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方法文章

组织工程血管移植物植入手术技术及后续处理 体内 监测

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DOI：

10.3791/52354

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2015年4月3日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology & Bio-Physics, State University of New York Buffalo School of Medicine, 2Department of Pediatrics, State University of New York Buffalo School of Medicine, 3Department of Chemical and Biological Engineering, State University of New York Buffalo School of Engineering

本文内容

摘要

使用端对端吻合及实时数字评估技术在绵羊颈动脉中植入组织工程血管的逐步操作方案 体内 直至动物安乐处死。

摘要

组织工程血管（TEV）的发展得益于能够常规且有效地将TEV（直径为4-5 mm）植入大型动物模型。本文描述了一种逐步进行TEV移植以及对TEV和自体颈动脉进行实时数字化评估的操作方案。体内监测通过在手术时植入血流探头、导管和超声晶体（可记录植入的TEV及自体颈动脉的动态直径变化）来实现。一旦完成植入，研究人员即可计算动脉血流模式、有创血压和动脉直径，从而获得脉搏波速度、增强指数、脉压和顺应性等参数。整个实验过程中，数据采集均通过单一计算机程序完成分析。这些宝贵的数据为TEV基质重塑、其与自体/假手术对照组的相似性以及TEV在体内的整体性能提供了深入见解。

引言

组织工程血管（TEV）研发的主要目标是在缺乏自体血管的情况下提供一种替代自体移植物的方案，并减少供体部位的并发症。例如，在美国，每年进行的冠状动脉旁路移植手术已超过35万例，而理想的移植物来源仍是左内乳动脉、左前降支冠状动脉以及大隐静脉1。由于许多患有血管疾病的患者可能不具备适合用于自体移植的动脉或静脉，因此TEV的开发几十年来一直是研究的热点领域1-6。尽管新型TEV的工程化与优化已取得诸多进展，但关于植入TEV所采用的外科技术的报道却未受到同等关注。相反，TEV在动物模型中植入的具体操作方案在很大程度上仍由各研究团队自行决定。

以下手稿展示了如何通过端对端吻合的方法植入组织工程血管（TEV）。该手术方法通过采用特定的吻合缝合模式、稳定缝合技术、优化纵向张力以及添加in vivo监测仪器进行了优化。本方法还与以往使用的多种变异技术进行了对比。此外，该操作流程描述了如何在术后至取出移植物之前，获取动脉血压、TEV直径/顺应性以及TEV内血流速度等参数。这些数据的采集为TEV在重塑过程中的分析提供了不可或缺的信息。

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方案

注意：本方案已获得纽约州立大学布法罗分校动物护理与使用委员会的批准。

1. 术前准备

  1. 选用绵羊（多赛特杂交种，雌性，约1-3岁，体重40-60 kg）进行以下研究。术前3天开始口服环孢素A（200 mg/天）、阿司匹林（975 mg/天）和华法林（20-30 mg/天），并在所有研究期间持续给药。
  2. 确保绵羊在手术前禁食12小时（正常饲料为1.8 kg干草和0.4 kg谷物）。
  3. 使用蒸汽高压灭菌器在121 °C、15 psi条件下对所有外科器械灭菌30分钟。
  4. 手术前48小时将以下物品放入含对苯二甲醛的干燥器中：4 mm多普勒血流探头、1 mm超声晶体、留置动脉导管、延长管和42英寸Tygon管。
    注：手术及灭菌所需相关医疗器械列表见表1。在此步骤中预先将器械置入Tygon管中，有助于节省手术时间。
    1. 如适用，将探头、导管和晶体的每一端标记为左侧和右侧。

