 – 22 ^oC）内进行，且环境需保持稳定的光照并避免噪音。要求接受评估的个体在测试前12小时 内禁食、禁饮、禁止吸烟及避免运动。在适当情况下，应至少在测试前12小时 停用血管活性药物。

1. 激光多普勒成像结合离子导入法

1. 打开激光多普勒成像仪（LDI），让扫描仪自动稳定约30分钟。启动LDI软件，点击“Measurement”（此时将显示软件的主界面）。在主界面上，选择窗口顶部任务栏中的“Ionto Protocol”。
2. 手动输入实验方案（本实验室采用的方案共包含13次扫描，离子电渗药物递送的电流设置在第2至第11次扫描期间，电压为30 µa）。将第1次扫描设为无电流的基线扫描，第12次扫描 & 13 作为恢复扫描，同样不施加电流。点击“确定”以确认设置并返回主界面。
3. 让受试者在半卧位椅子上放松，前臂以90度角置于一个舒适且坚实的枕头上，并在前臂下方放置一块黑色垫子。
   注意：垫子有助于减少由组织周围背景表面产生的伪影。必须将受试者的手臂牢固地绑在枕头上，以避免移动及其相关的伪影。
4. 将每个亚克力腔室另一端的有线插头连接至离子电渗控制器。将装有2.5 ml 1%乙酰胆碱（ACh）溶液的腔室连接至离子电渗控制器的阳极接口，将装有2.5 ml 1%亚硝基铁氰化钠（SNP）溶液的第二个腔室连接至阴极接口。使用0.5%生理盐水溶液在腔室内混合两种试剂。通过双面粘性贴片将两个腔室固定于受试者右前臂掌侧皮肤表面。
5. 用32 mm盖玻片覆盖腔室，以防止液体泄漏。
6. 开始扫描前，打开主屏幕左上角的“Scanner Setup”窗口。选择“Video and Distance”选项卡，然后选择“auto distance”功能，以测量扫描仪探头与受试者前臂之间的距离。
   1. 自动距离测量完成后，选择“图像扫描”选项卡，然后单击窗口右下角的“标记”按钮，确定需要扫描的区域。如有需要，可在窗口顶部附近的“扫描区域”部分手动输入扫描区域的尺寸，以调整感兴趣区域的大小。确保感兴趣区域包含每个离子电渗室的直径，并具有足够大的范围，以减少皮肤血流的变异性。
7. 评估完成后，保存数据文件。使用 LDI 图像分析软件打开数据文件，进行灌注测量。
   1. 在主软件窗口中点击“图像回顾”，然后打开待分析的图像文件。
   2. 使用软件在每个腔室外径周围标记出感兴趣区域。调整感兴趣区域，使其准确贴合腔室所在位置。然后点击“statistics”图标，将显示一列包含每个腔室中位灌注单位的数据。记录每个腔室的基线灌注单位，以及此前12次扫描中每次的最高灌注游戏副本
      注意：本分析方法仅适用于本实验室；然而，也可采用其他方法来表达激光多普勒成像（LDI）扫描所获得的数据。有关全面综述，请参阅Roustit和Cracowski发布的指南 ¹².
8. 为计算对乙酰胆碱（ACh）和硝普钠（SNP）反应的灌注百分比变化，用峰值灌注值减去基线灌注值，除以基线灌注值，再乘以100。
   注意：在我们的实验室中，乙酰胆碱（ACh）和硝普钠（SNP）相对于基线的灌注变化显示出良好的观察者内变异系数，分别为7%和6%。

