用于研究出生后神经发生的器官型脑片培养

摘要

本文介绍了一种利用脑片组织培养技术研究海马体出生后神经发生的实验方法。该方法可实现 体外 成年神经发生调控及向培养的海马体直接施加药理学试剂。

摘要

本文介绍了一种利用脑片器官型培养技术研究啮齿类动物脑内海马区出生后神经发生的实验方法。该方法在保持海马结构典型拓扑形态的同时，允许将药理学试剂直接施加于发育中的海马齿状回。此外，脑片培养可维持长达4周，从而便于研究新生颗粒神经元的成熟过程。该技术能够高效地对海马脑片进行药理学干预，同时避免了与海马深部解剖位置相关的不确定性以及血脑屏障等复杂变量的影响。基于上述优势，我们致力于优化适用于出生后神经发生研究的器官型脑片培养体系。

引言

成年哺乳动物海马体中的神经发生是大脑固有适应性和可塑性能力的一个显著例证。齿状回颗粒细胞（DGCs）由海马齿状回中可再生的神经前体细胞池产生，而齿状回是目前哺乳动物大脑中两个已被充分表征的神经发生区域之一，被认为在学习与记忆过程中具有重要作用。海马体属于边缘系统，位于哺乳动物大脑深部，这使其成为精确药理干预的困难靶区。此外，异常神经发生已被认为与癫痫、精神分裂症和阿尔茨海默病等疾病相关，因而促使研究者关注各种药理学因子对新生神经元成熟与存活过程的影响。出生后神经发生与成年神经发生之间的界限并不明确，先前研究表明，许多特征在两者之间存在连续性。 体内 出生后早期与成年期的神经元发育相似²⁵本文重点阐述出生后的神经发生，并探讨其在成年神经发生中的潜在应用。

器官型脑片培养提供了一种高效的方法 体外 研究哺乳动物海马体多种生理特性的方法。由啮齿类动物脑组织制备的脑片培养具有以下三个主要优势：1）实验方案简单，仅需常规易得的材料；2）脑片培养可用于药理学研究，避免了海马体深部解剖位置带来的复杂变量，并绕过了血脑屏障¹；3）海马体及其三突触回路的结构特征保持完好²先前的研究人员已利用海马区器官型培养物来研究突触的发育与生理学^3,4，胶质发生^5-7缺血性脑损伤^8,9神经保护与神经修复^10-12 以及癫痫^13-15切片培养还可作为一种有效的模型系统，用于在结合绿色荧光蛋白（GFP）或其他活体标记物标记细胞的同时，监测细胞的发育过程。

脑片培养也已被用于研究出生后海马区的神经发生^16-19，但这些研究中的一个重要因素是，将成年动物的组织移植出来后约2周，会出现特征明确的退行性变化 体外^20,21因此，脑片培养通常采用出生后早期（P5-P10）的小鼠或大鼠幼鼠制备，以利用早期出生后脑组织在培养中更高的存活能力。²²尽管先前的研究表明，出生后早期与成年期的海马在突触生理学及特定神经元亚型的表达方面存在差异^23,24新生齿状回颗粒细胞在成熟过程中所经历的程序化发育进程具有高度保守性²⁵此外，最近的研究表明，培养中新生颗粒细胞的生理特性与急性海马脑片制备中的未成熟神经元非常相似。¹⁶.

方案

注意：所有动物实验均符合多伦多大学比较医学部的动物健康与福利指南。

1. 海马切片的制备

1. 使用干热高压灭菌器在 125 °C 下对以下器械进行灭菌：手术刀柄（#3）（2 把）、标准型大号镊子（1 把）、小型解剖剪（侧向弯曲）（1 把）、微型勺（一端为勺形，另一端为平头刮刀）（1 把）、微型刮匙（圆头和圆锥形尖头）（2 把）、精细毛刷（1 把）、火焰抛光的巴斯德吸管（2 支）、纱布块（2 英寸 × 2 英寸）（5 块）。
2. 灭菌完成后，将器械放入无菌容器中，并保持覆盖状态直至使用。在解剖操作前立即用 70% 乙醇溶液浸泡器械。
3. 在开始解剖操作前，准备含培养插件的 6 孔板，每孔加入 1 ml 培养基，并将培养板置于 35 °C、5% CO₂ 的培养箱中保存。