2. 手术操作

  1. 通过静脉注射（IV）给予地西泮（0.5 mg/kg）和氯胺酮（4 mg/kg）诱导绵羊麻醉。或者，可使用静脉注射替拉唑（Telazol）（4 mg/kg）。
    1. 使用内径为8.5–10.0 mm的带套囊气管导管进行经口插管7。
    2. 通过重复呼吸回路连接潮气量呼吸机（7–10 ml/kg）或压力调节呼吸机（15–20 cm H2O）给予吸入性 麻醉。使用精密挥发器输送异氟烷或七氟烷，初始浓度为3%–4%，以达到中至深度外科麻醉阶段。绵羊的最低肺泡有效浓度分别为1.4%或1.9%8。
    3. 通过观察对刺激的运动反应、眼睑反射、眼球位置和心率评估麻醉深度。使用脉搏血氧仪监测血氧饱和度（95%–100%），使用二氧化碳监测仪监测呼出气体中的CO2浓度（45–55 mmHg），并在手术过程中使用自动温控加热毯维持体温（38.5–39.5 °C）。
  2. 使用标准电推剪配备#40刀头，剃除绵羊整个颈部及一条头静脉区域的羊毛。使用70%异丙醇和7.5%聚维酮碘擦洗液浸润的纱布对两个部位的皮肤进行术前准备。先用酒精纱布擦拭以去除皮肤油脂，随后交替使用聚维酮碘纱布和酒精纱布三次。
  3. 将绵羊仰卧位放置于手术台上，并置于加热毯上方。插入一根中等尺寸的口胃管，以便被动排出胃内容物。伸展绵羊颈部，并根据需要使用支撑垫以维持其位置。
    1. 术前最后进行一次无菌擦洗，使用7.5%聚维酮碘浸润的纱布，静置5分钟后开始手术。
  4. 通过头静脉置入的套管针以10 ml/kg/hr的速度输注静脉液体（乳酸林格液或0.9%生理盐水）。术中给予抗生素和镇痛药：普鲁卡因青霉素G 6,600 U/kg 肌内注射（IM），庆大霉素 1.6 mg/kg IM，以及布托啡诺 0.005–0.01 mg IV 或 IM。
  5. 使用电凝设备沿颈部腹侧中线做一条约12 cm的纵向切口。采用钝性分离技术去除结缔组织，分离左右颈总动脉（约6 cm）。结扎并电凝从颈总动脉分支出的小血管，以减少出血。
  6. 通过一名非无菌手术护士协助，将所有导线和管道（血流探头、超声晶体导线和导管管路）埋入皮下层，以维持无菌环境。使用钝头套管针穿行，从颈背外侧预先准备好的切口处穿出。
    1. 在无菌手术单下方伸手，转动绵羊头部，使颈部侧面可在手术单下清晰可见。
    2. 使用8 cm弯止血钳，在颈部腹侧中线切口与颈部侧面之间皮下组织中穿行。反复开合止血钳，钝性分离出一条约1.5 cm宽的隧道。止血钳尖端应位于头部与肩部之间中点，约在右耳或左耳后方10 cm处。旋转止血钳，使其尖端朝向浅表皮肤。
    3. 在无菌手术单下方，使用无菌#11刀片在止血钳尖端位置的皮肤上做一条1.5 cm长的切口。观察止血钳尖端，确认其清晰穿出皮肤。
    4. 将包含所有导线和管路的Tygon管经皮下隧道穿出。将导线和管路保持在无菌手术单上方。
    5. 在手术单下伸手取出颈部外层的Tygon管，暴露从绵羊颈部引出的植入导线。逐根拉出各线路，以尽量减少皮下空间内的松弛。保留足够长度，以便将仪器正确连接至动脉。
  7. 在两侧颈总动脉上放置4 mm多普勒血流探头，并获取初始读数（图1）。在夹闭动脉前30分钟，静脉注射肝素100 U/kg。
  8. 持续以100 U/kg/hr的速度输注肝素，直至手术结束。使用无创伤性血管夹夹闭颈总动脉，并切除一段血管（长约4 cm）。对侧颈动脉血流速率将增加50%–100%，以维持脑部血流。
    注：可通过切除比替换段更短的血管段和/或使用血管夹拉伸原生血管以缩短间隙，从而通过原生血管的回缩限制纵向拉伸，直至完成全部吻合操作。这有助于减少单个固定缝线和植入移植物上的张力。
  9. 使用7-0普理灵（Proline）乙塔洛双针单股缝线，采用间断单纯缝合法将组织工程血管（TEV）固定到位。如有必要，可局部应用血管平滑肌松弛剂，如罂粟碱（15 mg/ml）或尼卡地平（1.25 mg/ml），以防止原生血管发生血管收缩，从而避免影响吻合缝合。
