本文介绍一种从小鼠异质性骨髓中大量生成单核细胞的实验方案，适用于转化医学研究。与其他方法相比，该新方法通过避免使用高梯度磁性细胞分选（MACS）等昂贵技术，减少了实验动物的使用数量并降低了成本。
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本文内容
摘要
摘要
作为白细胞的一个亚型以及巨噬细胞的前体细胞，单核细胞参与了机体的多种重要生理过程，常成为生物医学科学多个领域的研究对象。下述方法是一种从异质性骨髓中分离小鼠单核细胞的简单有效手段。
通过用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗Balb/c小鼠的股骨和胫骨获取骨髓。细胞悬液中添加巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），并在超低吸附表面培养，以避免单核细胞因黏附而发生分化。在不同时间点对单核细胞的特性和分化情况进行表征。采用荧光激活细胞分选（FACS）技术，结合CD11b、CD115和F4/80等标记物进行表型分析。培养结束时，悬液中单核细胞比例为45%±12%。通过去除黏附的巨噬细胞，纯度可提高至86%±6%。分离后，单核细胞可用于多种实验，其中最有效且常用的方法之一是 体内 给药方式为尾静脉注射。
这种分离与应用技术对于小鼠模型研究具有重要意义，特别是在炎症或免疫学领域。单核细胞也可用于小鼠疾病模型的治疗研究。
引言
单核细胞的分离对于许多研究至关重要 体外 和 体内 研究。这些细胞是外周动脉疾病、冠心病或其他缺血性疾病的靶细胞，因为侧支血管的生长主要由局部炎症驱动。炎症反应包括内皮细胞活化以及白细胞（主要是单核细胞）的局部募集，单核细胞随后成熟为巨噬细胞，并通过分泌多种生长因子，诱导小动脉重塑为功能性的侧支动脉，从而形成高度促动脉生成的微环境。1-3单核细胞还可分化为树突状细胞，后者常用于免疫学研究4,5 以及癌症研究6,7.
从外周血中分离单核细胞的方法存在一个难题8：大多数分析需要足够数量的单核细胞，因此需要大量供体动物。以往的实验方案描述了密度梯度离心和通过MACS9进行细胞耗竭等单核细胞分离方法；然而，这些技术可能改变单核细胞的特性和功能，从而导致结果解释困难10,11。此外，这些方法操作复杂，并可能降低实验的可重复性。
本实验方案旨在提供一种简单且经济高效的方法，以大量获取骨髓来源的单核细胞。由于该方法可获得高达 11 × 106 ± 3 × 106 个细胞的产量，因此在分离骨髓来源单核细胞过程中，可显著减少所需实验小鼠的数量。该操作流程耗时短，且无需使用上述昂贵或复杂的实验技术。....
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方案
本研究经萨克森州和萨克森-安哈尔特州德累斯顿/哈勒政府主席团批准进行，符合德国动物保护法第8条的规定（批准编号：24D-9168.11-1/2008-24）。
1 细胞分离
1.1 股骨和胫骨的制备
- 使用封闭容器中汽化的 5% 异氟烷浓度对小鼠进行麻醉。当小鼠停止活动达 3 秒后，实施颈椎脱位。
- 用 96% 乙醇对后肢进行消毒。使用无菌手术刀去除皮肤和肌肉，并分离骨骼。
- 从腹股沟处开始皮肤切口，沿内踝方向延伸切口，并在小腿下部周围进行环形皮肤解剖。通过从远端向近端剥离，完全去除腿部皮肤。
- 用锋利的手术刀将股四头肌从股骨上分离，去除前腓骨肌群和腓肠肌群，并通过定位和解剖韧带，在髋关节处将腿部脱臼分离。
- 从前侧开始，小心旋转腿部，环绕关节切断韧带，从而实现关节脱位。
- 用 96% 乙醇清洗股骨和胫骨，至少持续 90 秒，以确保无菌细胞制备。随后使用无菌 PBS 继续清洗，以去除残留的乙醇。
注意：所有后续步骤必须保持无菌，以避免污染。
1.2 骨髓的采集
- 使用一把精细的剪刀剪去每根骨骼的近端和远端，以暴露股骨和胫骨干。操作时需格外小心，因为这些骨骼极易断裂。
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结果
从小鼠骨髓中提取的细胞悬液包含多种细胞类型。主要的细胞类型包括淋巴细胞、粒细胞和单核细胞。细胞类型的鉴定可通过细胞大小和颗粒度进行估计，图1展示了原始悬液以及分化培养5天后收获的细胞的相应结果。请注意培养过程中细胞组成的动态变化。然而，对细胞群体进行准确分类必须依赖于特异性细胞标志物的表达特征。