2. 血流介导的舒张与硝酸甘油介导的舒张

1. 打开多普勒超声仪及连接的装有血管图像分析（VIA）软件的计算机。
   注：VIA 软件可实时采集图像（每秒 25 帧），并提供血管直径信息以及超声仪检测到的血管边界的清晰度信息。也可使用其他软件包，其可能包含额外功能和设置。建议查阅特定软件的操作手册。
2. 请受试者在半卧位扶手椅上放松，并将手臂平放在身体侧方的舒适枕头上，与心脏水平齐平。在受试者手腕处佩戴血压袖带。
   注：应要求受试者尽量保持手臂静止，以避免测量过程中出现运动伪影。
3. 将超声仪的线阵探头固定于立体定位夹具中，并用蝶形螺母拧紧夹具，使超声探头保持固定位置。
   注：夹具可确保在定位到血管后，超声探头保持稳定。
4. 在超声仪上进入“菜单”界面，将扫描频率设为 5 MHz，并优化超声仪的深度（推荐深度设置为 3.5 cm）和增益参数。调节增益设置，以确保血管近壁和远壁的亮度对称。
5. 使用线阵探头，在纵向扫描平面上定位肱动脉，该动脉通常位于肘前窝上方 2–10 cm 处。在此阶段进行必要调整以优化图像质量。为帮助识别动脉，开启彩色多普勒以显示搏动性动脉血流，并将其与连续性静脉血流区分开。使肱动脉在屏幕上呈水平走向；其应显示为两条实性平行线，两条线之间为清晰区域，代表血管的管腔。
6. 为使 VIA 软件自动记录血管直径，使用光标标记预设的兴趣区域，以检测并追踪动脉的前壁和后壁。
   注：可通过主软件界面上的“x”和“y”按钮调节兴趣区域的大小。
7. 在 VIA 软件中点击“开始”，对动脉成像 2 分钟。随后，在 VIA 软件中点击“充气”，同时将手腕处的血压袖带充气至高于收缩压的压力（通常高于 220 mmHg），持续 5 分钟。
   注：手腕袖带的作用是阻断手部血流。
8. 5 分钟 后，放空血压袖带以诱导反应性充血，在健康血管中，这将刺激一氧化氮（NO）介导的血管舒张。
   注：放气后血管扩张峰值可能在 180 秒 内出现，因此建议在放气后继续记录血管直径至少 3 分钟 。
9. 经过 10 分钟休息后，使用线阵探头重新定位肱动脉，并以与步骤 2.7 相同的方式记录 2 分钟 的基础直径数据。
10. 随后，请受试者将一片 500 µg 的舌下硝酸甘油（GTN）片剂置于舌下，并继续测量肱动脉直径 5 分钟。该时段结束后，请受试者取出 GTN 片剂，并监测其是否出现药物不良反应。
11. 所有数据分析均在离线状态下进行。每次评估每秒可获得 25 个数据点；在 Microsoft Excel 中将这些数据合并为每秒一个数据段。将数据导出至数字信号分析软件，并使用 3 秒移动平均滤波器进行滤波。
12. 从袖带充气前 120 秒 的数据中确定基础直径。目视检查基础段数据，排除伪影。对剩余的基础段数据取平均值，得到基础直径。
13. 进行血流介导舒张（FMD）分析时，使用软件自动扫描放气后的区域以寻找最大舒张峰值，并用光标标记该峰值以供目视检查。若峰值识别有误，可用光标选择一个更局限的区域，以便重新识别峰值。将该峰值记录为最大直径。
14. 对 GTN 数据采用与 FMD 分析相同的流程，但搜索峰值的时间段应位于给药后 5 分钟 内。
15. 计算 FMD % 和 GTN % 时，用峰值直径减去基础直径，除以基础直径，再乘以 100。
    注：在本实验室中，FMD 的观察者内变异系数为 11%，GTN 为 12%。