    注：开始缝合时，缝线间距约为1 mm。此间距可能因病例而异。组织工程血管的组成和厚度会影响缝线之间的有效距离。当原生组织或TEV厚度减小时，可能需要将缝线间距缩小。
    1. 在近端和远端两端各放置两对相对的缝线，将TEV的四个点锚定于原生动脉上（图2-Di）。使用止血钳拉紧每根锚定缝线。
      注：本文中“近端”和“远端”的描述均以血流方向为参考。
    2. 在近端和远端的浅表侧各加5–6针间断缝线，开始吻合（图2-Pr）。同时将血管夹旋转180度。
    3. 重新拉紧锚定缝线，在TEV旋转后的侧面上，于近端和远端各加5–6针间断缝线。
  10. TEV牢固缝合后，将其旋转回原始位置，并逐一移除血管夹，先移除远端夹。吻合部位轻微出血较为常见，可能在夹闭释放后数分钟内自然停止，或需重新夹闭，或需追加缝合。将多普勒血流探头（图3-Fl）重新放置于TEV上游的原生动脉上，监测血流速率。
    注：预计左右颈总动脉的血流速率在约15分钟后趋于平衡。若植入TEV的颈动脉血流速率持续下降，可能提示TEV发生血栓形成。其他血流异常可能与TEV近端或远端原生动脉的狭窄有关。若发生此类情况，可追加使用血管平滑肌松弛剂，且在覆盖移植物部位组织缝合后30–60分钟内，原生血管应恢复至基础张力状态。
    1. 如需设置假手术对照，可切除对侧颈总动脉并重新缝合原位（“假手术”对照）。此操作比仅保留右侧颈动脉并仅连接血流探头、超声晶体和导管更具临床相关性。若需设置假手术对照，应在继续步骤2.11前完成此操作。
  11. 使用7-0普理灵缝线将1 mm超声晶体（图3-cr1 cr2）缝合至TEV相对两侧。将缝线穿过超声晶体头部，仅缝合至TEV的浅表层。
  12. 使用带有特氟龙编织套管的改良18 G导管对动脉进行插管（图3-Ca & 图4A）。将导管置于TEV远端的原生动脉组织上。
    1. 使用5/0 Ethibond缝线将套管固定于动脉壁，以控制出血。使用环己酮将已用生理盐水冲洗过的微孔管路粘附至导管，作为延长管使用。
    2. 使用20 G鲁尔短接头配合Surflo注射塞，封闭外露管路末端（图4B）。为维持导管通畅，应获取管路的预充体积，并每隔2–3天用10 ml生理盐水冲洗，随后注入5,000 U/ml肝素钠注射液。
  13. 记录血流探头与超声晶体之间的距离，以及血流探头与导管之间的距离。这些数据将与软件结合，用于计算脉搏波速度。若无需此类计算，则无需植入导管。
  14. 如需，可在术中获取读数，以确认所有植入硬件功能正常（见第3节）。
  15. 使用2/0丝线和圆锥形针头将植入的导线和管路固定于邻近肌肉组织（图3）。
    1. 将血管血流探头导线平行于血管放置，探头位于尾侧，导线向头侧延伸，随后向侧方肌肉组织做“U型转弯”。使用2-0丝线和圆锥形针头在两个位置将导线固定于邻近肌肉组织，确保导线或血流探头不会对血管造成牵拉。缝合应紧密但避免过紧，以免压迫或绞窄肌肉组织（图3）。
    2. 将晶体导线和动脉导管管路缝合至侧方肌肉组织，预留约1.5 cm松弛度，方法与固定血流探头类似（图3）。
    3. 将所有导线和管路归拢，并在经皮下隧道引出前，将其锚定于肌肉组织，方法与前述步骤相同。
  16. 使用2-0薇乔缝线逐层缝合手术切口，筋膜和皮下组织采用连续缝合，皮肤采用连续水平褥式缝合（筋膜使用圆针，皮肤使用角针）。使用2/0薇乔缝线和角针缝合颈部背侧1.5 cm的切口，该切口用于引出外露导线和管路。
  17. 将血流探头导线、导管管路和超声晶体导线放入一个10 cm × 10 cm的袋状物中，并将该袋牢固缝合于绵羊皮肤上（图5 — 恢复后）。
  18. 逐步减少麻醉和潮气量呼吸机支持，待自主呼吸恢复后拔除气管插管。拔除头静脉内的套管针，必要时进行包扎。
  19. 在切口处涂抹三重抗生素软膏，覆盖Telfa敷料，再用弹性卷状纱布和Elasticon绷带包扎颈部。
  20. 术后给予镇痛治疗：恢复期间肌内注射一次氟尼辛葡甲胺（2.2 mg/kg），随后每日一次（1.1 mg/kg）连续两天；布托啡诺每日两次（0.005–0.01 mg IV 或 IM），持续一天。