用于鉴定单核吞噬细胞系统（MPS）细胞的最重要标志物是 CD115，它作为 M-CSF 受体发挥作用，并特异性地表达于单核前体细胞、单核细胞和巨噬细胞上。因此，该标志物可能不适用于区分 MPS 的不同亚群，但可用于可靠地评估向单核细胞/巨噬细胞谱系分化的细胞绝对数量。有关 CD115 在分化过程中表达的时间进程，请参见图 2。
成熟标志物 F4/80 可用于区分幼稚单核细胞、成熟单核细胞和巨噬细胞。与不表达该标志物的幼稚单核细胞前体相比，巨噬细胞表现出强烈的 F4/80 表达。成熟单核细胞则呈现中等水平的 F4/80 表达。因此，联合使用 CD115 和 F4/80 .......
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讨论
我们介绍一种简单且经济高效的方法，可从骨髓中分离出大量小鼠单核细胞。与其他使用外周血的方法相比，该方法获得的单核细胞产量更高：传统方法的单核细胞产量5为1.4 × 106，而本方法可从单只供体小鼠获得11 × 106 ± 3 × 106个单核细胞。
在考虑该方法的挑战时，必须指出在非无菌条件下操作可能带来的污染风险。如果冲洗及后续洗涤步骤未正确执行，很可能导致细菌和真菌污染。此外，骨髓包含由粒细胞、淋巴细胞和红系细胞组成的异质性细胞悬液。通常情况下，由于缺乏生长因子，这些细胞在培养的第2至第3天会逐渐消失。在生长因子诱导分化后，巨噬细胞成为主要的污染来源。为了降低巨噬细胞的数量并尽量减少单核细胞向巨噬细胞的分化，使用超低吸附培养板以及上述的洗涤步骤至关重要。
很难找到一种仅特异性表达于单核细胞的标志物。由于不同标志物之间存在干扰，因此需要同时使用多种标志物，且在分析细胞悬液时，细胞的粒度和大小存在变异性。图1-3
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由德国研究基金会（DFG，Deutsche Forschungsgemeinschaft）SFB 854（Sonderforschungsbereich，合作研究中心）资助。
感谢德国马格德堡奥托·冯·格里克大学视听媒体中心的 Hans-Holger Gärtner 提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6孔超低吸附培养板 | 康宁公司，纽约，美国 | 6孔超低吸附培养板，带盖，无菌 | |
| 8至12周龄雄性BALB/c小鼠 | Charles River，德国苏尔茨菲尔德 | ||
| 96孔板 | Greiner bio one有限公司，德国弗里肯豪森 | ||
| 蓝色死细胞染料 | 德国达姆施塔特 Life technologies GmbH | ||
| 牛血清白蛋白 | GE Healthcare，德国弗赖堡 | V组分，pH 7.0 | |
| 导管 | B. Braun，美尔松根股份公司，德国美尔松根 | 28G，30G | |
| CD115 | eBioscience，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | 12-1152 | |
| CD11b | eBioscience，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | 53-0112 | |
| 细胞培养皿 | Greiner Bio-One GmbH，德国弗里肯豪森 | 盖上盖子，灭菌 | |
| 离心 | 贝克曼库尔特有限公司，克雷费尔德，德国 | 阿莱格拉® X-15R 离心机 | |
| 脱毛膏 | 维特，曼海姆，德国 | ||
| 消毒剂 | Schülke&Mayr GmbH，德国诺德施泰特 | Kodan Tinktur forte | |
| 一次性手术刀10号 | Feather安全剃刀有限公司，大阪，日本 | ||
| EDTA | Sigma Aldrich，德国汉堡 | ||
| 乙醇 96% | Otto Fischar GmbH und Co KG，萨尔布吕肯ü肯岑，德国 | ||
| Pipetus 提取装置 | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG，埃伯施塔特，德国 | ||
| F4/80 | AbD Serotec, Dü德国杜塞尔多夫 | MCA497APC | |
| FACS 缓冲液 | 由本课题组利用单一组分制备而成 | PBS，0.5% BSA，0.1% NaN3 | |
