小鼠骨髓来源单核细胞的分离与静脉注射

摘要

本文介绍一种从小鼠异质性骨髓中大量生成单核细胞的实验方案，适用于转化医学研究。与其他方法相比，该新方法通过避免使用高梯度磁性细胞分选（MACS）等昂贵技术，减少了实验动物的使用数量并降低了成本。

摘要

作为白细胞的一个亚型以及巨噬细胞的前体细胞，单核细胞参与了机体的多种重要生理过程，常成为生物医学科学多个领域的研究对象。下述方法是一种从异质性骨髓中分离小鼠单核细胞的简单有效手段。

通过用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗Balb/c小鼠的股骨和胫骨获取骨髓。细胞悬液中添加巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），并在超低吸附表面培养，以避免单核细胞因黏附而发生分化。在不同时间点对单核细胞的特性和分化情况进行表征。采用荧光激活细胞分选（FACS）技术，结合CD11b、CD115和F4/80等标记物进行表型分析。培养结束时，悬液中单核细胞比例为45%±12%。通过去除黏附的巨噬细胞，纯度可提高至86%±6%。分离后，单核细胞可用于多种实验，其中最有效且常用的方法之一是 体内 给药方式为尾静脉注射。

这种分离与应用技术对于小鼠模型研究具有重要意义，特别是在炎症或免疫学领域。单核细胞也可用于小鼠疾病模型的治疗研究。

引言

单核细胞的分离对于许多研究至关重要 体外 和 体内 研究。这些细胞是外周动脉疾病、冠心病或其他缺血性疾病的靶细胞，因为侧支血管的生长主要由局部炎症驱动。炎症反应包括内皮细胞活化以及白细胞（主要是单核细胞）的局部募集，单核细胞随后成熟为巨噬细胞，并通过分泌多种生长因子，诱导小动脉重塑为功能性的侧支动脉，从而形成高度促动脉生成的微环境。^1-3单核细胞还可分化为树突状细胞，后者常用于免疫学研究^4,5 以及癌症研究^6,7.

从外周血中分离单核细胞的方法存在一个难题⁸：大多数分析需要足够数量的单核细胞，因此需要大量供体动物。以往的实验方案描述了密度梯度离心和通过MACS⁹进行细胞耗竭等单核细胞分离方法；然而，这些技术可能改变单核细胞的特性和功能，从而导致结果解释困难^10,11。此外，这些方法操作复杂，并可能降低实验的可重复性。

本实验方案旨在提供一种简单且经济高效的方法，以大量获取骨髓来源的单核细胞。由于该方法可获得高达 11 × 10⁶ ± 3 × 10⁶ 个细胞的产量，因此在分离骨髓来源单核细胞过程中，可显著减少所需实验小鼠的数量。该操作流程耗时短，且无需使用上述昂贵或复杂的实验技术。在此，我们从小鼠供体的原代骨髓悬液中提取单核细胞，将悬液接种于超低吸附培养板中，并在培养液中添加 20 ng/ml 的 M-CSF。培养至第 5 天时，收集细胞并进行表征分析，以确认其功能特性与表型特征。

在动脉生成研究领域，将这些骨髓来源的单核细胞静脉移植到小鼠体内是一种有效的全身药物递送方法，可与股动脉结扎结合，用于常见的外周动脉疾病模型。

方案

本研究经萨克森州和萨克森-安哈尔特州德累斯顿/哈勒政府主席团批准，并依据德国动物保护法第8条进行（批准号：24D-9168.11-1/2008-24）。

1 细胞分离

1.1 股骨和胫骨的制备

1. 使用封闭容器中汽化的异氟烷（浓度为5%）对小鼠进行麻醉。当小鼠停止活动达3秒后，实施颈椎脱臼处死。
2. 用96%乙醇对后肢进行消毒。使用无菌手术刀去除皮肤和肌肉，并分离骨骼。
   1. 从腹股沟处开始做皮肤切口，沿内踝方向延伸切口，并在小腿下部周围做环形皮肤解剖。通过从远端向近端剥离的方式完全去除腿部皮肤。
   2. 用锋利的手术刀将股四头肌从股骨上分离，去除腓骨前肌群和腓肠肌群，并通过定位和解剖韧带，在髋关节处将下肢离断。
   3. 从前侧开始，小心旋转腿部，环绕关节切断韧带，从而实现关节的离断。
3. 用96%乙醇清洗股骨和胫骨，至少持续90秒，以确保细胞制备过程的无菌性。随后使用无菌PBS继续清洗，以去除残留的乙醇。
   注意：后续所有步骤均需保持无菌操作，避免污染。