3. 体内 监测

  1. 将绵羊放入移动式推车中以确保适当固定。这可以使绵羊保持安静且意识清醒，同时不损坏植入硬件。在获取仪器记录数据前，可能需要让绵羊提前适应推车2至3次，每次30分钟。
  2. 从颈部 pouch 中取出所有导线和管路，并连接至监测设备。将流量探头连接至流量计，1 mm 超声晶体连接至 TRB-USB 盒，导管管路连接至压力传感器。本实验装置的流程图见（图6）。
  3. 在数据采集前校准流量探头和压力传感器。
    注意：由于软件版本可能存在差异，以及所用设备不同，校准参数和设置会因情况而异。
  4. 根据制造商的操作规程，使用示波器精细调节 Sonometrics 晶体测量信号。
  5. 使用计算机软件记录数据（图7）。图7 上半部分白色轨迹对应植入TEV的信号，下半部分红色轨迹对应假手术组/原生血管（Sham/Native）的信号。 对于TEV组和假手术组，均实时记录血流速率（ml/min）、动脉血压（mm Hg）和血管直径（mm）。
  6. 在无干扰条件下至少连续记录1分钟。导出该数据以进行更详细的分析。记录完成后，断开所有导线并放回缝合于绵羊颈部的pouch中。

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结果

已有超过30只绵羊接受了本报告中描述的组织工程血管（TEV）植入手术技术（已接受发表）9。在表2中总结了经过方案优化后最近开展的绵羊手术情况。所有绵羊在TEV植入后均顺利恢复，未出现危及生命的并发症。在部分动物中，观察到留置动脉导管尖端附近的自体动脉出现纤维化。尚未观察到因增加器械使用而导致炎症反应显著加重的情况。极少数情况下（18根导管中1根），导管导致TEV内血流受阻，该例阻塞发生于术后一个月。导管相关的轻微并发症包括动脉信号衰减和无法抽吸血液。在TEV研发研究中通常最常关注的数据包括通畅率、血流速率和血管顺应性。本方案表明，在整个实验过程中均可获取此类重要数据。尽管本报告重点在于获取血流速率、血管直径和动脉压数据，但仍可进一步计算顺应性、增强指数及脉搏波传导速度。

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讨论

本报告旨在提供一种可靠且可重复的操作流程，用于将感兴趣的组织工程血管（TEV）植入绵羊颈动脉。本模型所用动物的天然颈动脉厚度为0.5–0.75 mm，外径为4.5–5 mm。本文所述的外科手术技术已成功应用于植入不同几何尺寸的TEV，其厚度为0.25–1 mm，外径为4–5 mm，长度为4 cm，且在长达3个月（预定实验终点）的时间内均表现出良好的效果。该手术技术的应用使得数据采集更加简便且结果更为一致。

此外，能够实时测量参数的 体内 已有文献描述了重塑过程。在此模型中，可根据所需的不匹配程度、植入的组织工程血管（TEV）设计以及植入持续时间，成功使用不同直径的材料；此外，植入时间可延长至一年或更久。

该实验方案优化过程中最重要的进展之一，是采用间断缝合技术进行端对端吻合。本报告所采用的当前TEV设计在初期曾使用连续缝合技术进行端对端吻合，但导致较高的失败率（n=3）。其确切原因尚不明确，但可能与连续缝合在吻合部位造成的轻微狭窄或顺应性降低有关。在探索优化手术方法的过程中发现，文献中既往报道的手术技术描述较...

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披露

无任何披露事项需要报告。

致谢

本研究由美国国家心肺研究所（R01 HL086582）和纽约干细胞科学基金（NYSTEM，合同号 C024316）资助，受助人为 S.T.A. 和 D.D.S。JoVE 视频中使用的插图由纽约州立大学布法罗分校医学插画师 John Nyquist 完成。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
压力传感器Becton DickinsonP23XL-1数量：1个以上（每条动脉使用1个）。
与充水隔膜圆顶配合使用。
放大器和换能器箱Gould5900 信号调节器笼数量：1。
笼内应包含两个换能器和放大器。尽管此特定型号可能已停产，但其他具有BNC/模拟输出的市售压力换能器仍可与Sonometrics设备通信。
T403 控制台配 TS420 血管周围流量计模块（x2）Transonic SystemsT403 模块和 TS420（x2）数量：1。
测量每侧颈动脉血流的流量探头将连接至各 TS420 单元。
数字超声测量仪SonometricsTR-USB数量：1
Flow Probe Precision S系列 4 毫米Transonic Systems Inc.MC4PSS-LS-WC100-CM4B-GA数量：2
1 毫米 Sonometrics 晶体Sonometrics 系统1R-38S-20-NC-SH数量：2-4个（每条动脉2个）
用于植入的导管BD（Becton Dickinson） 381447数量：1个以上（每条动脉使用1个）
导管被剪断并固定至微孔管，使用导丝进行插入。
Tygon 微孔管Norton Performance Plastics(AAQ04127) S-54-HL 配方裁剪至延长装置所需的长度
鲁尔接头短接管BD（Becton Dickinson）427564（20 号）数量：1个以上（每根动脉导管各需1个）
Surflo 注射塞TerumoSR-IP2数量：1个以上（每根动脉导管各需1个）
Meadox聚四氟乙烯（特氟龙）毛毡19306裁剪至所需尺寸。
我们研究中使用的PTFE毛毡已停产。然而，类似公司如 “外科补片” 提供等效产品。

参考文献

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