3. 颈动脉内膜中层厚度

1. 让受试者舒适地平躺在床上，并在头部下方放置一个枕头，以支撑颈部。
2. 将心电图（ECG）导联连接至多普勒超声仪，然后将其贴附于受试者的肢体上。仅需获得基本的心电图波形，因此将相应的导联放置于左、右上臂以及左脚踝处。
3. 通过滚动“菜单”设置超声仪器参数，将扫描频率设为 10 MHz，并优化扫描深度（推荐深度设置为 3 – 4 cm）和增益参数。调节增益，确保血管近壁和远壁的回声亮度对称。
4. 让受试者头部轻微向左倾斜，使用线阵探头，沿右侧颈动脉的全部节段（包括颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉）以纵向扫描平面进行扫查，识别是否存在斑块。保存显示斑块证据的图像。为帮助识别动脉，寻找血管的分叉点，该点表现为颈总动脉分为颈内动脉和颈外动脉。
5. 测量颈动脉内膜中层厚度（cIMT）时，应在颈动脉球部近端 1 cm 处、无斑块的颈总动脉节段获取至少 3 张图像。所有图像应在心电图 R 波峰值时采集，此时刻对应心室舒张期，血管所受剪切应力最小。
6. 在左侧颈动脉重复步骤 3.4 和 3.5。进行该侧测量时，请受试者头部轻微向右倾斜。
7. 为获得清晰的血管近壁和远壁图像，在检查过程中应仔细操控超声探头，确保血管与超声束垂直。可通过轻微调整探头的倾斜角度和旋转方向，以及对探头近端至远端方向（ heel-toe 运动）施加的压力进行微调来实现。
8. 使用动脉测量软件（AMS）离线分析图像，依据 Pignoli 线识别血管边界。加载待分析图像，然后使用光标在无斑块的血管节段划定感兴趣区域。点击软件中的“detect”按钮，记录屏幕上显示的 cIMT 和管腔直径数值。
   注意：准确读数仅能从远壁获得，因此忽略近壁的测量结果。
9. 每侧各取三次测量值，分别计算右侧和左侧颈动脉的平均 cIMT。再将两侧的 cIMT 值进一步取平均，得到总体 cIMT。
   注意：本实验室中该技术的观察者内变异系数为 9%。
10. 使用相同软件手动标记斑块范围，对斑块进行测量。在 AMS 中点击“classify”，软件将自动计算斑块的回声强度，并根据其破裂易感性进行分级。点击“Plaque Characteristics”窗口查看相关信息。

结果

激光多普勒成像结合离子电渗疗法

健康中年女性（无心血管疾病）经激光多普勒成像扫描后测得的中位血流灌注单位如图所示 图1两种药物ACh和SNP均引起中位血流灌注量显著增加。ACh的基线血流灌注量为48 perfusion units，SNP为67 perfusion units。ACh诱导的峰值血流灌注量达455 perfusion units，SNP为446 perfusion units。与基线相比，ACh和SNP分别使灌注量增加了831%和566%。所报告的数值高度依赖于用于检测皮肤血流灌注的设备以及环境因素。

血流介导的血管舒张与硝酸甘油介导的血管舒张

图2展示了无心血管疾病（CVD）的健康年轻男性在FMD和GTN评估中的基线与峰值血管直径。FMD和GTN评估中肱动脉的基线直径为3.0 mm。FMD检测中的峰值直径为3.3 mm，而GTN评估中的峰值直径为3.9 mm，分别较基线水平增加了10%和30%的血流量。

颈动脉内膜中层厚度

图3显示了一名健康个体的左侧颈总动脉。cIMT值通过自动边缘检测软件进行计算。远壁的cIMT为0.83 mm，血管管腔直径为7.71 mm。同一受试者右侧颈总动脉的结果分别为cIMT 0.87 mm，管腔直径7.80 mm。两侧测量值取平均后，cIMT为0.85 mm，管腔直径为7.76 mm。

图1. 激光多普勒成像联合离子电渗疗法对血流灌注量变化的影响。 在完成基线扫描以测定基础血流灌注量后，使用30 µa电流进行乙酰胆碱（ACh）和硝普钠（SNP）的离子电渗，并连续完成10次扫描（扫描1至10）。离子电渗后，再进行两次恢复期扫描。ACh = 乙酰胆碱；SNP = 硝普钠。

图2. 血流介导性扩张与硝酸甘油介导性扩张。该图表显示了基线直径以及在施加血流介导性扩张和硝酸甘油介导性扩张刺激后峰值直径的明显增加。FMD = 血流介导性扩张；GTN = 硝酸甘油介导性扩张。

图3. 颈动脉超声扫描。 显示左侧颈动脉的超声扫描图像，感兴趣区域位于颈动脉球部（分叉处）近端1 cm处。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文详细介绍了可在外周血管系统中进行的多种血管功能和形态学评估方法。每种评估方法均可提供有关动脉粥样硬化不同阶段的信息，并有助于表征不同血管区域的血管特征。