1.2 骨髓的采集

1. 使用精细剪刀剪去每根骨骼的近端和远端，以暴露股骨和胫骨干。操作时需格外小心，因为这些骨骼极易断裂。
2. 用预热的培养基（M199 + 10% 胎牛血清（FCS），+ 1% 青霉素/链霉素）冲洗骨骼。使用无菌的28号针头、1 ml 注射器，每根骨骼冲洗时使用10–15 ml培养基。
3. 用精细镊子夹住骨骼，逐根冲洗，直至骨骼变为半透明状。推动注射器活塞时应施加轻柔压力，以尽量减少对细胞的损伤。
4. 将骨髓细胞悬液通过70 µm尼龙滤网过滤，并收集滤液。为最大程度提取骨髓，需从骨骼的远端和近端反复冲洗。
5. 用PBS冲洗滤网，并收集滤液。通过轻柔搅拌和移液，小心去除滤网上的碎片和细胞团块。

1.3 培养

1. 将细胞悬液在室温下以 250 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，并用约 25 ml 培养基重悬细胞。重复一次。
2. 第二次洗涤后，用 6 ml 培养基重悬细胞。取 50 µl 细胞悬液与 50 µl 台盼蓝混合。在光学显微镜下使用计数板对细胞进行计数。使用以下公式计算溶液中的细胞数量：
   
3. 将细胞接种至 6 孔超低吸附表面培养板中，以防止细胞永久性贴壁。每毫升接种浓度为 10⁶ 个细胞，每孔最多加入 6 ml。
4. 在悬液中添加 20 ng/ml M-CSF，以促进细胞分化。
5. 将细胞在 37 °C 和 5% 二氧化碳条件下培养 5 天，并每日观察。

1.4 细胞的收获

注意：这些步骤应在冰上进行。请根据情况选择执行 1.4.1 或 1.4.2。

1. 此时收获整个培养物，包括已分化的巨噬细胞，这些细胞会黏附在培养板上，即使使用的是超低黏附表面的培养板。
   1. 通过轻柔吹打，使用 4 °C 的 PBS 缓冲液（含 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）和 2 mM EDTA）进行解离，收获全部培养物。重复操作直至培养板上无残留的黏附细胞——若不确定，可在显微镜下确认。
2. 或者，通过收集含有悬浮细胞的上清液来弃去黏附的巨噬细胞，此时上清液中主要含有单核细胞。
   1. 使用不含 EDTA 的 PBS 缓冲液（含 0.5% BSA）收集非黏附细胞。操作时力度不宜过大，以避免将轻度黏附的巨噬细胞一并脱离。

1.5 流式细胞分析（可选）

注意：可以使用磁珠分选法（MACS）去除细胞悬液中的CD117⁺干细胞和祖细胞。该操作请遵循制造商提供的操作流程。

1. 根据步骤 1.4.1 或 1.4.2 收集细胞。
2. 在 4 °C 条件下以 250 × g 离心 10 分钟，收集细胞，并重复此步骤一次。
3. 每种探针至少将 250,000 个细胞重悬于 300 µl FACS 缓冲液中。
4. 将细胞悬液转移至 96 孔板（每孔 30 µl）。
5. 在 4 °C 条件下以 250 × g 将细胞悬液离心 5 分钟。
6. 弃去上清液，向每孔中加入 25 µl 抗体（使用厂家推荐的稀释比例）。
7. 使用抗体对细胞进行染色（在完成步骤 1.5.1–1.5.6 后，按照厂家说明书进行细胞表型分析）。常用于单核细胞/巨噬细胞鉴定的标记物包括 CD11b、F4/80（图 3）、CD115（图 2）和 Gr-1。
   注意：关于细胞悬液的进一步描述，建议使用如 CD4、CD8a、CD11c、CD25、CD45、CD45R、CD62L、CD80、CD86、CD145、CD117、MHCⅡ、Ly6C、Ly6G 和 CD192 等标记物。细胞特征此前已有描述¹²。
8. 在 4 °C 条件下孵育探针 20 分钟。
9. 在 4 °C 条件下以 250 × g 离心探针 5 分钟，并用 200 µl FACS 缓冲液重悬，重复此步骤两次。
10. 将探针转移至 FACS 管中，并进行 FACS 分析¹²。
11. 在第 0、3 和 5 天进行 FACS 分析¹²，以分析细胞分化情况。