2. 在无菌超净工作台中摆放解剖工具

1. 用70%乙醇喷洒超净工作台，并将灭菌的解剖器械从酒精中取出。将器械放置在无菌培养皿上晾干，以避免酒精与解剖得到的脑组织接触。
2. 在两个大型无菌培养皿中各加入5–7 ml灭菌的冰冻解剖液。其中一个培养皿用于冷却和清洗头部（污染区），另一个用于冷却和冲洗挖出的脑组织（洁净区）。将一张灭菌滤纸放入其中一个培养皿的皿盖内，用于脑组织的解剖操作。
3. 在其中一个小型培养皿的皿盖内放置一小片灭菌滤纸，用于海马体的解剖。在两个小型无菌培养皿中各加入3–5 ml灭菌的冰冻解剖液。其中一个培养皿用于盛放挖出的海马体，另一个用于在解剖显微镜下分离海马体切片时放置组织片段。
4. 通过将一片灭菌滤纸固定在切片机的切割台上并安装无菌刀片来准备组织切片机。用灭菌的解剖液润湿滤纸。
5. 用酒精喷洒干净的生物废弃物袋，并将其放入超净台内。

3. 海马体解剖

1. 在超净工作台外用70%乙醇喷洒P7龄Sprague Dawley幼鼠，随后在超净工作台内使用大型无菌手术剪迅速断头，将头部落入培养皿中冰冷的解剖液内。
2. 在培养皿中，冲洗掉血液，迅速将头部转移到无菌滤纸上，腹面朝下。
3. 使用解剖刀沿矢状面在背侧表面切开，暴露下方的颅骨。切开皮肤，但不要切穿下方的骨骼，因为此年龄段大鼠的颅骨较软且易于穿透。将这把已污染的解剖刀放置一旁，不得用于脑组织操作。
4. 使用小型解剖剪（侧向倾斜）和镊子，沿颅骨的矢状缝剪开颅骨至前囟点（bregma），即冠状缝与矢状缝垂直相交的解剖学位置。用镊子将颅骨瓣向上并从中线向外侧掀开。
5. 将微型勺置于脑干下方的脑底部，轻轻抬起脑组织以将其从颅骨中取出。抬起脑组织以暴露基底部的视神经和嗅球。用小剪刀剪断这些结构，使脑组织完全脱离颅骨。取出完整脑组织并转移至另一盛有冰冻解剖液的大培养皿中。
6. 使用微型勺子将脑组织转移至含有无菌滤纸的小培养皿盖中。用无菌巴斯德吸管滴加数滴解剖液冲洗脑组织，以保持组织湿润。
7. 使用洁净的手术刀片将两个半球分开。用微型勺将左侧半球转移回大培养皿中，并将半球的软脑膜面朝下放置于冰冷的解剖液中，以备后续使用。
8. 观察右半球的内侧面，辨认穹窿缘，即沿海马内侧缘走行的一条明显的白质带。使用无菌手术刀，通过穹窿作矢状切口，但需小心操作，因为刀尖仅需深入0.5 cm即可切断穹窿。
9. 使用两把微型解剖铲，用右手铲置于脑干处，左手铲抬起覆盖的皮层，从而分离右侧半球的第一个海马体。轻轻抬起皮层以暴露侧脑室及海马体的内侧表面。此时应可见一条白色弯曲的结构，即穹窿（fimbria）。
10. 将刮匙的曲率与伞部的曲率对齐，轻柔地将刮匙置于伞部下方。向左滑动刮匙，沿头尾轴方向移动，然后将刮匙向背侧抬起，以移除海马体。
11. 将海马体转移至一个 2^nd 将小培养皿置于冰上，加入冰冷的解剖液。对左侧半球重复相同操作，以分离左侧海马体。
12. 使用微型刮勺，小心地将海马体转移至组织切片机的切片台上。将它们彼此相邻且相互平行地排列，并与切片刀的轴线垂直。用画笔调整组织位置，并在海马体上方滴加少量解剖液。
13. 将组织切成400 μm厚的切片，期间无需暂停以移除单个切片（通常切片不会粘附在刀片上）。整个海马体切完后，用画笔轻轻将切片转移至2^nd 盛有解剖液的小型培养皿
14. 在解剖显微镜下，使用微型刮铲和画笔小心分离漂浮的切片。
15. 从培养箱中取出预先准备好的带培养插件的培养板，放入超净工作台中。
16. 使用火焰抛光的巴斯德移液管吸取4-5个切片，转移至培养插件膜的顶端表面。随后用画笔调整切片位置，使各切片之间以及切片与培养插件边缘之间留有间隙。
17. 使用无菌巴斯德吸管，从膜的顶端表面移除多余的解剖液。
    注意：移除溶液时，避免将组织切片吸入移液枪头内。 alternatively，可使用普通移液器（P200 或 P1000）配合灭菌的移液枪头，缓慢移除溶液。
18. 将含有血清的培养基和海马脑片放回培养箱中，在35 °C、5% CO₂条件下继续培养₂.
    注意：若实验需要从多只动物中制备培养物，在每次解剖之间应彻底清洁超净工作台。将手术器械放回酒精溶液中，并在进行第二次解剖前更换所有培养皿、滤纸和无菌刀片。