我们先前报道过，在心血管疾病（CVD）风险升高的类风湿关节炎患者群体中，微血管内皮功能与大血管内皮功能相互独立³⁹。此外，在同一组患者以及患有心血管疾病的患者中，血管功能与形态学的评估结果也彼此独立^40,41。这些发现可能归因于不同血管区域的内皮细胞在功能和结构上的异质性³⁸，以及血管功能改变向形态学异常进展过程中可能存在的时间延迟。Hashimoto 及其同事的一项研究⁴²显示，部分动脉粥样硬化参与者表现出降低的血流介导舒张（FMD）值，但颈动脉内膜中层厚度（cIMT）值正常。这些结果提示，采用多种方法评估亚临床动脉粥样硬化对于解析心血管疾病的总体影响具有重要意义。

微血管在健康和疾病中的重要性正日益受到医学文献的广泛关注。微血管所形成的表面积远大于大血管，使其成为有害刺激导致损伤的重要靶点⁴³。有假说认为，微血管可能是炎性介质的主要来源，这些介质可浸润大血管内皮，进而导致病变形成⁴³。在2型糖尿病患者中，微血管病变通常先于大血管病变发生⁴⁴；而在其他心血管疾病（CVD）风险增加的人群中（如类风湿性关节炎患者），能够降低CVD风险的干预措施可改善微血管内皮功能，但对大血管内皮功能无明显改善^45,46。综合这些发现表明，研究微血管功能可能有助于阐明动脉粥样硬化启动的复杂机制。

在本研究中，采用激光多普勒灌注成像（LDI）结合血管活性物质离子导入法，对微血管内皮功能进行了评估。此外，还可使用其他多种方法来评估微血管功能，包括甲襞毛细血管显微镜检查和静脉阻断体积描记法。然而，前者仅能提供有关微血管形态的信息，而后者则耗时较长，在某些方案中因需给予肱动脉内血管活性药物而具有侵入性¹。相比之下，LDI提供了一种简单且高效的方法，可通过无创方式给予血管活性物质，进而测量皮肤血管微循环灌注的反应。由于皮肤血流易于检测，并且与已确立的心血管疾病（CVD）具有高度相关性，其测量值在文献中已获得广泛认可¹²。此外，与激光多普勒血流仪等其他多普勒技术相比，LDI的优势在于能够同时扫描特定区域内的多个位点，从而可校正细胞运动伪影以及皮肤血流的空间差异——这两者均可能影响血管的灌注情况^47,48。

尽管离子导入具有明显的优势，但需要注意的是，离子导入引起电流诱导的血管扩张（CIV）可能会干扰血管活性物质的作用，尤其是在阴极处。选择合适的药物递送溶媒有助于减轻这种影响，其中0.5%氯化钠溶液（如本方案中所用）已被证明可有效限制CIV¹⁸。此外，使用较大直径的导入室和低电流（如本方案中所采用的条件）也有助于减少CIV¹⁸。建议同时设置对照位点¹²。生物学和行为学因素也可能影响该技术的可靠性和可重复性。例如，昼夜节律变化和吸烟已被证实会影响微血管内皮功能^49,50。为了获得准确的结果，必须严格遵守标准化的记录条件，并在设计实验方案时遵循既定的指南¹²。

测量FMD和硝酸甘油（GTN）介导的血管舒张可提供关于大血管内皮功能障碍的信息，广泛应用于无创性血管研究中。FMD技术可间接反映一氧化氮（NO）的生物利用度，是不同临床人群中心脏事件的有效预后指标^7-9。在本研究中，所采用的实验方案考虑了充分激发NO介导血管舒张所需的多种因素²⁵。例如，阻塞袖带置于超声探头远端并环绕于腕部²⁷，缺血持续时间为5 min ²⁶，并在反应性充血后留出足够时间以记录“真实”的最大血管直径²⁸。遗憾的是，该方案未包含剪切应力谱的表征，因为自动边缘检测软件无法同时记录血管直径和脉搏波速度信号。剪切应力的计算对于FMD的准确测量至关重要²⁶，因此我们建议，尽可能使用能够实现此类测量的软件进行血管研究。