2. 尾静脉注射

2.1 准备

1. 将动物置于37 °C的加热板上预热约10分钟。加热过程中需持续观察动物，以识别过热迹象。
2. 用150 µl NaCl重悬在步骤1.1–1.4中分离的单核细胞，并将细胞悬液转移至带有30G针头的1 ml胰岛素注射器中。注射前轻轻涡旋混匀，以确保所有单核细胞均被注入。操作过程中细胞始终置于冰上，避免因温度升高导致单核细胞黏附和活化。

2.2 固定

1. 在选择小鼠进行静脉注射时，避免干扰笼内其他小鼠。
2. 将小鼠放入固定器中。避免施加过大压力，并小心处理后肢。（图4）
   注意：也可使用全身麻醉，以确保对动物的操作无应激。
3. 在关闭固定器前，确保小鼠有足够的呼吸空间。

2.3 注射

1. 用消毒剂对注射部位进行消毒。将消毒剂喷洒在小鼠尾部，静置至少1分钟。
2. 通过在注射部位上方轻轻按压尾部侧面，以阻断尾静脉血流，从而更清晰地显示静脉。
3. 注射前将尾部旋转90度。（图5）
4. 以45度角注射。注射应缓慢进行，每克体重注射量不超过5 µl，以避免对动物造成伤害。
5. 若出现水疱，表明注射失败，应立即停止操作，并在更靠近近端的位置重新注射。
6. 在注射部位施加轻柔压力约1分钟，以止血。
7. 操作结束后，打开固定器，将小鼠放回笼中。
8. 观察小鼠20分钟，确保其未因注射受到伤害且保持胸骨卧位。延长观察时间直至小鼠恢复足够的意识水平。只有在小鼠完全恢复后，方可将其与其他动物放在一起。

结果

从小鼠骨髓中提取的细胞悬液包含多种细胞类型。主要细胞类型为淋巴细胞、粒细胞和单核细胞。可通过细胞大小和颗粒度对细胞类型进行估计，图1展示了原始悬液以及分化培养5天后收获细胞的相应结果。注意培养过程中细胞组成的动态变化。然而，对细胞群体进行准确分类必须依赖于细胞表面标志物的特异性表达。

用于鉴定单核吞噬细胞系统（MPS）细胞的最重要标志物是CD115，其作为M-CSF受体，特异性表达于单核细胞前体、单核细胞和巨噬细胞。因此，CD115可能不适用于区分不同的MPS亚群，但可可靠地评估向单核/巨噬细胞分化方向发育的细胞绝对数量。有关CD115在分化过程中表达的时间线，请参见图2。

成熟标志物 F4/80 可用于区分幼稚单核细胞、成熟单核细胞和巨噬细胞。与不表达该标志物的幼稚单核细胞前体相比，巨噬细胞表现出强烈的 F4/80 表达，而成熟单核细胞则表现为中等水平的 F4/80 表达。因此，联合使用 CD115 和 F4/80 标志物是一种可行的方法，可用于定量和监测细...

讨论

我们介绍一种简单且经济高效的方法，可从骨髓中分离出大量小鼠单核细胞。与其他使用外周血的方法相比，该方法获得的单核细胞产量更高：传统方法的单核细胞产量⁵为1.4 × 10⁶，而本方法可从单只供体小鼠获得11 × 10⁶ ± 3 × 10⁶个单核细胞。

在考虑该方法的挑战时，必须指出在非无菌条件下操作可能带来的污染风险。如果冲洗及后续洗涤步骤未正确执行，很可能导致细菌和真菌污染。此外，骨髓包含由粒细胞、淋巴细胞和红系细胞组成的异质性细胞悬液。通常情况下，由于缺乏生长因子，这些细胞在培养的第2至第3天会逐渐消失。在生长因子诱导分化后，巨噬细胞成为主要的污染来源。为了降低巨噬细胞的数量并尽量减少单核细胞向巨噬细胞的分化，使用超低吸附培养板以及上述的洗涤步骤至关重要。