4. 器官型脑片的喂养与维持

1. 在无菌的层流洁净工作台中进行培养操作。
2. 在组织切片培养后的第2天进行首次换液。使用灭菌的玻璃移液管吸除旧的培养基。
3. 使用无菌的5 ml血清移液管向孔中加入1 ml新鲜、无菌、含血清的培养基。
4. 轻柔地放回培养插件，并注意去除膜表面下方可能形成的气泡。
5. 首次换液后，每隔一天更换一次培养基。

5. 使用胸苷类似物孵育组织切片以标记新生神经元

1. 为了研究海马齿状回颗粒细胞的成熟与整合，需将脑片组织切片与一种胸腺嘧啶类似物（如5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）或5-氯-2'-脱氧尿苷（CldU））共同孵育。本实验采用CldU，因其在生理盐水中具有更高的溶解度。
2. 在培养3天后（3DIV），向1 ml培养基中加入1 μl浓度为10 mg/ml的CldU储备液（溶于生理盐水），使终浓度达到10 μg/ml。若使用BrdU，应根据其分子量差异调整相应浓度。将含CldU的培养基加入培养孔中，于35 °C条件下孵育组织2小时。
3. 在35 °C孵育2小时后，移除含CldU的培养基，并更换为常规喂养培养基，恢复正常的喂养程序（如上所述）。

6. 组织固定与保存

1. 在开始培养实验之前，制定一个用于施加处理和固定组织样本的时间表 (图 2B)。
2. 在预定的解剖后时间点，于实验室通风橱内准备好以下物品：一个盛有磷酸盐缓冲液（PBS）中含 4% 多聚甲醛（PFA）的 10–50 ml 烧杯；一个用于丢弃培养基的空烧杯；小镊子；以及带一次性吸头的 1,000 µl 移液器。
3. 将培养板从培养箱中取出并转移至通风橱内。用镊子轻轻倾斜各个培养小室的插件，然后使用移液器吸除培养基，并转移至废液烧杯中。将培养板倾斜一定角度，以确保完全去除所有培养基。
4. 每次完成一个培养板的培养基去除后，向每个培养孔中加入 1 ml 的 4% PFA，并用封口膜密封孔板。根据需要重复此步骤处理多个培养板，并将板转移至 4 °C 冰箱中固定 24 小时。
5. 24 小时后，在通风橱内准备好以下物品：一个盛有含 0.1% 叠氮化钠（Sodium Azide）PBS 溶液的 10–50 ml 烧杯；一个用于丢弃 PFA 的空烧杯（处理有毒物质时需遵循安全规范）；小镊子；以及带一次性吸头的 1,000 µl 移液器。
6. 按照步骤 6.4 中所述的 PFA 添加流程操作，但改为向每个孔中加入 1 ml 含叠氮化钠的 PBS。待完全转移后，用封口膜包裹孔板边缘进行密封，并储存于 4 °C 冰箱中以备后续使用。

7. 免疫组织化学组织切片

1. 使用振动切片机进行组织切片。以下一系列步骤有助于从器官型培养物中获得尽可能多的可用组织切片。
   注意：在海马体解剖并接种切片后，组织厚度约为 400 μm。然而，在培养箱中培养 2-3 周后，组织切片会逐渐变平，最终切片厚度为 150-300 μm。
2. 准备以下物品用于切取培养组织：#11 手术刀片及刀柄、盛有冰冻 PBS 的玻璃培养皿、显微解剖镊子，以及用于固定组织的洁净振动切片机切割台。
3. 使用手术刀沿圆形插件膜的边缘小心切割，使其从塑料插件外壳上分离。操作时需在培养切片与手术刀之间保留足够的空间。
4. 将分离的插件膜转移至含有 PBS 的培养皿中。用 PBS 冲洗后，使用镊子将膜转移至振动切片机的安装台上。
5. 接着，使用手术刀去除培养切片周围多余的膜材料，并修整边缘，使其整齐。此步骤可确保膜平整，便于牢固贴附于切割表面。
6. 在振动切片机切割台上滴加 1-2 滴粘合剂，并使用 22 G 针头将其均匀涂抹成一层薄膜。将粘合剂涂成矩形，其长边应与振动切片机的切割刀片平行。此操作应迅速完成，以防止粘合剂过快干燥。
7. 使用镊子将修整好的含海马切片的膜转移至切割台，轻轻将其置于粘合剂上，并确保无气泡产生。
8. 当速干胶固化时，将粘附有膜的振动切片机台重新转移回盛有 PBS 的培养皿中。同时准备振动切片机刀片和一个含有叠氮化钠的 48 孔板，用于储存组织切片。
9. 使用振动切片机将器官型培养切片切成 30 μm 厚的切片，并转移至含有叠氮化钠的 48 孔板中，以供后续免疫组织化学染色使用。
10. 有关免疫组织化学染色，请参考已有的实验方案^26,29。