FMD 和 GTN 介导的血管扩张评估也容易受到环境和生物变异的影响²⁴，因为血管直径的微小变化即可引发显著的 FMD/GTN 反应。例如，健康受试者的典型 FMD 值范围为 5–10%⁵¹，对于直径为 5 mm 的动脉而言，这相当于动脉直径变化 0.25–0.5 mm。鉴于动脉直径的变化如此微小，必须仔细控制可能影响测量结果的技术和生物学因素。事实上，FMD 可受到多种生物学和行为学因素的影响，例如交感神经激活⁵²、睡眠剥夺⁵³、咖啡因摄入⁵⁴、吸烟⁵⁵、抗氧化治疗⁵⁶以及一天中的不同时段⁵⁷。因此，应参考现有指南中的建议^24,25，对这些因素进行有效控制。

采用颈动脉内膜中层厚度（cIMT）评估已进展但处于亚临床阶段的动脉粥样硬化。该技术已在多个临床人群中得到应用，与磁共振成像等更为复杂的技术相比，能够更详细地反映动脉结构³⁴。与其他血管检测技术一样，cIMT 的测量需仔细考虑可能影响测量结果的技术因素。通常，cIMT 应在颈总动脉远壁无斑块的区域进行测量。与内皮依赖性血管舒张功能（FMD）类似，cIMT 的测量也采用高分辨率超声技术，因此测量结果高度依赖操作者水平。文献报道的变异系数（CofV）范围为 2.4 – 18.3%⁵⁸，而 FMD 的变异系数则为 1 – 84%⁵⁹。然而，即使由经验丰富的超声操作人员在严格控制外部因素的条件下进行这两种技术操作，变异系数仍然较高^58,60,61。造成这一现象的原因之一可能是血管边界的分析通常采用人工方法进行^60,61。此类分析可能降低结果的可靠性，因为图像伪影（如假性边界）、超声信号噪声以及血管形态扭曲等因素均可能影响图像的判读²²。

近年来，连续自动边缘检测软件的进展显著提高了血管壁边界的检测能力^21,22。在本研究中，采用VIA软件测量肱动脉直径，而AMS用于检测cIMT。使用这些软件可大幅降低操作者依赖性，但在AMS的情况下，当图像质量较差时，仍可在一定程度上由操作者进行干预控制⁶²。使用自动边缘检测软件的实验室通常具有较低的变异系数（CofV）^58,63,64，因此所有血管研究实验室都应致力于将血管边界自动测量纳入常规，以确保结果的准确性。在发表研究结果时，报告特定实验方案的重复性研究结果也是一种良好的科研实践。

尽管血管功能评估在临床研究中被常规使用，但现有技术存在一个局限性，即激光多普勒成像联合离子导入法（LDI with iontophoresis）和血流介导性血管舒张功能（FMD）尚无公认的正常参考值。因此，必须对健康、年龄和性别相匹配的对照组进行检测，以便将实验组的结果与之比较。尽管这些技术在多种已存在心血管疾病（CVD）证据的人群中与不良预后相关^6-9，但目前仍缺乏充分研究探讨内皮功能障碍与心肌梗死、脑卒中等不良心血管事件之间的关系。尚需进一步的前瞻性研究来解决这些问题。另一个局限性在于评估和分析过程依赖人工操作，这可能引入潜在的偏倚；然而，通过使操作者对结果设盲，或由不同于操作者的人员进行结果判读，可在一定程度上减少此类偏倚。此外，必须确保结果判读者遵循标准化的数据分析流程，以保证所有数据的一致性分析。

综上所述，本论文详细介绍了成功评估外周循环中微血管和大血管内皮功能以及血管形态所需的方法学步骤。联合使用这些评估方法可提供有关动脉粥样硬化不同阶段的整体信息。未来有必要开展进一步的前瞻性研究，以探讨这些技术的潜在诊断价值。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
激光多普勒成像仪	Moor Instruments, Devon, UK	moorLDI2
离子电渗控制器	Moor Instruments, Devon, UK	MIC2
Miochol-E 20 mg	Novartis UK	由医生处方	用于内皮依赖性功能的乙酰胆碱
Nitroprussiat Fides 50 mg	Rottapharm Spain	由医生处方	用于内皮非依赖性功能的硝普钠
多普勒超声	Siemens PLC, Camberley UK	Accuson Antares
硝酸甘油 500 mcg	Alpharma, Barnstaple, UK	由医生处方