很难找到一种仅特异性表达于单核细胞的标志物。由于不同标志物之间存在干扰，因此需要同时使用多种标志物，且在分析细胞悬液时，细胞的粒度和大小存在变异性。图1-3

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6孔超低吸附培养板	康宁公司，纽约，美国		6孔超低吸附培养板，带盖，无菌
8至12周龄雄性BALB/c小鼠	Charles River，德国苏尔茨菲尔德
96孔板	Greiner bio one有限公司，德国弗里肯豪森
蓝色死细胞染料	德国达姆施塔特 Life technologies GmbH
牛血清白蛋白	GE Healthcare，德国弗赖堡		V组分，pH 7.0
导管	B. Braun，美尔松根股份公司，德国美尔松根		28G，30G
CD115	eBioscience，美国加利福尼亚州圣地亚哥	12-1152
CD11b	eBioscience，美国加利福尼亚州圣地亚哥	53-0112
细胞培养皿	Greiner Bio-One GmbH，德国弗里肯豪森		盖上盖子，灭菌
离心	贝克曼库尔特有限公司，克雷费尔德，德国		阿莱格拉® X-15R 离心机
脱毛膏	维特，曼海姆，德国
消毒剂	Schülke&Mayr GmbH，德国诺德施泰特		Kodan Tinktur forte
一次性手术刀10号	Feather安全剃刀有限公司，大阪，日本
EDTA	Sigma Aldrich，德国汉堡
乙醇 96%	Otto Fischar GmbH und Co KG，萨尔布吕肯ü肯岑，德国
Pipetus 提取装置	Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG，埃伯施塔特，德国
F4/80	AbD Serotec, Dü德国杜塞尔多夫	MCA497APC
FACS 缓冲液	由本课题组利用单一组分制备而成		PBS，0.5% BSA，0.1% NaN3
FACS 仪器	美国新泽西州富兰克林莱克，贝克顿·迪金森公司		BD FACS Canto II
FACS 管	Becton, Dickinson and Company，美国新泽西州弗兰克林湖
Falcon® 移液器	美国纽约贝克顿·迪金森实验器材公司
胎牛血清	Sigma Aldrich，德国汉堡
精细镊子	鲁比斯，斯塔比奥，瑞士
手套	Rösner-Matby Meditrade GmbH，德国基弗斯费尔登
Gr1	eBioscience，美国加利福尼亚州圣地亚哥	53-5931
加热板	Labotect GmbH, Gö德国哥廷根		加热板 062
培养箱	Ewald Innovationstechnik GmbH，德国巴特嫩多夫		Incu safe
异氟烷	Baxter Deutschland GmbH，Unterschleißheimß德国海姆
光学显微镜	卡尔·蔡司 SMT 有限公司，奥伯科亨，德国		Axiovert 40 °C
巨噬细胞集落刺激因子	Sigma Aldrich，德国汉堡	SRP3110
机械振荡器	IKA，德国施陶芬		ms2 微型振荡器
Medium 199	PAA实验室有限公司，奥地利帕兴		37℃预热 °使用前将水浴锅预热至 C
微量离心管	Eppendorf AG，德国汉堡
微生物操作台	Thermo Electron，LED GmbH，德国兰根塞尔博德		Hera 安全
单核细胞洗涤缓冲液	由本课题组利用单一组分制备而成		PBS、0.5% BSA、2 mM EDTA
小鼠固定器	各种
NaCl	Berlin Chemie AG，德国柏林
NaN3 （乙酸钠）	Sigma Aldrich，德国汉堡
血细胞计数板	Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Kö尼格斯霍芬，德国
尼龙细胞筛	美国新泽西州富兰克林莱克斯，贝克顿·迪金森公司		细胞滤网，70 µm 网孔尺寸
青霉素/链霉素	Sigma Aldrich，德国汉堡
磷酸盐缓冲液	德国达姆施塔特 Life technologies GmbH		pH 7.4，无菌
移液器	Eppendorf AG，德国汉堡		10µ升/100µl/200µl/1,000µl
移液头	Eppendorf AG，德国汉堡
血清移液管	Greiner Bio-One GmbH，德国弗里肯豪森		Cellstar 5 ml，10 ml
负压吸引装置	Integra bioscience，Fernwald，德国		Vacusafe comfort
手术剪	Word Precision Instruments, Inc.，美国萨拉索塔
注射器	B. Braun，美尔松根股份公司，德国美尔松根		1 ml Omnifix® - 1 mL 胰岛素注射器
带盖试管	德国弗里肯豪森，Greiner bio one 公司		15 ml/50 ml Cellstar 管
温水浴	Julabo Labortechnik GmbH，Seelbach，德国		Julabo SW22