结果

确定类器官培养是否适用于成年神经发生研究需满足两个主要标准：1）脑片在培养10至21天后仍能保持海马脑片的典型形态学特征 体外 （体外培养天数，DIV），以及 2）可利用成体神经发生研究中常用的标准化免疫组织化学技术对新生齿状回颗粒细胞（DGCs）进行定量。关于第一个标准， 图1A 和 1B 突出显示保存完好的海马体形态。齿状回（DG）、CA1 和 CA3 区域等特征结构清晰可辨。

关于第二个标准，图1C（上图）展示了新生颗粒细胞（DGCs）共表达内源性神经元标志物绿色双皮质素（Doublecortin, DCX）和外源性胸苷类似物红色5-氯-2′-脱氧尿苷（CldU）的代表性样本。这些神经元位于海马齿状回的颗粒下层。为确保神经元出生时间的准确标记，我们鉴定同时表达CldU和DCX的细胞核。此阶段需使用共聚焦显微镜，以成功识别双标记神经元，因为候选细胞必须在整个细胞Z轴方向上共表达目标标志物。通过此类双标记实验获得的样本数据显示，在CldU标记后12天，约17%的...

讨论

在给予CldU（或BrdU）后，可根据特定的发育时间窗选择药理学试剂的作用时间线，以靶向新生的齿状回颗粒细胞（DGCs）。例如，可在CldU注射后的第二周施加一种假设的试剂，该时期被认为与GABA具有去极化作用的未成熟神经元所处的发育阶段相对应。未来使用该方案的研究可根据具体的实验问题，调整所用的药理学试剂及其暴露时间窗，从而“定制”适合特定研究目的的方法。

确定脑片培养是研究出生后神经发生的有效模型的一个重要标准，是能够在海马区染色并定量新生神经元。支持这一假设的两个主要发现是：显微镜分析显示，同一神经元中存在CldU与内源性蛋白标志物的免疫组织化学反应性。当与内源性神经元标志物联合使用时，胸苷类似物（如BrdU和CldU）是神经发生研究的有力工具。

通过腹腔注射胸腺嘧啶类似物（如 BrdU）是神经发生研究中常用的标记处于有丝分裂 S 期神经元的方法²⁹。类似的方法也可经适当修改后应用于器官型培养。例如，先前的研究在约 14 天体外培养（DIV）后，向脑片培养物中添加 BrdU（0.5 μM，持续 3 ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-氯-2'-脱氧尿苷（CldU）	MP Biomedicals	105478	有害，致癌
细胞培养插件，30 mm 直径，0.4 µm 孔径	Thermo scientific	140660	这些插件上的Nuclon delta涂层可提高组织黏附性，并改善切片质量。
锥形离心管（无菌）	Fisher Scientific	14-432-22
解剖剪刀（侧向倾斜）	Fine Science Tools	14082-09
最低必需培养基（MEM）	Gibco	11095；液体	4 °C 保存
Eclipse Ni-U 荧光显微镜	Nikon
组织用胶水	Krazy Glue	KG585	使用尽可能少的胶水以实现黏附，任何接触胶水的组织将无法用于免疫组化（IHC）。
Hank’s 平衡盐溶液（HBSS）（500 ml）	Gibco	14025-092	4 °C 保存
马血清（热灭活，500 ml）	Gibco	16050-122	分装为50 ml等份，-20 °C 保存
吸水纸（Kimwipes）	Kimberly-Clarke	TW 31KYPBX
改良玻璃移液管（移除巴斯德移液管底部，并用本生灯火焰打磨边缘）
培养皿（100 mm × 15 mm）和（60 mm × 15 mm）	Fisher Brand	FB0875712 和 FB0875713A
手术刀片 #11	Fine Science Tools	10011-00
手术刀柄 #3	Fine Science Tools	10003-12
血清移液管	Sorfa Medical Plastic Co.	P8050
标准齿纹镊	Fine Science Tools	11000-12
无菌真空滤器	Thermo-Scientific	565-0020
手术剪刀	Fine Science Tools	14054-13
注射器驱动滤器单元	Millipore-Millex	SLGP033RS
带可移动平台的组织切片机	Stoelting	51425
细头画笔