| FACS 仪器 | 美国新泽西州富兰克林莱克，贝克顿·迪金森公司 | BD FACS Canto II | |
| FACS 管 | Becton, Dickinson and Company，美国新泽西州弗兰克林湖 | ||
| Falcon® 移液器 | 美国纽约贝克顿·迪金森实验器材公司 | ||
| 胎牛血清 | Sigma Aldrich，德国汉堡 | ||
| 精细镊子 | 鲁比斯，斯塔比奥，瑞士 | ||
| 手套 | Rösner-Matby Meditrade GmbH，德国基弗斯费尔登 | ||
| Gr1 | eBioscience，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | 53-5931 | |
| 加热板 | Labotect GmbH, Gö德国哥廷根 | 加热板 062 | |
| 培养箱 | Ewald Innovationstechnik GmbH，德国巴特嫩多夫 | Incu safe | |
| 异氟烷 | Baxter Deutschland GmbH，Unterschleißheimß德国海姆 | ||
| 光学显微镜 | 卡尔·蔡司 SMT 有限公司，奥伯科亨，德国 | Axiovert 40 °C | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | Sigma Aldrich，德国汉堡 | SRP3110 | |
| 机械振荡器 | IKA，德国施陶芬 | ms2 微型振荡器 | |
| Medium 199 | PAA实验室有限公司，奥地利帕兴 | 37℃预热 °使用前将水浴锅预热至 C | |
| 微量离心管 | Eppendorf AG，德国汉堡 | ||
| 微生物操作台 | Thermo Electron，LED GmbH，德国兰根塞尔博德 | Hera 安全 | |
| 单核细胞洗涤缓冲液 | 由本课题组利用单一组分制备而成 | PBS、0.5% BSA、2 mM EDTA | |
| 小鼠固定器 | 各种 | ||
| NaCl | Berlin Chemie AG，德国柏林 | ||
| NaN3 （乙酸钠） | Sigma Aldrich，德国汉堡 | ||
| 血细胞计数板 | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Kö尼格斯霍芬，德国 | ||
| 尼龙细胞筛 | 美国新泽西州富兰克林莱克斯，贝克顿·迪金森公司 | 细胞滤网，70 µm 网孔尺寸 | |
| 青霉素/链霉素 | Sigma Aldrich，德国汉堡 | ||
| 磷酸盐缓冲液 | 德国达姆施塔特 Life technologies GmbH | pH 7.4，无菌 | |
| 移液器 | Eppendorf AG，德国汉堡 | 10µ升/100µl/200µl/1,000µl | |
| 移液头 | Eppendorf AG，德国汉堡 | ||
| 血清移液管 | Greiner Bio-One GmbH，德国弗里肯豪森 | Cellstar 5 ml，10 ml | |
| 负压吸引装置 | Integra bioscience，Fernwald，德国 | Vacusafe comfort | |
| 手术剪 | Word Precision Instruments, Inc.，美国萨拉索塔 | ||
| 注射器 | B. Braun，美尔松根股份公司，德国美尔松根 | 1 ml Omnifix® - 1 mL 胰岛素注射器 | |
| 带盖试管 | 德国弗里肯豪森，Greiner bio one 公司 | 15 ml/50 ml Cellstar 管 | |
| 温水浴 | Julabo Labortechnik GmbH，Seelbach，德国 | Julabo SW22 |
参考文献
- Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Hum Gene Ther. 15 (1), 1-12 (2004).
- Herold, J., Tillmanns, H., Xing, Z., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C.
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重印与许可
